Name: Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Leer een model voor mucosale candidiasis in larven van Danio rerio via zwemblaasinjectie met Candida albicans. Confocale microscopie maakt real-time beeldvorming van pathogeen-immuuninteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken dr Le Trinh en Dr. Tobin voor royaal verstrekken van de α-catenine: citrien vis lijn en Bill Jackman voor het mogelijk maken om de opnames te doen in zijn lab. De auteurs erkennen de financieringsbronnen National Institutes of Health (Subsidies 5P20RR016463, 8P20GM103423 en R15AI094406) en USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Dit handschrift is gepubliceerd als Hoofd Land- en Bosbouw Experiment Station publicatienummer 3371.

OPMERKING: Alle zebravis zorg protocollen en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH richtlijnen onder Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) protocol A2012-11-03. 1. zebravis Het grootbrengen tot 4 dagen na de bevruchting <ol><li> Verzamel AB zebravis, of andere transgene lijnen binnen de eerste 3 uur na bevruchting, zoals in een video 34. </li><li> Incubeer 120 eieren in een 15 cm platen met 150 ml E3 media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl; 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgCl2, 2 mM HEPES, pH 6,8) met methyleenblauw (0,3 ug / ml uiteindelijke concentratie) in een 33 ° C incubator met 12/12 licht / donker fotoperiode. </li><li> Vervang de media na 6 uur met E3 + PTU (1-fenyl-2-thioureum, 10 ug / ml uiteindelijke concentratie) en verwijder de dode eieren. </li><li> Incubeer gedurende 4 dagen bij 33 ° C, wisselen de media verse E3 + PTU na 2 dagen. </li></ol> 2.projectie Micro-naald Voorbereiding <ol><li> Trek borosilicaat capillaire (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) in een micro-naald met behulp van een naald trekker met de volgende instellingen (550 Hitte; 0 Pull; 130 Velocity; 110 Time). OPMERKING: De instellingen variëren van gloeidraad tot gloeidraad gelijkvormige micro-naalden te verkrijgen (zie figuur 1) en moeten worden aangepast wanneer een nieuwe draad wordt geïnstalleerd. </li><li> Vul een micronaald met 3 ui van 0,4 urn gefiltreerd fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mM KH 2PO 4, pH 7,4) met 20 ul microloader pipet tip. </li><li> Stel de micronaald een micropipet houder op een micromanipulator bevestigd aan een druk injectiesysteem. Stel de injectiedruk 30 PSI en de pulsduur van 30 msec. </li><li> Met behulp van een petrischaal met gedestilleerd water, hoe lager de micro-naald tot 1/5 van de naald in het water. Clip de micro-naald with fijne pincet net onder de waterspiegel. Breng de micro-naald uit het water en duw het pedaal een paar keer tot een bolus verschijnt. </li><li> Meet de diameter van de bolus door het verlagen van de micronaald een hemocytometer gelaagd met een druppel type A immersie olie. Pas de pulsduur om het gewenste volume te verkrijgen (zie tabel 1). </li><li> Stel de tegendruk voor de bolus stabiel in olie te blijven (verlagen van de druk als de bolus verhoogt het volume en het verhogen van de tegendruk als de bolus volume afneemt). Noteer de pulsduur voor elk micro-naald. </li><li> Verwijder de PBS uit de micro-naald door het opzuigen van het gebruik van een microloader pipettip en verdrijven de linker-over PBS door het plaatsen van het terug op de injector en flipping de continue puls schakelaar. Reserveer elk micro-naald. </li></ol> 3. Candida Voorbereiding <ol><li> Streak Candida albicans getransformeerd met-codon-geoptimaliseerde dTomato, GFP, BFP, EOS of FarRed uit een bevroren voorraad (-80 ° C voorraad in 25% glycerol) met een steriele houten deuvel op een gist peptine dextrose (YPD) agarplaat (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 20 g / l dextrose , 20 g / l agar, geautoclaveerd en uitgegoten in 25 ml petrischalen) en incubeer overnacht bij 30 ° C. </li><li> Kies een kolonie met een steriele houten deuvel en beënt met 5 ml YPD vloeibaar (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 20 g / l dextrose, geautoclaveerd en aseptisch aliquotted in 5 ml in 16 x 150 mm glascultuur tubes). </li><li> Incubeer overnacht bij 30 ° C in een roller trommel bij 60 opm. </li><li> Verzamel 1 ml van C. albicans cultuur en overbrengen in een 1,7 ml steriele centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer bij 5000 xg voor een paar sec. Leeg de supernatant en voeg 1 ml steriel PBS, vortex grondig. Herhaal dit twee keer. </li><li> Tel de kolonies met behulp van een hemocytometer door verdunning 1 ml voorraad 1: 1000 in steriele PBS. </li></ol> 4. Het injecteren van zebravis inde zwemblaas <ol><li> Warm een ​​injectie schaal (2% agarose) gedurende 30 min in een 33 ° C incubator. </li><li> Op het gewenste moment, verwijder 100 van de 150 ml E3 + PTU van 15 cm petrischaal met de vis te injecteren met een pipet 25 ml aspireren zonder enige zebravis. </li><li> Verdoven 4 dpf zebravis door toevoeging van 2 ml van een 4 mg / ml gebufferde tricaïne methaansulfonaat voorraad (TR) in de 50 ml resterende media (eindconcentratie 200 pg / ml) en wacht 15 minuten. </li><li> Onder een microscoop ontleden, selecteer vis met een opgeblazen zwemblaas. Vis kan ook worden gescreend op dat moment voor homogene fenotype, zoals neutrofielen distributie in MPO: GFP lijn met behulp van een epifluorescente dissectiemicroscoop. </li><li> Verdun het C. albicans stock van de oorspronkelijke concentratie (stap 3.8) tot 1,5 x 10 7 kolonievormende eenheden per ml (cfu / ml) in PBS. </li><li> Transfer 30 zebravis op de injectie gerecht met behulp van een plastic overdracht pijptte en verwijder de overtollige media. </li><li> Met behulp van een visserij-wire gereedschap (0,012 inch vissen diameter lijn super-gelijmd in een borosilicaat capillair), maken 3 regels van 10 vis, door het vasthouden van de injectie schotel verticaal en oriënteren de vis verticaal. </li><li> Verwijder de overtollige media. </li><li> Grondig vortex de buis met 1,5 x 10 7 kve / ml C. albicans. </li><li> Vul een micro-naald met 3 ul van C. albicans behulp van een nieuwe microloader pipettip en stel de pulsduur op de betreffende instelling (zie stap 2.9). </li><li> Draai de injectie schotel een hoek van 20 ° tussen de micronaald en de kop van de vis te maken, gericht naar de achterkant van de zwemblaas (figuur 3A). </li><li> Duw de micro-naald in de zwemblaas, zorg ervoor dat de boring van de naald in het lumen, en druk eenmaal op het pedaal. </li><li> Herhaal dit voor elke vis en over te dragen aan een herstel gerecht (25 ml E3 + PTU) door overstromingen van de schotel met E3 eend legen van het in het herstel gerecht. </li><li> Breng eens 30 vis aan de injectie schotel. </li><li> Herhaal de injectie met een nieuwe micro-naald gevuld met grondig gewerveld C. albicans. </li><li> Finish door het injecteren van de PBS-controle, indien nodig, met behulp van een andere injectieplaats gerecht om besmetting te voorkomen en over te dragen aan een aparte herstel gerecht (stap 4.10). </li></ol> 5. Screening van de Vis voor Gewenste Inoculum <ol><li> Bereid 40 ml 0,4% laag smeltpunt agarose oplossing (LMA) door toevoeging van 160 mg van laag smeltende agarose 40 ml E3, koken met de magnetron tot opgelost en afkoelen tot 37 ° C. Voeg 400 ul van TR (eindconcentratie 200 pg / ml) eenmaal afgekoeld. </li><li> Na 30 min herstel verdoven de vissen beschreven (stap 4.3 met slechts 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU, eindconcentratie 200 pg / ml). </li><li> Transfer 30 vissen (met zo weinig media mogelijk) 2 ml LMA in een gewichtsverhouding boot. </li><li> Zuig exemplaren met een pipet en de plaat de vis met 1 druppels LMA in een 96-well beeldplaat met alleen de 10 x 6 centrale putjes. </li><li> Herhaal dit totdat alle vissen om het scherm worden geladen om