Name: Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer een betrouwbare methode om het voedingsgedrag van Hydra te kwantificeren met behulp van glutathion-stimulatie. Deze eenvoudige assay meet de tentakelspreiding en helpt onderzoekers het zenuwstelsel en chemische sensatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen K. P. Madhu, Nita Beliappa en het personeel van het Media Centrum van het Indian Institute of Science Education and Research, Pune bedanken voor hun hulp bij de productie van de video. Het werk werd ondersteund door financiering onder het Centre of Excellence programma van het Department of Biotechnology, Government of India aan SG en een postdoctorale beurs door het Department of Science and Technology, Government of India aan RK.

1. Hydra Cultuur en waardering van de Feeding Response <ol><li> Handhaaf hydra poliepen in kweek door ze dagelijks met artemia en bewaar ze in een medium (1 mM Tris-HCl buffer, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0,1 mM KCl en 0,1 mM MgSO4) in een glazen schaal bij 18 ° C onder 12 uur licht 12 uur donker cycli zoals eerder 12 beschreven. </li><li> Voor het meten van de voedingsreactie transfer een volwassen hydra poliep met 5-6 tentakels een enkel putje van een 24-wells plaat. Verwijder de resten van het medium uit de put door het kantelen van het, en dan meteen voeg 500 ul van vers medium. </li><li> Bereid 9 uM glutathion oplossing in hydra medium. Aangezien de glutathion oplossing is gevoelig voor oxidatie, gebruik altijd vers bereide glutathion oplossing voor elk experiment. </li><li> Breng de plaat aan de imaging platform van een microscoop met voorzieningen voor het opnemen van beelden. Gebruik een donkere achtergrond zodanig dat het gedrag of hydra poliep kan duidelijk worden afgebeeld tegen de contrasterende achtergrond. </li><li> De ruimte wordt gebruikt voor het observeren en beeldvorming van het gedrag van de hydra vrij van lichten van wisselende intensiteit, luchtstromen en lawaai. Dergelijke verstoringen kunnen ook leiden tot de hydra poliep contractie van de tentakels tonen - zelfs bij afwezigheid van glutathion. </li><li> Laat de poliep te ontspannen voor 5 min. </li><li> Zorg ervoor dat de poliep is gelegen langs het centrale gebied van de bron, zodat de werking duidelijk kan worden afgebeeld. Als de poliep is aan de rand van de put, brengen naar het centrum van spoelen het medium met een pipet en opnieuw laat het ontspannen. </li><li> Maak een foto van Hydra in de ontspannen toestand. Dit zal de zero-tijdstip observatie zijn. </li><li> Voeg snel 9 uM glutathion oplossing tot een eindconcentratie van 3 uM bereiken in de put. Afhankelijk van het doel van het experiment en de respons getoond door hydra, test een reeks van verschillende concentraties van glutathion en choose de juiste concentratie vereist. </li><li> Start de timer onmiddellijk na het toevoegen van glutathion oplossing en foto&#39;s maken na elke 15-30 sec voor 4-5 min. Laat de vergroting instellingen niet aanpassen tijdens de time-lapse imaging veranderen. </li><li> Voeg de glutathion oplossing voorzichtig en uniforme stroming zodat de positie van het dier in de put minimaal zou worden verstoord in het gezichtsveld van de microscoop. Echter, als de poliep beweegt uitgebreid na het toevoegen van glutathion oplossing om de plaat heel voorzichtig om de poliep in het gezichtsveld voor het vastleggen van beelden te brengen. </li><li> In het controle-experiment gebruikt medium zonder glutathion terwijl alle andere parameters gelijk. </li><li> Zorg ervoor dat al het bovenstaande experimentele stappen uit te voeren tijdens de eerste helft van de dag - voor 13:00 naar de mogelijke invloed van de circadiane ritme van de mate van het voeden reactie te voorkomen. </li><li> Open elk van de gemaakte foto&#39;s met behulp van de GNU Image Manipulation Program (GIMP). </li&gt; <li> Gebruik de &quot;Measure&quot; tool die beschikbaar zijn vanaf Menu&gt; Extra&gt; Meet de afstand tussen de apicale einde van elk van de tentakels en hypostoom bepalen. Indien de mondopening waargenomen in elk van de beelden, bepalen de afstand tussen het middelpunt van de geopende mond en het apicale uiteinde van de tentakel. Raadpleeg deze afstand als de tentakel spread. </li><li> Bereken de gemiddelde tentakel verspreid voor elke poliep vóór en na blootstelling glutathion. Bereken de verhouding van gemiddelde tentakel spread op nul tijdstip dat bij elk van de volgende tijdstippen. Deze verhouding zal worden genoemd relatieve tentakel spread. </li><li> Herhaal metingen minimaal 20 poliepen. </li></ol><img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400" /> <img alt="Vergelijking 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450" /> 2. Methode Validatie met behulp van deVerhongering Model <ol><li> Voor honger, overdragen enkele hydra poliepen om een ​​aparte glazen kom en laat ze niet te voeden gedurende 5 dagen. Voer de controle groep van een paar poliepen dagelijks met artemia in een vergelijkbare omvang kom. Verander het medium van zowel experimentele kommen dagelijks om schimmelgroei in het medium te voorkomen. </li><li> Op de dag van het experiment, voeden de controlegroep van hydra met Artemia 1 uur en deze gebruiken hydra de volgende experimenten na verwijderen van alle niet opgegeten en dode Artemia van het medium. </li><li> Meet de voedingsreactie van de uitgehongerde hydra ten opzichte van de hydra van controlegroep door de eerder in stap 1 beschreven Om vertekening te voorkomen toegepast gezien waarnemingstijd, wisselen de metingen van elk van de uitgehongerd en controle hydra poliepen. </li></ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
<li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nematocyst%3A+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li>
<li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li>
<li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+%28Cnidaria%2C+Hydrozoa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiology%22%5BJournal%5D)">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+NMDA+receptors+in+Hydra%3A+a+biochemical+and+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li>
<li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allatotropin%3A+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li>
<li>Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Glutathione+in+the+Nervous+System%22">Glutathione in the Nervous System</a>. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).</li>
<li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li>
<li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li>
<li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan%2C+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li>
<li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li>
<li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li>
<li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li>
<li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li>
<li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li>
<li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li>
<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Voedingsgedrag in hydra is een van de meest voorouderlijke chemosensory systemen in de Metazoa. Hoewel de aanwezigheid van GSH in de schaaldieren vloeistof vrijgelaten na-nematocyst bijgestaan ​​hun prooi vangen werd lang geleden ontdekt 1, hebben noch de GSHR eiwit, noch de vermeende coderende gen / s gekarakteriseerd van hydra-to-date. Weinig pogingen gedaan om karakteriseren GSH bindingseiwitten hydra 8, 14, 15. De identiteit van deze vermeende receptor eiwitten blijft onduidelijk en weinig ande...

