Een nieuwe techniek voor de kwantitatieve analyse van haaruitval in Muizen met behulp van grijstinten Analyse
9 maart 2015
Alopecia is een veelvoorkomende vorm van haarverlies die kan optreden in veel verschillende omstandigheden, inclusief als een bijwerking van chemotherapie. We hebben een methode ontwikkeld om haarverlies bij muizen te kwantificeren, waarbij we een standaard gel imager gebruiken om een grijswaardenanalyse uit te voeren, om de studie van veelbelovende nieuwe alopecia-therapieën te vergemakkelijken.
Het algemene doel van deze procedure is om een kwantificering van de haardichtheid te verkrijgen met behulp van lichtabsorptie. Dit wordt bereikt door eerst dieren te fotograferen op een gel-imager. De volgende stappen zijn het definiëren van een interessegebied op de foto en het bepalen van de lichtabsorptie binnen het interessegebied.
Vervolgens wordt de lichtabsorptie vergeleken met een fotografische standaard. Uiteindelijk kan de lichtabsorptie worden gemiddeld tussen gelijk behandelde dieren om de effecten van een interventie op de haargroei te laten zien. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het onbevooroordeeld, kwantificeerbaar en reproduceerbaar is.
Dit is uiterst belangrijk omdat het je toestaat om standaarden te gebruiken, statistische technieken zoals Inova om de statistische significantie van de resultaten te bepalen. Gebruik voor dit protocol een gel-imager met een ingebouwde lichtbron voor reflectieve fotografie. Dit zorgt voor een goede lichtuniformiteit, terwijl trans-verlichting een silhouet creëert dat ongeschikt is voor analyse.
Begin met het voorbereiden van de gel-imager, stel de focus en het zichtveld in. Met behulp van wat afgedrukte tekst kan de muis lichtjes onscherp zijn, omdat dit eigenlijk werkt. Om kwantale fouten in kleine interessegebieden te verminderen, verifieer vervolgens de uniformiteit van de lichtbron over het gefotografeerde gebied met als doel een uitstekende optische gemiddelde bij het interessegebied.
Bereid vervolgens het dier voor. Selecteer een verdovingsmiddel met een snel begin en korte werkingsduur en geef net genoeg toe om de dieren stil te houden tijdens de fotografie. Plaats nu de dieren verticaal op de imager en zo dicht mogelijk parallel.
Voor dorsale foto's plaats je de dieren in een buikligging met hun ledematen uitgestrekt. Voor ventrale foto's plaats je de dieren in een rugligging. Zorg ervoor dat ze niet lateraal geroteerd zijn.
Absorptiewaarden kunnen tussen afbeeldingen worden getrokken, maar dit is niet waarvoor de machine is ontworpen. Het toevoegen van een grijstonstandaard stelt ons in staat om de absorptiewaarden te normaliseren bij het samenstellen van de gegevens. Plaats nu de grijstonstandaard in het gefotografeerde gebied.
Sluit vervolgens de kamer en verminder de omgevingsverlichting die de kamer via de camera binnen zou kunnen komen. Stel de F-stop in op een belichting die het interessegebied niet oververzadigd of onderbelicht maakt. Maak vervolgens een foto.
Als de F-stop zo wordt gekozen dat het beeld verzadigd is, zal de grijstonstand waarde vaststaan op de waarde en B van geen enkel nut. Verander vervolgens de F.Stop met één, houd het interessegebied en de standaard in een lineair belichtingsbereik, en maak een tweede foto met de fotografie voltooid. Leg de dieren op een opwarmingstafel en bewaak ze totdat ze hersteld zijn.
Sternale liggende. Breng de dieren vervolgens terug naar hun kooien en uiteindelijk naar het dierenlaboratorium voor volledige herstel. Om de lichtabsorptie te kwantificeren met behulp van de gel-imagingsoftware, markeer de interessegebieden op de afbeeldingen van de dieren voor een volledige dorsale weergave van het dier.