de beeldvorming plaat. </li><li> Laat de media stollen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Plaats de vis op hun kant, zorg ervoor dat ze in contact komen met de glazen bodem. </li><li> Met behulp van de 20X objectief op een omgekeerde epifluorescente / confocale microscoop en de juiste filter, registreren het aantal C. albicans gistcellen in ieders vis zwemblaas. </li><li> Selecteer de vissen 15-25 gistcellen in de zwemblaas (of gewenst inoculum), inslapen niet geselecteerde vis (800 ug / ml TR in E3) en terug geselecteerde vis een diepe petrischaal met 50 ml E3 + PTU door het toevoegen van 3 druppels E3 om de beeldvorming plaat geselecteerde putten en opzuigen van de vis met een plastic transferpipet. </li><li> Incubeer bij 33 ° C gedurende de gewenste tijdsduur. </li></ol> 6. Beeldvorming van de Fish Post-screening <ol><li> Op het gewenste tijdstip, verwijderen 25 van de 50 ml van de E3 + PTU media uit de diepe petrischaal met de vis op de foto. </li><li> Verdoven de vissen beschreven (stap 4.3 met slechts 1 ml TR in 25 ml E3 + PTU resterende eindconcentratie van 200 ug / ml). </li><li> Plate de vis in een 96-well plaat beeldvorming en de positie op de juiste wijze (stappen 5,3-5,7). </li><li> Afbeelding door scanning confocale microscopie met de juiste lasers en emissiefilters. Eerst nadruk op de vis met de 4X doelstelling van differentieel interferentie contrast (DIC) en beelden verkrijgen van het gebied van belang met de 20X objectief met confocale scanning mode lasers met 2 psec / pixel snelheid en 1024 x 600 pixels aspect ratio. Verwerven Z-stacks met 1 micrometer stapgrootte, het aanbrengen van Kalman filter modus van 3 frames. </li><li> Terug te keren naar een diepe petrischaal met 50 ml E3 + PTU of in individual putjes (24 putjes kweekschaal, 3 ml E3 + PTU) en incubeer bij 33 ° C. </li></ol> 7. Opheldering van de zwemblaas <ol><li> Vul een 10 ml spuit met een hoog vacuüm vet. </li><li> Bereid een 2% LMA (stap 5.3 met 160 mg van laagsmeltende agarose in 8 ml E3). </li><li> Op het gewenste moment verdoven de vis (stap 5.2). </li><li> Breng 10 vis een 1,7 ml centrifugebuis met 1 ml E3 en euthanize door toevoeging van 200 ul 4 mg / ml tricaïne (eindconcentratie van 800 ug / ml) aan de centrifugebuis en incuberen gedurende 15 min bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid een beeldvormende objectglas door het plaatsen 4 druppels vacuüm vet in een vierkant, 1 cm van elkaar op een microscoopglaasje (75 x 25 mm, Figuur 2). </li><li> Plaats 2 druppels 2% LMA in het midden van het plein. </li><li> Plaats een vis op een aparte glazen dia onder een microscoop ontleden en te controleren of het hart is gestopt met kloppen, verwijder het overtollige water. </li><li&gt; Met behulp van fijne pincet ontleden de zwemblaas door het handhaven van de kop in een vaste positie met de linker pincet en omlaag trekken van de voorste darm met de juiste pincet (Figuur 4A). </li><li> Pak de zwemblaas de pneumatische leiding met de linker pincet, scheidt van het spijsverteringskanaal, en plaats deze in het midden van de 2% LMA voordat het stolt. </li><li> Plaats een cover-slip (18 x 18 mm) op de top van de beeldvorming glasplaatje en duw hem tot tegen de vacuüm vet evenals de LMA (figuur 2). </li><li> Afbeelding binnen 10 min van dissectie zoals beschreven in stap 6.4. Herhaal stap 7,7-7,11 met de andere vissen. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voorschotten en beperkingen van de zwemblaas micro-injectie ziektemodel De hier gepresenteerde model is een uitbreiding van de mucosale candidiasis onderdompeling model Gratacap et al (2013).; voegt de voordelen van een gecontroleerde besmetting tijd zeer reproduceerbare infectiedosis, en dus verbeterde efficiëntie. We tonen hier nieuwe methoden die niet-invasieve temporale documentatie van de infectie dynamiek in groot detail, alsmede hogere resolutie ex vivo beeldvorming van...

