Name: Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer hoe u lentivirus produceert om oligodendrociet-voorloper cellen selectief te transduceren voor in vitro myelinisatie-onderzoek. Deze methode maakt eiwitoverexpressie mogelijk in OPC's.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 aan JX, project grant #628761 aan SM en APP1058647 aan JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 aan JX), het University of Melbourne Research Grant Support Scheme en Melbourne Research CI Fellowship aan JX, evenals Australia Postgraduate Scholarships aan HP en AF. We willen graag het Operational Infrastructure Scheme van het Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia bedanken.

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot dit onderzoek.

Myelinisatie van axonen is een essentieel proces voor de optimale werking van zowel het centrale als perifere zenuwstelsel van vertebraten. De opwekking en instandhouding van gemyeliniseerde axonen is een complex en gecoördineerd proces waarbij moleculaire interacties tussen neuronale, gliale (van Schwann-cellen en oligodendrocyten) en extracellulaire matrixeiwitten. De betekenis en toepasbaarheid van dit protocol is dat het manipulatie van eiwitten in een specifiek celtype in de gemengde co-kweek instellingen. Als meer...

Myelinisatie van axonen is cruciaal voor de snelle en efficiënte overdracht van actiepotentialen in zowel het centrale en perifere zenuwstelsel. Gespecialiseerde cellen, Schwann cellen in het perifere zenuwstelsel en oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel, wikkel rond en ensheathe axonen in myeline, effectief te isoleren van de zenuw en het faciliteren saltatorische geleiding 1. Het proces van myelinisatie kan worden bestudeerd in vitro met retinale ganglion neuronen 2, ontworpen nanovezels 3 of dorsale wortel ganglion neuronen samen gekweekt met ofwel Schwann-cellen 4 of oligodendrocyten 5-7. De in vitro myelinisering test is een gevestigd model voor het bestuderen van het zenuwstelsel myelinisatie en het veel van de fundamentele processen die optreden tijdens myelinisatie in vivo 5-8 repliceert. De test omvat de co-cultuur van gezuiverde populaties van ganglion (DRG) neuronen, met OPC (voor CNS myelinisatie) of Schwann-cellen (voor myelinisatie PNS). Onder bepaalde voorwaarden deze myeliniserende cellen ensheathe DRG axonen in de bestelde, ultra structureel gecontroleerd, multi-lamellaire isolerende plasmamembraan die dezelfde complement van myeline specifieke eiwitten die aanwezig zijn in vivo te uiten. De meest gebruikte cellen bij studeren CNS myelinisatie in vitro co-kweken van DRG neuronen en OPC, die met succes gebruikt volgens welke exogene factoren zoals de neurotrofinen uitoefenen op CNS myelinisatie in vitro 5,6 bestuderen. Exogene factoren zoals groeifactoren of kleine moleculen farmacologische remmers op grote schaal gebruikt om de rol van signaaltransductiewegen in myelinisatie met de DRG-OPC coculture model 7,9 bestuderen. In de gemengde co-kweek instellingen die zowel de neuronen en oligodendrocyten bevatten, formeel mogelijk blijft dat ofwel de groeifactoren of de farmamacological remmers zou hebben uitgeoefend effecten op zowel de DRG neuronen en oligodendrocyten (OL). Dit biedt wel de mogelijkheid om specifiek ontleden de rollen die de eiwitten tot expressie alleen door DRG of oligodendroglia uitoefent op myelinisatie met deze dubbele celsysteem. Ondubbelzinnig bevestigen dat de signaleringsroute in oligodendrogliale direct regelt myelinisatie lentivirale transductie van OPC vóór het zaaien op DRG neuronen voor myelinisatie in vitro assay heeft bewezen een elegante manier om zowel wildtype en mutante eiwitten tot overexpressie brengen, zoals ook als knockdown expressie van constitutief tot expressie gebrachte eiwitten door oligodendrocyten. Zo biedt deze aanpak een laan om specifiek te ondervragen en te manipuleren signaalwegen binnen oligodendrocyten voor het bestuderen van myelinisatie 9,10. In dit artikel rapporteren we methoden die we hebben ontwikkeld om een ​​eiwit van interesse overexpressie selectief in oligodendrocyten via een lentiviraalbenadering voor het bestuderen myelinisatie in vitro. De techniek begint met het genereren van expressie vectoren die het gen van belang, hetzij in een wild type, constitutief actieve of dominant negatieve vorm die vervolgens worden gekloneerd in de vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Deze vector (die het gen van belang), de CMV promotor donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) en de 2K7 lentivector worden gecombineerd in een enzymreactie op een 2K7 vector die CMV promoter, het gen van belang, een produceren interne ribosomale ingangsplaats en GFP (Figuur 1). Deze gateway gekloneerd 2K7 construct in combinatie met de PMD2.G virus envelop en de pBR8.91 virus pakket kan worden gecotransfecteerd in HEK293T cellen lentivirus die vervolgens kan worden gebruikt om OPC transduceren genereren. Eenmaal besmet met het lentivirus de OPCs drukken een hoog niveau van het eiwit van interesse. Deze OPC&#39;s kunnen vervolgens worden gezaaid op DRG-neuron culturen en het effect dat expressiehoge niveaus van het gewenste eiwit uitoefent op myelinisatie kunnen worden uitgelezen. De co-kweken worden beoordeeld voor myeline eiwit expressie door Western blot analyse en gevisualiseerd voor de vorming van gemyeliniseerde axonen segmenten door middel van immunocytochemie.