Gebruik een rechthoekige afbeelding, een ovale afbeelding of een freehand-tool om een ruimte te omlijnen van de bovenste ledematen tot de onderste ledematen, zo veel mogelijk lateraal uitstrekkend. Blijf binnen de marges van de achterkant van het dier voor een volledige ventrale weergave van het dier. Gebruik twee rechthoeken.
Eén om het bekkengebied te bedekken, dat is verzorgd, en één om het borstgebied te bedekken, dat niet verzorgd is. Kleinere interessegebieden, zoals waar een medicijn werd toegediend, kunnen ook worden gemarkeerd zoals vereist. Markeer vervolgens het interessegebied op de grijstondabsorptiestandaard.
Neem vervolgens de absorptie op van elk gemarkeerd interessegebied voor vergelijking tussen foto's. Normaliseer de absorptieniveaus naar de achtergrondstandaard met behulp van een log-log relatie van blootstelling tot absorptie. Om dit te doen, tekend een curve van de log van blootstelling tegen de log van absorptie.
Gebruik waarden verkregen uit de grijstondabsorptiestandaard, pas vervolgens aan voor variaties in de standaard van elke foto als volgt. Selecteer eerst de F-stop voor het lezen van de ROI en de F-stop voor de referentie en bereken de gemiddelde absorptie van de standaard in alle foto's bij de lees-F-stop. Dit gemiddelde is de referentiestandaardwaarde of de RSV.
Bereken vervolgens het verschil in absorptie tussen de lees- en referentie-F-Stop instellingen in elke foto en maak dezelfde berekeningen voor de standaard en voor elke gedefinieerde ROI. Gebruik nu gegevens van één F-stop, bereken de gecorrigeerde absorptie voor elke ROI met behulp van de getoonde formule. Pas vervolgens standaard statistische methoden toe om de gegevens te analyseren. C3 HHEJ engrafted muizen, die een model voor alopecia ADA waren, werden geanalyseerd met behulp van de beschreven methode bij verschillende blootstellingen.
Variaties in niet-overlappende ROI waren strak gecorreleerd zoals verwacht. Vergelijkbare vergelijkingen produceerden dezelfde strakke correlatie over een periode van drie weken. De muizen werden gefotografeerd om hun verwachte haarverlies te kwantificeren.
80%van de gefotografeerde muizen vertoonde haarverlies in dit tijdsbestek. Ter vergelijking, normale C 57 zwarte zes muizen vertoonden geen haarverlies in dezelfde tijdsperiode. In een tweede studie werd chemotherapie-geïnduceerde alopecia gekwantificeerd met behulp van de beschreven techniek.
Muizen werden gedurende drie weken behandeld met cyclofosfamide en na twee maanden vertoonden ze significant haarverlies vergeleken met controles. Eenmaal onder de knie, kan elk beeld in minder dan vijf minuten worden geanalyseerd. Na het bekijken van deze video, zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je de hoeveelheid haargroei bij knaagdieren kunt kwantificeren met behulp van een standaard gel-imaging systeem.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Alopecia is een veelvoorkomende vorm van haaruitval die kan optreden als gevolg van verschillende aandoeningen, waaronder chemotherapie. Deze studie presenteert een methode voor het kwantificeren van haaruitval bij muizen met behulp van een gel-imager voor grijswaardeanalyse.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Onderzoek naar haaruitval
Achtergrond
- Alopecia kan het gevolg zijn van meerdere factoren, waaronder medische behandelingen.
- Het kwantificeren van haarverlies is essentieel voor het evalueren van nieuwe therapieën.
- Standaard beeldvormingstechnieken kunnen de nauwkeurigheid van het onderzoek verbeteren.
- Deze methode beoogt een reproduceerbare aanpak te bieden voor de meting van de haardichtheid.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een kwantificeringsmethode voor de haardichtheid bij muizen.
- Het faciliteren van het onderzoek naar nieuwe therapieën tegen alopecia.
- Het benutten van lichtabsorptie voor nauwkeurige metingen.
Gebruikte methoden
- Het fotograferen van dieren met behulp van een gel-imager.
- Het definiëren van een regio van interesse in de foto's.