Slijmvliesinfecties kunnen leiden tot levensbedreigende bloedbaaninfecties als gevolg van schade aan de epitheelbarrière, die ziekteverwekkers toegang geeft tot de systemische omgeving1,2. Bovendien kunnen slijmvliesinfecties ook significante immunopathologie veroorzaken, zelfs wanneer ze extern worden beperkt3-5. De commensale eencellige schimmel Candida albicans is aanwezig in de meerderheid van de bevolking in de mondholte en andere slijmvlieslocaties6-9. Hoewel normaal gesproken beperkt door aangeboren en adaptieve immuunresponsen, kunnen aangeboren immuundefeuten en medische ingrepen leiden tot ernstige mucosale candidiasis. De aanval op de epitheelbarrière resulteert in een verhoogd risico op levensbedreigende gedisseminateerde ziekte evenals immunopathologie, zoals in het geval van vulvo-vaginale candidiasis, bovendien is C. albicans kolonisatie gekoppeld aan longimmuunhomeostase10,11. Gedisseminateerde candidiasis is nu de vierde meest voorkomende bloedbaaninfectie op intensive care afdelingen12 en een mortaliteit van wel 40% maakt het een belangrijke zorg. Vanwege de toename van immunomodulerende behandelingen voor patiënten met auto-immuunziekten, kanker of orgaantransplantaties, is het van cruciaal belang om de interactie tussen dit pathogeen en het mucosale immuuncompartiment te begrijpen.
De meeste biologische vooruitgang met betrekking tot C. albicans-celinteracties op het slijmvliesniveau komt van in vitro13-15 en muismodellen16-18. Beide benaderingen hebben duidelijke voordelen, maar de mogelijkheid om levende cellen met hoge resolutie te beeldvormen in een intacte gastheer heeft de temporele en ruimtelijke karakterisering van de infectie beperkt. Voor deze studies is er behoefte aan een in vivo model waar de interactie van pathogeen, aangeboren immuun en epitheelcellen kan worden gevisualiseerd in een intacte gewervelde gastheer.
De zebravis is uitgegroeid tot een onschatbaarbaarbaar hulpmiddel voor het begrijpen van menselijke ziekten, voornamelijk vanwege zijn doorzichtigheid en geschiktheid voor genetische manipulatie. Cel- en orgaanontwikkeling zijn in prachtig detail geïmager, wat heeft geleid tot de beschrijving van nieuwe immuuncelgedragingen, zoals T-celgedrag in de zich ontwikkelende thymus19 of de strijd tussen intracellulaire mycobacteriën en fagocyten20-22. Recent werk heeft darmmicrobe-gastheerinteracties in zebravissen beschreven en aangetoond dat microbiële kolonisatie van het darmkanaal de darmfysiologie en resistentie tegen andere infecties van de gastheer beïnvloedt23,24. Verder is infectie door het darmepitheel beschreven voor verschillende pathogenen.
In tegenstelling tot het darmkanaal, vertegenwoordigt de zwemblaas een meer geïsoleerde en complementaire mucosale model. Dit orgaan is een verlengstuk van de zich ontwikkelende darmbuis en vormt zich vooraan de lever en pancreas25,26. Het produceert oppervlakteactieve stof, slijm en antimicrobiële peptiden27,28 en anatomisch, evenals ontogenetisch, wordt dit orgaan beschouwd als een homoloog van de zoogdierlong29,30. Omdat de pneumatische ductus verbonden blijft met de darm in de zebravis, maakt dit onderdompelinginfectie op natuurlijke wijze mogelijk. Opmerkelijk is dat de enige bekende natuurlijk voorkomende infecties van vissen met Candida soorten C. albicans infecties in de zwemblaas zijn31. We beschreven onlangs een experimenteel onderdompelinginfectiemodel waarbij C. albicans de zwemblaas infecteert, en ontdekten dat deze infectie enkele kenmerken van C. albicans-epitheelinteractie in vitro repliceert32,33.
In de hier gepresenteerde methode wordt het originele onderdompelinginfectiemodel verbeterd door direct C. albicans in de zwemblaas van 4 dagen post bevruchting (dpf) zebravissen te injecteren. Dit maakt nauwkeurige temporele controle van infectie mogelijk, evenals een zeer reproduceerbaar inoculum. Het maakt gedetailleerde intravitale beeldvorming mogelijk, gekoppeld aan de veelzijdigheid van het zebravismodel. Als voorbeeld van wat er met deze methode kan worden gedaan, presenteren we de ruimte-tijddynamiek van C. albicans groei samen met neutrofielenrecrutering naar de infectieplaats. Omdat zebravis zwemblaasweefsel uitdagend is om intravital te beeldvormen, presenteren we ook een snelle zwemblaasdissectietechniek die het fluorescentie signaal en microscopische resolutie verbetert. Deze methoden breiden de toolbox uit voor schimmel-, immunologisch en aquacultuuronderzoek en beschrijven ook een nieuwe infectieroute die kan worden vertaald om andere schimmel-, bacteriële of virale infecties van slijmvliesoppervlakken te modelleren.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml tubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Deep Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Wooden dowels</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Flaming Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>MPPI-3 injection system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic Base</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methane sulfonate</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system</td><td></td></tr><tr><td>20X microscope objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanSApo 20x/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Roller drum</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>TC-7</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Glass culture tubes (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Children clay (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Hausser scientific)</td><td>VWR Scientific</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>Type A immersion oil</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Fishing wire</td><td>Stren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well imaging plate (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Microslide (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Petri dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol (EMD chemicals)</td><td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>24-well culture dish (Olympus plastics)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Weight boats (8.9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas injection