Hydra is het meest primitieve organisme dat een zenuwstelsel en chemosensatie bezit om gereduceerd glutathion (GSH) te detecteren voor het vangen van de prooi1. Het voedt zich met een verscheidenheid aan dieren zoals nematoden, schaaldieren, insectenlarven, kikkervisjes en pas uitgekomen vissen1. De beweging van deze prooidieren veroorzaakt een mechanosensorische ontlading van de prikblaasjes, genaamd nematocysten, uit de hydra, die in de prooi worden geïnjecteerd2. GSH dat aanwezig is in de vloeistof die vrijkomt uit de gewonde prooi activeert vervolgens de voedingsreactie in de hydra, die het krullen van de tentakels om de prooi naar de mond te brengen, het openen van de mond en het daaropvolgende verzwelgen van de prooi omvat. Meerdere moleculen, zoals dopamine3, glutamaat4, GABA, glycine5, NMDA-receptoren6 en allatotropine7, zijn aangetoond betrokken te zijn bij de voedingsreactie in de hydra. Er is ook aangetoond dat de chemosensorische reactie geïnduceerd door GSH wordt gemoduleerd door de voedingsstatus van het dier, zodat uitgehongerde hydra een verbeterde voedingsreactie vertoont1. Een dergelijke toename in de gevoeligheid voor GSH is biologisch relevant omdat hydra onder honger zijn prooi met een hogere gevoeligheid moet vinden.
Hoewel de voedingsreactie geïnduceerd door GSH duidelijk onder de microscoop kan worden waargenomen, zijn de methoden die gewoonlijk worden gebruikt voor het meten van de waarnemingen van de voedingsreactie niet-kwantitatief. In de meeste gevallen werd de tijd gedurende welke de mond van de hydra open bleef, genomen als een maatstaf voor de voedingsreactie8,9; terwijl in een ander geval, de kwantificering was gebaseerd op het aantal hydra uit een populatie dat de voedingsreactie vertoonde10. Het observeren van de tijd van mondopening van de hydra poliepen is echter lastig en onderhevig aan variatie veroorzaakt door onbeheersbare parameters zoals de richting van de mondoriëntatie tijdens waarnemingen. Evenzo zijn populatiegebaseerde benaderingen, aangezien de voedingsreactie een kwantitatief parameter is, onderhevig aan variaties/fouten veroorzaakt door de mening of observationele vooringenomenheid van de individuele waarnemer. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een methode ontwikkeld voor de relatieve kwantificering van de voedingsreactie in hydra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) op basis van de afstand van het apicale uiteinde van de tentakel vanaf de mond van de hydra poliep.

