Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Het algemene doel van deze procedure is om mucosale candidiasis te modelleren met behulp van de jonge zebravis. Dit wordt bereikt door eerst een oplossing met levende albicans in een micronaald te laden. In de tweede stap wordt een gedefinieerd volume van de gistcellen geïnjecteerd in de zwemblaas van een jonge zebravis.

Vervolgens worden de vissen gescreend op een homogeen inoculum en gedurende de gewenste tijd geïncubeerd. In de laatste stap wordt confocale microscopie gebruikt om de dynamische interactie van de ziekteverwekker met het immuunsysteem van de zebravis te volgen. Bovendien kan de zwemblaas worden microdissectie om hogere resolutie confocale beelden te verkrijgen.

De methode die we hier presenteren, beantwoordt belangrijke vragen in de schimmelimmunologie en microbiologie, zoals wat de precieze opeenvolging van gebeurtenissen is die leidt tot een mislukte immuunrespons op de schimmelziekteverwekker en candida-bakens op de mucosale oppervlakken. Voordat u met de procedure begint, verwarmt u een injectiebakje met 2% aros in een incubator van 33 graden Celsius. Gebruik na 30 minuten een 25 milliliter pipet om 100 milliliter van de E drie media plus PTU te verwijderen van een plaat met vier dagen oude, post-fertilisatie zebravissen, zorg ervoor dat u geen van de vissen aanzuigt, en voeg twee milliliter van vier milligram per milliliter toe.

Trica methaansulfonaat voorraad in het media om de dieren te anesthetiseren. Gebruik na 15 minuten een dissectiemicroscoop om de vissen met opgeblazen zwemblaasjes te identificeren en gebruik een plastic overdrachtspipet om 30 zebravissen over te brengen naar de voorverwarmde injectiebak. Verwijder het overtollige media, houd vervolgens de bakje onder een hoek en gebruik een vislijn van 0,012 inch diameter die met superlijm in een borosilicaat capillair is gelijmd om drie lijnen van 10 verticaal uitgelijnde vissen te maken. Elk volgende volledig vermengen van een buis vers bereide zee albicans met een concentratie van 1,5 keer 10 tot de zevende CFU per milliliter.

En laad vervolgens drie microliters van de gistoplossing in de EC-geknipte micronaald. Stel de pulsduur in op de juiste instelling. Draai vervolgens de injectiebak om een hoek van 20 graden tussen de micronaald en het hoofd van de vis te bereiken, gericht op de achterkant van de zwemblaas.

Duwt nu de micronaald in de zwemblaas en zorg ervoor dat de boring van de naald zich in het lumen bevindt en druk op de knop. Het verifiëren welke vissen zijn geïnjecteerd, is relatief eenvoudig, omdat de bolus de luchtbel verplaatst en de achterkant van de zwemblaas vervolgens wordt gevuld met media. Co-injectie van fenolrood met de bolus kan de visualisatie van een succesvolle injectie verder vergemakkelijken. Nadat alle 30 vissen zijn geïnjecteerd, spoelt u de bak met E drie media en legt u de vissen in de herstelbak.

Breng 10 dieren over in een centrifugebuisje van 1,7 milliliter met één milliliter E drie media en euthaniseer de vissen met 200 microliter tric. Vervolgens, voor elk dier, schik vier druppels vacuümvet in een vierkant, een centimeter uit elkaar op een microslide, en voeg twee druppels vers bereid, 2% laag smeltend toe aan het midden van het vierkant. Plaats vervolgens een vis op een aparte glazen plaat onder een dissectiemicroscoop en controleer of het hart van het dier is gestopt met kloppen en verwijder het overtollige water.

Gebruik nu één paar fijne pincetten om het hoofd in een vaste positie te houden en een ander om de voorste darm naar beneden te trekken. Neem de zwemblaas op door de pneumatische ductus, scheid hem van het spijsverteringskanaal en plaats hem in het midden van een van de voorbereide microslides voordat de agarose stolt. Plaats ten slotte een dekglas boven het weefsel en druk voorzichtig naar beneden tot het het vacuümvet en de agarose raakt en beeld de zwemblaas af binnen 10 minuten na het oogsten.

Het injecteren van vier nanoliters zee albicans met een tot 1,5 keer 10 van de zevende. CFU per milliliter geeft de meest consistente gegevens die resulteren in een bereik van 10 tot 50 gistcellen per vis. Het verkleinen van het inoculum tot 15 tot 25 gistcellen geeft een nog nauwere fenotypie en respons.

Neutrofielen spelen een sleutelrol in de resistentie tegen candidiasis bij muizen en mensen, en de infectie van de zebravis zwemblaas met levende albicans leidt tot een snelle en aanhoudende rekrutering van neutrofielen. Dat gebeurt niet wanneer hittedood gistcellen worden geïnjecteerd. Filamenten ontwikkelen zich snel na injectie van de gistcellen, waarbij de filamenteuze groei de eerste 24 uur na injectie voortduurt, waarna dit aantal begint te dalen. Het vermogen om individuele vissen non-invasief te volgen, maakt deze longitudinale studies mogelijk en benadrukt de individuele verschillen in ziekteprogressie en gastheerreacties.

Een experimenteel protocol dat in de muisbeelden onpraktisch blijft, zijn de interacties van immuun- of epitheelcellen met c albicans relatief eenvoudig in het hier gepresenteerde model. Het dissecteren van de zwemblaas zoals zojuist gedemonstreerd, verbetert echter aanzienlijk de kwaliteit van de beeldvorming. Dit is vooral nuttig bij het visualiseren van transgene vislijnen waar de fluorescentie ubiquitair wordt tot uitdrukking gebracht en er buitensporige fluorescentie is in het omringende weefsel zoals waargenomen in deze beelden van een gedissecteerde zwemblaas van de alfa Catine citrine vislijn.

Na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals morfo-technologie of chemische remmingsbehandeling, kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden zoals, wat is de rol van een specifieke immuuncel of signaalroute in mucosale candidiasis.