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Vroege verdediging tegen mucosale pathogenen bestaat uit zowel een epitheliale barrière en aangeboren immuunsysteem cellen. De immunocompetency van beide, en hun onderlinge communicatie, zijn van het grootste belang voor de bescherming tegen infecties. De interacties van epitheliale en aangeboren immuuncellen met een pathogeen best onderzocht in vivo, waar complexe gedrag ontvouwt in tijd en ruimte. Echter, de bestaande modellen niet zorgen voor een gemakkelijke tijd-ruimtelijke beeldvorming van de strijd met ziekteverwekkers op het mucosale niveau. Het ontwikkelde model creëert een mucosale infectie door directe injectie van de pathogene schimmel, Candida albicans, in de zwemblaas van jeugdige zebravis. De resulterende infectie maakt hoge-resolutie beeldvorming van epitheliale en aangeboren immuunsysteem cel gedrag gedurende de ontwikkeling van mucosale ziekte. De veelzijdigheid van deze werkwijze maakt ondervraging van de host naar de gedetailleerde opeenvolging van gebeurtenissen die leiden tot immuun ph sondeagocyte werving en naar de rol van specifieke soorten cellen en moleculaire pathways in bescherming te onderzoeken. Bovendien kan het gedrag van de pathogeen als functie van immune aanval gelijktijdig worden afgebeeld door fluorescent eiwit tot expressie C. albicans. Toegenomen ruimtelijke resolutie van de gastheer-pathogeen interactie is ook mogelijk met behulp van de beschreven snelle zwemblaas dissectie techniek. De mucosale infectiemodel beschreven is eenvoudig en zeer reproduceerbaar, waardoor het een waardevol hulpmiddel voor de studie van mucosale candidiasis. Dit systeem kan ook globaal vertaalbaar andere mucosale pathogenen zoals mycobacteriële, bacteriële of virale microben die normaal infecteren door epitheliale oppervlakken.