<table><tbody><tr><td>Gekoelde Incubator</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Camera voor de microscoop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Gereduceerd glutathion</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Bewaar op 4 &deg;C. Breng de fles naar kamertemperatuur voor het openen om oxidatie te voorkomen</td></tr><tr><td>Beeldbewerkingsprogramma</td><td>GIMP</td><td>Versie 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

meten-glutathion geïnduceerde feeding response in hydra

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra behoort tot de meest primitieve organismen met een zenuwstelsel en chemosensatie voor het detecteren van gereduceerd glutathion (GSH) voor het vangen van prooien. De beweging van prooidieren veroorzaakt een mechanosensorische ontlading van de brandende cellen, nematocysten genaamd, van de hydra, die in het prooi worden ingebracht. De voedingsrespons bij hydra, die het krullen van de tentakels om de prooi naar de mond te brengen, het openen van de mond en het vervolgens inslikken van de prooi omvat, wordt geactiveerd door GSH dat aanwezig is in de vloeistof die vrijkomt van het gewonde prooi. Om het moleculaire mechanisme van de voedingsrespons bij hydra, dat tot op heden onbekend is, te kunnen identificeren, is het noodzakelijk een test op te zetten om de voedingsrespons te meten. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor de kwantificering van de voedingsrespons waarbij de afstand tussen het apicale uiteinde van de tentakel en de mond van de hydra wordt gemeten en de verhouding van die afstand vóór en na de toevoeging van GSH wordt bepaald. De verhouding, de relatieve tentakelspreiding genaamd, bleek een maatstaf voor de voedingsrespons te geven. Deze test werd gevalideerd met behulp van een hongermodel waarin uitgehongerde hydra een verbeterde voedingsrespons vertonen in vergelijking met dagelijks gevoede hydra.

Glutathion veroorzaakt hydra tot krullen van de tentakels vertonen op de bek ten behoeve van overspoelt de prooi. Dergelijke curling tentakels brengt apicale uiteinden van de tentakels dichter bij de hypostoom. Dit resulteert in afname van de tentakel spread of de lineaire afstand tussen apicale uiteinde van de tentakel en hypostoom (figuur 1). De relatieve tentakel spread of de verhouding van gemiddelde tentakel voor verspreiden en na het toevoegen van glutathion, gemiddeld over meerdere poliepen vermi...

Hier beschrijven we een eenvoudige test voor de kwantificering van de voedingsrespons in hydra geïnduceerd door de gereduceerde vorm van glutathion. Deze test berust op het meten van de afstand tussen het apicale uiteinde van de tentakel en de mond van de hydra.