- Het meten van de lichtabsorptie binnen de gedefinieerde regio.
- Het vergelijken van de lichtabsorptie met een fotografische standaard.
Belangrijkste resultaten
- De methode levert onbevooroordeelde en kwantificeerbare resultaten op.
- Lichtabsorptie kan worden gemiddeld over dieren die op vergelijkbare wijze zijn behandeld.
- De techniek is reproduceerbaar voor consistente resultaten.
- Het toont effectief de effecten van interventies op de haargroei aan.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is een waardevol instrument voor alopecia-onderzoek.
- Het verbetert de mogelijkheid om nieuwe therapieën te evalueren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze kwantificatietechniek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Kwantitatieve beoordeling van haarverlies in preklinische modellen is essentieel voor het evalueren van therapeutische interventies in alopecia-onderzoek. Deze techniek biedt een objectieve, reproduceerbare methode om de haardichtheid te meten via grijswaardenanalyse, wat datagestuurde targetvalidatie en mechanische risicoreductie in preklinische pijplijnen mogelijk maakt. Door de kwantificering van haarverlies te standaardiseren, wordt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase vergroot en worden go/no-go-beslissingen voor programma's gericht op alopecia verbeterd.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door kwantificeerbare metrieken voor haarverlies te bieden over genetische en geïnduceerde alopecia-modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicobeperking via objectieve, gestandaardiseerde meting van interventie-effecten op de haargroei.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door vergelijkbare, statistisch analyseerbare gegevens te genereren over verschillende behandelingen met verbindingen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door basiswaarden en behandelde haarabsorptiewaarden vast te stellen.
- Reproduceerbaarheid: Garandeert standaardisatie van de assay via normalisatie naar een grijswaardenstandaard en een consistente definitie van het interessegebied.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk via snelle beeldanalyse (<5 minuten per beeld) met behulp van algemeen beschikbare gel-imagingapparatuur.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert door chemotherapie geïnduceerde alopecia, alopecia areata en mechanisch haarverlies, ter ondersteuning van de afstemming van translationele biomarkers.
- Preklinische continuïteit: Verbindt de kwantificering van haarverlies in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via consistente, longitudinale monitoring.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert beslissingen over verdere ontwikkeling door veranderingen in haardichtheid te correleren met therapeutische effectiviteit in alopecia-modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, door kwantitatieve, statistisch hanteerbare gegevens over haaruitval te leveren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en het verduidelijken van pathways door lichtabsorptie te meten als surrogaat voor haardichtheid in behandelde versus controledieren.
- Screening: Biedt assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten via genormaliseerde absorptiewaarden, waardoor vergelijkingen tussen dieren en tussen groepen mogelijk worden.
- Analytics: Genereert metingen die compatibel zijn met standaard statistische technieken (ANOVA, T-test) om de significantie van interventie-effecten te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door longitudinale tracking van haarverlies en hergroei in ziekterelevante muismodellen mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbare capaciteit over verschillende alopecia-modellen vanwege de afhankelijkheid van standaard gel-imagingapparatuur en minimale gespecialiseerde training.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij het fenotyperen van alopecia-modellen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door grijswaardenormalisatie en gedefinieerde protocollen voor het interessegebied (region-of-interest).
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege, datagestuurde go/no-go-beslissingen mogelijk te maken bij de ontwikkeling van therapieën voor alopecia.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering door kwantificeerbare, vergelijkbare resultaten van de effectiviteit te leveren over diverse alopecia-etiologieën.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van dieren, beeldverwerving en basisbeeldanalyse met behulp van gel-imagingsoftware.
- Afhankelijk van toegang tot een gel-imager met reflecterende verlichtingsmogelijkheden en hulpmiddelen voor grijswaardenstandaardisatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de definitie van het interessegebied en de belichtingsinstellingen voor reproduceerbare resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende muizenstammen, haarkleuren of methoden voor het induceren van alopecia.
- Beperkt tot relatieve metingen van de haardichtheid; biedt geen histologische of moleculaire details over de status van de haarzakjes.