Micro-injectie in de achterste zwemblaas De experimentele methode hier gepresenteerde beschrijft de injectie van een consistente dosis C. albicans gistcellen in de zwemblaas van 4 dpf zebravis. Vorige werk met de onderdompeling model suggereert dat de zwemblaas immuunrespons op C. albicans is vergelijkbaar zoogdier mucosale candidiasis 32. Hier laten we zien een aangepaste infectie methode die is eenvoudiger, reproduceerbare en snelle; enkele honderden zebravis word...

In vivo ruimte-tijdelijke interacties van pathogeen en immuunafweer op het mucosale niveau zijn niet gemakkelijk in beeld te brengen in bestaande gewervelde gastheren. De hier gepresenteerde methode beschrijft een veelzijdig platform om mucosale candidiasis bij levende gewervelden te bestuderen door gebruik te maken van de zwemblaas van de juveniele zebravis als een infectieplaats.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Het algemene doel van deze procedure is om mucosale candidiasis te modelleren met behulp van de jonge zebravis. Dit wordt bereikt door eerst een oplossing met levende albicans in een micronaald te laden. In de tweede stap wordt een gedefinieerd volume van de gistcellen geïnjecteerd in de zwemblaas van een jonge zebravis.Vervolgens worden de vissen gescreend op een homogeen inoculum en gedurende de gewenste tijd geïncubeerd. In de laatste stap wordt confocale microscopie gebruikt om de dynamische interactie van de ziekteverwekker met het immuunsysteem van de zebravis te volgen. Bovendien kan de zwemblaas worden microdissectie om hogere resolutie confocale beelden te verkrijgen.De methode die we hier presenteren, beantwoordt belangrijke vragen in de schimmelimmunologie en microbiologie, zoals wat de precieze opeenvolging van gebeurtenissen is die leidt tot een mislukte immuunrespons op de schimmelziekteverwekker en candida-bakens op de mucosale oppervlakken. Voordat u met de procedure begint, verwarmt u een injectiebakje met 2% aros in een incubator van 33 graden Celsius. Gebruik na 30 minuten een 25 milliliter pipet om 100 milliliter van de E drie media plus PTU te verwijderen van een plaat met vier dagen oude, post-fertilisatie zebravissen, zorg ervoor dat u geen van de vissen aanzuigt, en voeg twee milliliter van vier milligram per milliliter toe.Trica methaansulfonaat voorraad in het media om de dieren te anesthetiseren. Gebruik na 15 minuten een dissectiemicroscoop om de vissen met opgeblazen zwemblaasjes te identificeren en gebruik een plastic overdrachtspipet om 30 zebravissen over te brengen naar de voorverwarmde injectiebak. Verwijder het overtollige media, houd vervolgens de bakje onder een hoek en gebruik een vislijn van 0,012 inch diameter die met superlijm in een borosilicaat capillair is gelijmd om drie lijnen van 10 verticaal uitgelijnde vissen te maken. Elk volgende volledig vermengen van een buis vers bereide zee albicans met een concentratie van 1,5 keer 10 tot de zevende CFU per milliliter.En laad vervolgens drie microliters van de gistoplossing in de EC-geknipte micronaald. Stel de pulsduur in op de juiste instelling. Draai vervolgens de injectiebak om een hoek van 20 graden tussen de micronaald en het hoofd van de vis te bereiken, gericht op de achterkant van de zwemblaas.Duwt nu de micronaald in de zwemblaas en zorg ervoor dat de boring van de naald zich in het lumen bevindt en druk op de knop. Het verifiëren welke vissen zijn geïnjecteerd, is relatief eenvoudig, omdat de bolus de luchtbel verplaatst en de achterkant van de zwemblaas vervolgens wordt gevuld met media. Co-injectie van fenolrood met de bolus kan de visualisatie van een succesvolle injectie verder vergemakkelijken. Nadat alle 30 vissen zijn geïnjecteerd, spoelt u de bak met E drie media en legt u de vissen in de herstelbak.Breng 10 dieren over in een centrifugebuisje van 1,7 milliliter met één milliliter E drie media en euthaniseer de vissen met 200 microliter tric. Vervolgens, voor elk dier, schik vier druppels vacuümvet in een vierkant, een centimeter uit elkaar op een microslide, en voeg twee druppels vers bereid, 2% laag smeltend toe aan het midden van het vierkant. Plaats vervolgens een vis op een aparte glazen plaat onder een dissectiemicroscoop en controleer of het hart van het dier is gestopt met kloppen en verwijder het overtollige water.Gebruik nu één paar fijne pincetten om het hoofd in een vaste positie te houden en een ander om de voorste darm naar beneden te trekken. Neem de zwemblaas op door de pneumatische ductus, scheid hem van het spijsverteringskanaal en plaats hem in het midden van een van de voorbereide microslides voordat de agarose stolt. Plaats ten slotte een dekglas boven het weefsel en druk voorzichtig naar beneden tot het het vacuümvet en de agarose raakt en beeld de zwemblaas af binnen 10 minuten na het oogsten.Het injecteren van vier nanoliters zee albicans met een tot 1,5 keer 10 van de zevende. CFU per milliliter geeft de meest consistente gegevens die resulteren in een bereik van 10 tot 50 gistcellen per vis. Het verkleinen van het inoculum tot 15 tot 25 gistcellen geeft een nog nauwere fenotypie en respons.Neutrofielen spelen een sleutelrol in de resistentie tegen candidiasis bij muizen en mensen, en de infectie van de zebravis zwemblaas met levende albicans leidt tot een snelle en aanhoudende rekrutering van neutrofielen. Dat gebeurt niet wanneer hittedood gistcellen worden geïnjecteerd. Filamenten ontwikkelen zich snel na injectie van de gistcellen, waarbij de filamenteuze groei de eerste 24 uur na injectie voortduurt, waarna dit aantal begint te dalen. Het vermogen om individuele vissen non-invasief te volgen, maakt deze longitudinale studies mogelijk en benadrukt de individuele verschillen in ziekteprogressie en gastheerreacties.Een experimenteel protocol dat in de muisbeelden onpraktisch blijft, zijn de interacties van immuun- of epitheelcellen met c albicans relatief eenvoudig in het hier gepresenteerde model. Het dissecteren van de zwemblaas zoals zojuist gedemonstreerd, verbetert echter aanzienlijk de kwaliteit van de beeldvorming. Dit is vooral nuttig bij het visualiseren van transgene vislijnen waar de fluorescentie ubiquitair wordt tot uitdrukking gebracht en er buitensporige fluorescentie is in het omringende weefsel zoals waargenomen in deze beelden van een gedissecteerde zwemblaas van de alfa Catine citrine vislijn.Na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals morfo-technologie of chemische remmingsbehandeling, kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden zoals, wat is de rol van een specifieke immuuncel of signaalroute in mucosale candidiasis.