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In deze video beschrijven we een methode om het voedingsgedrag bij Hydra te meten. Als reactie op een verminderde vorm van glutathion voedt Hydra zich met een verscheidenheid aan dieren, nematoden, crusta en pas uitgekomen vissen. Op de buitenste laag van dit tweecellige dier bevinden zich gespecialiseerde cellen, genaamd nematocysten.Nematocysten hebben triggers die, wanneer geactiveerd door de beweging van prooi in de omringende vloeistof, de afgifte van de slingerdraden veroorzaken. De prikkeldraden worden in de prooi geïnjecteerd. De gewonde prooi geeft glut glucose vrij.Ion hydro heeft een chemo-sensatie voor het detecteren van glutathion in de omringende vloeistof. Dit veroorzaakt een voedingsgedrag dat zijn zenuwstelsel betrokken. Het voedingsgedrag in Hydra omvat het krullen van de tentakels om de prooi naar de hyperscoopopening van de mond te brengen en het verzwelgen van de prooi.In feite veroorzaakt het toevoegen van glut ion aan de omgeving de voedingsreactie in hydra, zelfs in afwezigheid van prooi. Om de interactie van chemo-sensatie en zenuwstelsel te begrijpen, moeten we het gedrag kwantificeren en nauwkeurige en betrouwbare metingen creëren. In enkele eerdere rapporten wordt de tijd waarin de mond hydro open blijft genomen als een maatstaf voor de voedingsreactie, maar het observeren van de duur van het openen van de mond in de hydro-polypen is vervelend en onderhevig aan variatie veroorzaakt door oncontroleerbare parameters zoals de oriëntatie van de mond vanwege observaties.Een andere methode voor kwantificering van het gedrag is gebaseerd op het aantal hydra in een populatie dat de voedingsreactie vertoont. Omdat de voedingsreactie echter een individueel kwantitatief parameter is, zijn de op populatie gebaseerde benaderingen subjectieve variaties veroorzaakt door de mening van de individuele waarnemer. De belangrijkste voordelen van de alternatieve methode die we hier beschrijven, zijn dat deze zeer eenvoudig uit te voeren is en zeer reproduceerbaar is.Houd hydra bij 18 graden Celsius onder 12 uur licht. 12 uur donkere cycli in een medium in een glazen kom en voer ze dagelijks met emia voor het meten van de voedingsreactie. Breng een volwassen hydro-polyp over naar een putje van een 24-putjesplaat, verwijder resterend medium uit de putje met behulp van een draaipunt.Dit wordt vergemakkelijkt door de plaat te kantelen, gooi het overtollige medium weg en voeg dan onmiddellijk 500 microliter vers medium toe. Bereiding van glutathionoplossing. Een negen micromolare oplossing van glutathion wordt bereid met behulp van hydro-medium. Onthoud dat glutathionoplossing gevoelig is voor oxidatie, dus gebruik altijd vers bereide glutathionoplossing.Voor elk experiment brengt u de plaat over naar het beeldplatform van een microscoop. Gebruik een donkere achtergrond met de mogelijkheid van beeldopname, zodat het gedrag van de hydro-polyp duidelijk kan worden geïmager tegen de contrasterende achtergrond. Zorg ervoor dat de polyp zich langs het centrale deel van de putje bevindt en leg een beeld vast van hydra in de ontspannen toestand.Dit zal een observatie zijn op nultijdstip. Voeg snel negen micromolare glutathionoplossing toe om een ​​uiteindelijke concentratie van drie micromolar in de, putje te bereiken. Start de timer onmiddellijk na het toevoegen van glutathionoplossing en maak beelden na elke 15 of 30 seconden gedurende vier tot vijf minuten vast zonder de vergrotingsinstellingen te wijzigen.Voor metingen gebruiken we gim versie twee, gim. Een GNU Image Manipulation-programma is een software die gratis van internet kan worden gedownload. Open elk van de vastgelegde afbeeldingen in gim.Dit programma heeft een meettool beschikbaar vanuit menu-tools. Meet de afstand tussen hypers, stoma, de apicale uiteinden van elk van de tentakels kunnen met deze tool worden gemeten. Deze afstand wordt tentakelspreiding genoemd.Bereken de gemiddelde tentakelspreiding voor elke polyp voor en na glutathion. Bereken de verhouding van gemiddelde tentakelspreiding bij nultijd. Opmerking bij elk van de volgende tijdstippen.Laten we dit de relatieve tentakelspreiding noemen. Voer dergelijke metingen uit voor minimaal 20 Polyps voor honger. Breng een paar hydro-polypen over naar een afzonderlijke glazen kom en voer ze vijf dagen lang niet, voer de controle-polypen dagelijks met artia op de dag van het experiment. Voer de controlegroep van Hydra met artia gedurende één R en gebruik deze hydra voor de volgende experimenten. Meet de voedingsreactie van de uitgehongerde hydra in vergelijking met de hydra uit de controlegroep volgens de eerder in deze video beschreven methode om enige vooringenomenheid als gevolg van tijd van alternatief te vermijden, de metingen van elk van de uitgehongerde en gecontroleerde hydro-polypen.Glutathion zorgt ervoor dat hydra de tentakels naar de mond krult. Dit krullen brengt de apicale uiteinden van de tentakels dichter bij de hypo-storm. Dit resulteert in de vermindering van de lineaire afstand tussen de apicale uiteinden van de tentakel en hyperstorm of tentakelspreiding.Bekend is dat honger de door glutathion geïnduceerde voedingsreactie versterkt. De tentakelspreiding één minuut na het toevoegen van glutathion was significant lager voor de staffgroep in vergelijking met de verzadigingsgroep. Alle dieren gebruiken chemo-sensatie om voedsel te detecteren.Hydra gebruikt een chemisch signaal in de vorm van glutathion dat vrijkomt uit de gewonde prooi, heeft een eenvoudig zenuwstelsel zonder enige hersen-achtige structuur, dus het moleculaire mechanisme van chemo-sensatie en zijn voedingsafhankelijke modulatie zijn waarschijnlijk ook eenvoudig. Het begrijpen van dit mechanisme kan licht werpen op de evolutie van een regeling van voeding bij hogere dieren. Er zijn echter tot op heden geen receptoren gerapporteerd in Haida die glutathion kunnen binden of enige andere componenten van de downstream-signaleringskaskade.Farmacologische remmers van veel voorkomende chemo-zintuiglijke signaalroutes en het gebruik van geavanceerde moleculaire biologische technieken om de expressie van dergelijke signaalproteïnen en glutathionreceptoren te veranderen, kunnen krachtige hulpmiddelen zijn voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme van voeding. In Hydra is echter een betro