<table><tbody><tr><td>2K7 lentivector&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Gift van Dr Suter9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Neuronal Supplement</td><td>Stem Cell Technologies&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Human)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (d-Biotin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO fluoresence mounting media</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcium, magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Entry vectors for promoter and gene of interest</td><td></td><td></td><td>Generate as per protocols 1-2</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Zie Stock Solutions</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Zie Stock Solutions</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Zie Stock Solutions</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine- 200 mM (100x) liquid</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus enzyme</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, no Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Mouse &alpha; &beta;III Tubulin&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>Mouse &alpha;MBP (monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na pyruvate&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (mouse)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;450-03</td><td></td></tr><tr><td>O1 antibody - Mouse anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternatief als O1 hybridoma cellen niet beschikbaar zijn</td></tr><tr><td>O1 hybridoma cellen</td><td></td><td></td><td>Geconditioneerd medium met anti-O1 antilichaam te gebruiken voor immunopanning</td></tr><tr><td>O4 antibody - Mouse anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternatief als O4 hybridoma cellen niet beschikbaar zijn</td></tr><tr><td>O4 hybridoma cellen</td><td></td><td></td><td>Geconditioneerd medium met anti-O4 antilichaam te gebruiken voor immunopanning</td></tr><tr><td>Competent cells</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl competent cells</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Papain Suspension</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Gift van Dr Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Human)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet (Complete mini)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td></td><td></td><td>Wordt geleverd met Clonase enzym</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit &alpha; neurofilament</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit &alpha;MBP (polyclonal)</td><td>Millipore

productie en gebruik van lentivirus om selectief transduce primaire oligodendrocyte precursor cellen voor in vitro myelination testen

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is een complex proces dat zowel neuronen en gliacellen myelinevormende omvat, oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) en Schwann-cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS). We gebruiken een in vitro assay myelinisatie, een gevestigd model voor de studie CNS myelinisatie in vitro. Om dit te doen, zijn oligodendrocyt voorloper cellen (OPC&#39;s) toegevoegd aan de gezuiverde primaire knaagdieren dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen te myeliniserende co-culturen te vormen. Om specifiek ondervragen de rollen die specifieke eiwitten door expressie oligodendrocyten uitoefenen op myelinisatie hebben we protocollen selectief transduceren OPC met de lentivirus overexpressie wildtype constitutief actieve of dominant negatieve proteïnen alvorens gezaaid op de DRG neuronen ontwikkeld. Dit stelt ons in staat om specifiek te ondervragen de rollen van deze oligodendrogliale eiwitten bij het reguleren myelinisering. De protocollen kunnen ook bij de studie van ot toegepasthaar celtypen, waardoor een aanpak die selectieve manipulatie van eiwitten met een gewenste cel tot expressie, zoals oligodendrocyten voor de gerichte bestudering van signalering en compensatiemechanismen maakt. Samenvattend combineren de myelinisatie in vitro assay met lentivirale geïnfecteerd OPC levert strategisch instrument voor de analyse van moleculaire mechanismen voor myelinisatie.

De vlag gelabeld extracellulair signaal verwante kinase 1 (Flag-Erk1) construct voor lentivirus productie wordt gecontroleerd door restrictie-enzym digest van de gebruikte constructen, zowel de 2K7 constructen en de verpakking en toebehoren constructen die voor virusproductie (figuur 3) . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg" /> Figuur 3: DNA construct controle. Alle DNA-constructen ...

