Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

Het algemene doel van het volgende experiment is om de output van de thymus en het beenmerg te schatten door zowel T-cel receptor excisie cirkels of REX als K-deleting recombinatie excisie cirkels of corrects in een enkele assay te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een triple insert plasmid te construeren dat fragmenten van de DNA-sequentie van TRX corrects en van een enkelvoudig referentiegen bevat om een een-op-een-op-een verhouding tussen de drie doelwitten te behouden na DNA-amplificatie. Vervolgens wordt een standaardcurve gebouwd door seriële verdunningen van het triple insert plasmid uit te voeren, wat de absolute kwantificering van de drie doelsequenties mogelijk maakt door realtime PCR.

Ten slotte wordt een realtime PCR-assay uitgevoerd, wat leidt tot de absolute kwantificering van tres en cracks. De gerapporteerde resultaten tonen de veranderingen in de output van de thymus en het beenmerg met leeftijd en geslacht bij gezonde kinderen en volwassenen. We hadden eerst het idee voor deze methode toen we zowel de beenmerg- als de thymusoutput bij pasgeborenen of zuigelingen moesten analyseren, gezien de hoeveelheid bloed die meestal wordt afgenomen schaars is in vergelijking met volwassenen.

Daarom besloten we om de twee methoden van tracks en corrects kwantificering te combineren in een enkele assay om de monstervoorbereiding en reagentiakosten te optimaliseren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose van primaire en verworven immuundeficiënties, maar de methode kan ook worden gebruikt bij alle ziekten die betrekking hebben op het verlies van TMB-cellen, evenals om nieuwe reconstitutie na beenmergtransplantatie te bestuderen. Door deze methode kan inzicht worden verkregen in de menselijke ziekte. Het kan ook worden toegepast op fundamenteel onderzoek, vooral dat welke betrekking heeft op lymfocythomeostase.

Het belangrijkste voordeel is dat door het gebruik van een triple overschot mid slechts een enkele standaardcurve nodig is, waardoor de experimentele variabiliteit wordt verminderd. Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege de langdurige procedure die vereist is voor de bereiding van het triple insert plasmid of vanwege de problemen met de bereiding van de standaardcurve. Om te beginnen, verzamel een monster dat cellen bevat die waarschijnlijk TRX en cracks bevatten die detecteerbaar zijn door PCR, zoals perifeer bloed van een jonge gezonde persoon verzameld in EDTA-buisjes met behulp van een standaard dichtheidsgradiëntscheidingsmethode.

Scheid de perifere bloedmononucleaire cellen na het extraheren van het DNA uit de cellen volgens het protocol in de tekst, gebruik primers specifiek voor TRX REX en TCR alfa constante gen om Rex signaal, gezamenlijk Rex signaal en TCR alfa constante gen fragmenten te versterken. Plaats het PCR-product van Trax signaal gezamenlijk op de TA acceptor site van de PCR 2.1 topo vector en gebruik het plasmide DNA om XL een blauw chemisch competente cellen te transformeren door middel van warmteschok, isoleer ampicilline-resistente witte kolonies die de beta lactase complementatie hebben verloren op een nieuwe masterplaat en gebruik PCR om de kolonies met het trek-fragment te identificeren. Na het laten groeien van een van de trek-positieve kolonies en het isoleren van het DNA, gebruik SP een om het plasmide en het geamplificeerde TCR alfa constante gen product te verteren en het TCR alfa constante gen fragment in het plasmide te ligeren.

Herhaal transformatie, kolonieselectie en expansie en DNA-isolatie om het correct-fragment te inserteren, gebruik hind drie in plaats van SP een om het plasmide en de correct PCR-fragment te verteren en herhaal het proces om te ligeren en het DNA te isoleren. Zodra de sequenties van de drie inserts zijn geverifieerd, breid de kolonie uit en zuiver het plasmide DNA door middel van MIDI prep volgens het protocol in de tekst om een standaardcurve voor te bereiden. Na het berekenen van de massa en concentratie van het plasmide zoals hier getoond, ontdooi een aliquot van het plasmide en toon een tot lineair maken van twee microgram met het gelinealiseerde aliquot van DNA.

Gebruik de formule C een V een gelijk is aan C twee V twee. Bereken het verdunningsvolume dat nodig is om het eerste standaardcurvepunt van de serie voor te bereiden zoals hier getoond, bereid een reeks van een tot 10 verdunningen om de resterende standaardcurvepunten te verkrijgen. Bewaar de plasmide verdunning bij minus 80 graden Celsius tot gebruik. Om monsters voor realtime PCR voor te bereiden, schik een PCR-plaat die ten minste twee replica's bevat voor elk te analyseren monster op de volgende manier met twee afzonderlijke buisjes, een voor Rex en cracks en een voor TCR alfa constante.

Bereid de mastermixes voor voor het totale aantal putjes dat nodig is. Voeg 20 microliter toe aan de putjes van de plaat. Voeg vervolgens vijf microliter geëxtraheerd genomisch DNA van perifere bloedmononucleaire cellen of P BMC's toe.

Voeg vijf microliter water toe aan de controleputjes zonder sjabloon voordat u een optische kleefstofafdekking gebruikt om de reactieplaat te verzegelen. Ontdooi vervolgens het plasmide DNA standaardcurve verdunning en bereid de hoogste verdunning voor. Ontdek alleen de putjes tussen rijen A tot H en kolommen een tot vier.

En na kort voorwerpen, voeg vijf microliter van elk verdunningspunt toe aan zijn aangewezen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aan de onderkant van de putjes zijn en dat de reagentia aan de bodem zijn neergedaald. Gebruik een real-time PCR-systeem om de assay uit te voeren met het volgende protocol.

50 graden Celsius gedurende twee minuten en initiële verwarming bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten, gevolgd door 45 cycli van denaturatie bij 95 graden Celsius gedurende 15 seconden. En een gecombineerde primer sonde knielen en verlenging bij 60 graden Celsius gedurende één minuut. Om de realtime PCR-gegevens te analyseren, open het opgeslagen resultaatbestand in de software en klik op het resultatentabblad bovenaan het venster.

Klik op het analysemenu en selecteer analyse-instellingen. Laat de software de drempelwaarde automatisch bepalen door alle detectoren en auto CT voor drempelcyclus te selecteren. Laat de software standaard een automatische baseline instellen voor achtergrond eliminatie.

Klik op het tabblad genaamd versterkingsplot en selecteer aan de rechterkant van het venster een van de drie detectoren in het bijbehorende