measuring-glutathione-induced-feeding-response-in-hydra

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a method to assess the neurotoxic effects of nanoparticles using microglia. It outlines the steps for activating microglia with nanoparticles, filtering conditioned media to isolate microglia-derived pro-inflammatory cytokines, and testing hypothalamic neuron toxicity with the conditioned media.

Determining Nanoparticle-Induced Toxicity in Neurons Using Microglia as a Surrogate Biosensor

Dit artikel laat zien hoe u glutamine dynamiek in levende cellen met behulp van FRET. Genetisch gecodeerde sensoren mogelijk real-time monitoring van biologische moleculen op een subcellulaire resolutie. Experimenteel ontwerp, technische specificaties van de experimentele instellingen, en overwegingen voor post-experimentele analyses voor genetisch gecodeerd glutamine sensoren worden besproken.

Glutamine Flux Imaging Met behulp van genetisch gecodeerde Sensoren

Door een dubbele behandeling met colchicine kan een plantaardige toxine die delende cellen doodt, zenuwvrije Hydra vulgaris gegenereerd worden. Deze Hydra kunnen niet op zichzelf voeden of opkomen. Dit artikel beschrijft een verbeterde methode voor langdurig onderhoud van zenuwvrije Hydra vulgaris in het laboratorium.

Generatie en langdurig onderhoud van zenuwvrije<em&gt; Hydra</em

Kwantitatieve voedselinname testen met geverfd voedsel bieden een robuuste en high-throughput betekent om voeding motivatie. De voedsel consumptie-bepaling te combineren met thermogenetic en optogenetic schermen is een krachtige aanpak van de onderzoeken van de neurale circuits die ten grondslag liggen aan de eetlust in volwassen Drosophila melanogaster.

Het combineren van kwantitatieve voedselinname-Assays en onder dwang activeren neuronen om te bestuderen van eetlust in Drosophila

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.

Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Kwantificering van zowel geoxideerde als gereduceerde vormen van glutathion (respectievelijk GSSG en GSH) is bereikt door het gebruik van orthoftalaldehyde (OPA). OPA wordt sterk fluorescerend zodra het is geconjugeerd met GSH, maar kan GSSG niet conjugeren totdat het is verminderd. Hier beschrijven we een multiparametrische test om beide te kwantificeren met behulp van eiwitkwantificering voor normalisatie.

Snelle kwantificering van geoxideerde en gereduceerde vormen van glutathion met behulp van orthoftalaldehyde in gekweekte zoogdiercellen in vitro

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Met behulp van timelapse-beeldvorming kan het volledige regeneratieproces van Hydra-sferoïden worden gevolgd. Dit protocol beschrijft de generatie  van Hydra-sferoïden, bespreekt verschillende montagestrategieën en beschrijft hoe langdurige, live beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van spinning disk confocale microscopie en lichtbladfluorescentiemicroscopie.

Voorbereiding en live beeldvorming van regenererende hydra-sferoïden

Leer een betrouwbare methode om het voedingsgedrag van Hydra te kwantificeren met behulp van glutathion-stimulatie. Deze eenvoudige assay meet de tentakelspreiding en helpt onderzoekers het zenuwstelsel en chemische sensatie te bestuderen.

Meten-Glutathion geïnduceerde Feeding Response in Hydra

Meer video's verkennen