Hier presenteren we protocollen die een flexibele en strategische basis bieden voor het op een virale manier manipuleren van oligodendrocytenvoorlopercellen om eiwitten van belang overexpressie te laten vertonen met als doel hun rol in oligodendrocyten specifiek te onderzoeken via het in vitro model van centrale zenuwstelsel myelinisatie.

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Het algemene doel van deze procedure is om oligodendrocyte-precursorcellen of OPC's op virale wijze te manipuleren om eiwitten van belang overmatig tot expressie te brengen. Voor de in vitro studie van CNS Myelinisatie, wordt dit bereikt door eerst een lentivirale vector te klonen. De volgende stappen zijn het produceren van het lentivirus en het bepalen van de optimale virale concentratie voor het experiment.Daarna worden de geïsoleerde en gekweekte OPC's getransduceerd met het lentivirus. De laatste stap is het zaaien van de getransduceerde OPC's op gekweekte neuronen die zijn geïsoleerd uit de DRG. Uiteindelijk worden de myeliniserende co-culturen beoordeeld op myeline-eiwitexpressie door middel van western blot-analyse en gevisualiseerd voor de vorming van gemyeliniseerde axonale segmenten door middel van immunokleuring.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals farmacologische hulpmiddelen, is dat de lentivirale aanpak ons toelaat om selectief overmatig tot expressie te brengen van ofwel wild type ofwel mutante eiwitten in onze gewenste celtype, zoals in dit geval, oligodendrocyten. Ter voorbereiding kloneren we de benodigde 2K zeven len vectoren zoals beschreven in het protocol in de ochtend van de dag van transfectie, bereid 32 miljoen HEK 2 93 T cellen in een T 1 75 flacon met 25 milliliters media. Cruciaal is dat deze cellen aan de bodem moeten zitten voordat ze worden getransfecteerd, dus plant ze eerder aan als dat nodig is. In een 50 milliliter Falcon buis, bereid een mastermix voor de T 1 75 flacon transfectie zoals gedetailleerd in tabel één, voeg DNA toe aan warm DMEM, vortex, voeg dan steriel PEI als laatste toe om voortijdige precipitatie te voorkomen.Meng goed door de buis drie of vier keer te kantelen, en incubeer de mix gedurende ongeveer 15 minuten op de werktafel. Ververs het media op de cellen en voeg vervolgens het transfectiemengsel toe. DROPWISE meng het media voorzichtig over de cellen en incubeer de cellen daarna een nacht.De volgende dag. GFP expressie kan worden gecontroleerd door middel van fluorescentiemicroscopie. 48 uur na de transfectie, verzamel de eerste batch virale supernatant en voeg 25 milliliter vers media toe aan de cellen.Centrifugeer de virale supernatant bij 1.140 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de virale supernatant zonder de pellet van cellulaire deeltjes over naar een nieuwe buis en bewaar deze bij vier graden Celsius. De volgende dag, 72 uur na transfectie, verzamel de laatste batch virale supernatant, centrifugeer om de cellulaire deeltjes te verwijderen en verzamel deze met de eerste batch van opgehelderde virale supernatant.Concentreer vervolgens het virus door het virale supernatant bij 170.000 Gs gedurende 90 minuten ultracentrifugeer. Bij vier graden Celsius. Ontlaad de ultracentrifuge en giet het supernatant weg, waarbij een pellet van geprecipiteerd PEI en het virus achterblijft, dat niet zichtbaar is op de bodem van de 30 milliliter buis.Herhaal dit proces. Centrifugeer alle virale supernat in batches in dezelfde 30 milliliter buizen om het virus te concentreren, suspendeer het virus in elke ultracentrifugebuis. Voeg 500 microliters Sato media toe en dek de buis af met film.Vortex de buis gedurende 30 seconden en los het pellet mechanisch op met een pipettip. Herhaal deze vortex losmakingscyclus ongeveer zes keer om ervoor te zorgen dat het pellet volledig is gesuspendeerd in het Sato media. Pool nu al het gesuspendeerde virus in Sato in een verse microbuis.Centrifugeer de gepoolde supernatant kort bij maximale snelheid gedurende één minuut. Om het PEI te pelleteren, verzamel vervolgens het supernatant dat het virus bevat en filter door de oplossing te passeren door een 0,45 micron filter met behulp van een spuit om af te sluiten. Deel het gezuiverde virus in Sedia in 2050 en 100 microliter volumes in en bewaar ze allemaal bij min 80 graden Celsius.Voor dit protocol, heb primaire oligodendrocyte-precursorcellen. OPC's gekweekt in 10 centimeter platen met 10 milliliters sedia die de volgende groeifactoren bevatten, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT drie, en de cellen moeten 24 uur zijn gekweekt onder 8% Koolstofdioxide. Begin met het aspireren van het media en verwijder het volledig.Vervang het vervolgens met 10 milliliters van hetzelfde media met de groeifactoren. Infecteer uw OPC's met lentivirus, dat het eiwit van belang tot expressie brengt, door het vereiste volume virus druppelsgewijs toe te voegen aan het media. Ook in een afzonderlijke OPC-plaat, meng het controle-lentivirus dat alleen GFP tot expressie brengt in het mediacultuur, de cellen gedurende nog eens 48 uur.Verzamel vervolgens de OPC's van de platen voor het zaaien op de gekweekte GRG-neuronen. Spoel eerst elke plaat twee keer met acht milliliters EBSS. Maak een milliliter trypsine EDTA 0,05% met negen milliliters warm EBSS.Voeg vijf milliliters van de verdunde trypsine toe aan elke plaat. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende maximaal twee minuten. Neutraliseer de trypsine door vijf milliliters 30% FBS in EBSS toe te voegen.Gebruik vervolgens een 10 milliliter pipet. Was de OPC's van het plaatoppervlak. Draai de plaat elke keer een kwartslag om alle cellen te verzamelen.Breng de celsuspensie over naar een 15 milliliter buis. Centrifugeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten bij 180 Gs. Aspireer nu het supernatant en suspendeer het celpellet in een milliliter warm saddo media zonder groeifactoren en tel de cellen.Bereid vervolgens de DRG-neuronen die op de 22 millimeter dekglasjes zijn gekweekt, door het media volledig uit hun plaat te aspireren. Zaai vervolgens 200.000 OPC's druppelsgewijs op elk dekglas. Het zaaienvolume mag niet meer zijn dan 200 microliter per dekglas.Laat de cellen zich zetten zonder de plaat te verplaatsen. Na 10 minuten, vul elk putje aan met een milliliter warm s