modeling-mucosal-candidiasis-larval-zebrafish-swimbladder

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Source: Li, J. et al. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the microinjection-based delivery of fluorescently labeled Clostridioides difficile into the intestinal lumen of an anesthetized zebrafish larva. It outlines the steps involved in larval preparation, bacterial injection, and fluorescence microscopy–based confirmation of bacterial localization within the intestine.

Localized Delivery of Bacteria into the Intestinal Lumen of a Zebrafish Larva Using Microinjection

Source: Flores, E., et al. Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the method of establishing a foodborne bacterial intestinal infection model in zebrafish larvae by feeding them paramecia infected with fluorescent E. coli.

Modeling Intestinal Infection in Zebrafish Larvae Using Foodborne Bacteria

Source: Li, J., et al. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the microgavage procedure, where an anesthetized zebrafish larva is immobilized in agarose and orally injected with a pathogenic bacterium using a tracer-guided needle. The non-invasive delivery mimics natural infection, enabling analysis of bacterial replication, toxin release, and intestinal epithelial damage.

Development of a Zebrafish Larval Infection Model Using Microgavage

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

In dit protocol, fluorescently geëtiketteerde T. cruzi werden ingespoten in transparante zebrafish larven en de beweeglijkheid van de parasiet werd waargenomen in vivo met licht blad fluorescentie microscopie.

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Hier presenteren we een protocol voor model menselijke tuberculose in een volwassen zebrafish met behulp van de natuurlijke ziekteverwekker Mycobacterium marinum. Geëxtraheerde DNA en RNA van de inwendige organen van besmette zebrafish kan worden gebruikt om te onthullen dat het totaal mycobacteriële ladingen in de vis en de immuunrespons van de gastheer met qPCR.

Modelleren van tuberculose in Mycobacterium marinum besmet volwassen zebravis

De huidige studie beschrijft een zebravis embryo model voor in vivo visualisatie en intravital analyse van biomaterial-geassocieerde infectie na verloop van tijd op basis van fluorescentie microscopie. Dit model is een veelbelovende aanvulling op zoogdieren dierlijke modellen zoals Muismodellen voor het bestuderen van de biomaterial-geassocieerde infecties in vivo.

Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie

Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.

Targeting Drugs aan Larvale Zebrafish Macrofagen door injecterendrug-loaded Liposomen

Hier gepresenteerd is een veilige en effectieve methode om zebravissen larven te infecteren met fluorescerend gelabeldanaërobe C. difficile door micro-injectie en niet-invasieve microgavage.

Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Dit protocol demonstreert de micro-injectie van lipopolysaccharide in het ventriculaire gebied van de hersenen in een zebravislarvemodel om de resulterende neuro-inflammatoire respons en neurotoxiciteit te bestuderen.

Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen

Leer een model voor mucosale candidiasis in larven van Danio rerio via zwemblaasinjectie met Candida albicans. Confocale microscopie maakt real-time beeldvorming van pathogeen-immuuninteracties mogelijk.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Meer video's verkennen