production-use-lentivirus-to-selectively-transduce-primary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

In dit protocol beschrijven we de productie, zuivering en titratie van lentivirale vectoren. Wij bieden een voorbeeld van lentivirale vector-gemedieerde gen-levering in de eerste gekweekte neuronen en astrocyten. Onze methoden kunnen ook van toepassing op andere...

De productie van lentivirale vectoren voor transduceren Cellen van het centrale zenuwstelsel

The video demonstrates a protocol for differentiating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) into oligodendrocytes and inducing myelination in a co-culture with dorsal root ganglion (DRG) neurons. The OPCs are transduced with lentiviral vectors encoding a signaling protein that regulates myelination. The transduced OPCs are co-cultured with DRG neurons to assess the differentiation into oligodendrocytes and the signaling protein-induced myelination.

An In Vitro Transduction-Induced Myelination Assay for Oligodendrocyte Precursor Cells

Oligodendrocyten zijn de myeliniserende cellen van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en kweken van hun precursoren, oligodendrocyten-voorlopercellen, uit rattencortex, evenals een snelle en betrouwbare kwantitatieve methode om oligodendrogenese in vitro te evalueren als reactie op experimentele factoren.

Voorbereiding van de Rat Oligodendrocyte Progenitor culturen en kwantificering van Oligodendrogenesis gebruik van Dual-infrarood fluorescentie Scanning

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Op basis van in vitro lentivirale engineering van neuronale precursoren, hun co-transplantatie in wild-type hersenen en gepaarde morphometrische evaluatie van "test" en "Control" derivaten, maakt deze methode nauwkeurige modellering van in vivo gencontrole van neocorticale neuron morfologie op een eenvoudige en betaalbare manier.

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

Leer hoe u lentivirus produceert om oligodendrociet-voorloper cellen selectief te transduceren voor in vitro myelinisatie-onderzoek. Deze methode maakt eiwitoverexpressie mogelijk in OPC's.

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen (Video) | JoVE Journal

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

Meer video's verkennen