Name: Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Leer het fabriceren van complexe weefselkweeksubstraten met micropatronen van PEG-borstels via robotische microcontactprinten. Deze methode maakt ruimtelijk nauwkeurige immobilisatie van biologische liganden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit werk, GTK, TK en JDM werd verstrekt door het Wisconsin Institute for Discovery en de Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Genereren Elastomeric Postzegels <ol style="margin-left: 40px;"><li> Om de PDMS stempel van silicium meesters te genereren, het ontwerp van de photomask&#39;s functie patronen met behulp van computer-aided design software. <ol><li> Ontwerp van het eerste patroon als een 20 x 20 matrix van annuli 300 urn inwendige diameter (ID) en 600 micrometer OD van 1,200 urn hart op hart afstand. </li><li> Het ontwerp van de tweede patroon als een 20 x 20 matrix van annuli met 600 micrometer ID en 900 micrometer OD met 1,200 micrometer hart-op-hart afstand. </li><li> Daarnaast plaatst u 1 x 1 mm 2 vierkante merktekens op alle vier de hoeken van elke array ontwerp gespreid 1.200 micrometer center-to-center uit de hoek patroon bij een hoek van 45 °. </li><li> Fabriceren silicium matrijzen voor gebruik in dit experiment met 1: 1 aspectverhoudingen, correleert een 300 urn diepte feature toepassing van standaard lithografische technieken elders 15 of samen met een gedetailleerde microfluidic gieterij. OPMERKING: Opties en diepten van minder dan 100 micrometer kan leiden tot abnormale vervorming van postzegels voorafgaand aan contact met substraat oppervlakken. LET OP: Dit protocol begint met het hebben van al verkregen silicium meesters met de beschreven patronen van fotolak, die gespecialiseerde apparatuur en schone kamers te creëren vereist. Het is het beste om te overleggen met een fabrikant of bij de kern faciliteit om deze patronen masters te creëren. </li></ol></li><li> Silaniseren silicium masters O / N door incubatie met (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) trichloorsilaan damp. OPMERKING: Silane damp is zeer giftig en mag alleen in een zuurkast worden behandeld. </li><li> Maak inverse replica van de silicium meesters door uitharden van een 10: 1 verhouding van PDMS prepolymeer en hardingsmiddel PDMS bovenop de gesilaniseerde silicium meesters in een petrischaal O / N bij 60 ° C. </li><li> Verwijder de PDMS postzegels uit het silicium meesters, en bond de postzegels om acrylonitril butadieen styreen (ABS) backings of enig ander stijf materiaalis het gebruik van lijm. Opmerking: Het materiaal van keuze behoeft niet doorzichtig of biocompatibel. Het moet echter een vlak oppervlak interactief door de robot tooling en hogere stijfheid dan PDMS. </li></ol> 2. Voorbereiding Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Spoel microscoop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) in tolueen, methanol en ultrasone trillingen in aceton gedurende 1 minuut voor het spoelen met ethanol en drogen onder een zachte stikstofstroom. OPMERKING: ga tolueen en aceton alleen in een zuurkast. </li><li> Coat coverslides met ~ 3.5 nm titanium (Ti), gevolgd door 18,0 nm goud (Au) met behulp van een gefocusseerde elektronenbundel verdamper. Opmerking: Deze procedure is compatibel met een verscheidenheid van met goud beklede substraten zoals silicium en polystyreen. Hoewel het mogelijk is deze te genereren ter plaatse, met goud beklede substraten zijn beschikbaar via commerciële leveranciers. OPMERKING: Ti lagen moet ten minste 3 nm dik, terwijl Au lagen op substraten moet eent minste 5 nm dik en kan tot aan 1 mm in dikte, afhankelijk van de ideale optische eigenschappen van het eindsubstraat 16,17 bereik. Substraten zijn niet nodig optisch helder voor de productie te zijn; echter, vergemakkelijkt microscopische analyse van producten van substraten. </li><li> Spoel goud gecoate coverslides met ethanol en droog onder zachte stikstof direct voor gebruik. </li></ol> 3. R-μCP van Outer Annulus <ol style="margin-left: 40px;"><li> Voordat R-μCP met het selectief compliant gelede robotarm (SCARA) systeem, kalibreert u de robotwerktuig effectoren en bijbehorende dubbele camera systemen met behulp van de software van het systeem. LET OP: Deze worden ingezet afgebeeld in figuur 1. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Figuur 1. R- μCP System en Robotic Arm Tooling. </strong&gt; (A) Grootschalige beeld van R-μCP systeem met alle gereedschappen en klemmen, (a) vacuum klauwplaat, (b) reagens bad, (c) naar beneden gerichte camera, (d) stempel nesten armatuur, (e) robotachtige tool. (B) Robotarm tooling beeltenis (f) gediamanteerde ets gereedschap en (g) pneumatische zuigkracht gereedschap met een (h) ABS-backed PDMS stempel. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Handmatig op een PDMS stempel met 600 micrometer ID en 900 micrometer OD vooruitstekende annuli gezicht naar beneden in de stempel nesten armatuur. Handmatig op een vers gereinigd met goud beklede coverslide bovenop de vacuümklem, weergegeven in figuur 1A en immobiliseren met behulp van de aangesloten lab vacuüm. </li><li> Met de robotbesturing, sluiten de naar beneden gerichte camera op het middelpunt van het goud gecoate coverslide, zoals in figuur 2A. OPMERKING: Dit punt kan in eerste instantie worden bepaald door visuele inspectie en heeft geen grote nauwkeurigheid vereisen, zoals het PDMS stempel is veel groer zijn dan goud gecoate glijbaan. </li><li> Instrueer de robotarm tot vier referentie-etsen &quot;X&quot; markeringen op de hoekpunten van een vierkant met afmetingen 3,8 mm bij 3,8 mm gecentreerd op het goud gecoate coverslide behulp van de gediamanteerde ets hulpmiddel bevestigd aan de robotarm. (Weergegeven in figuur 2B; geautomatiseerd proces) OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat alle vier merktekens zijn binnen een visuele omlijsting van de neerwaartse facing camera. </li><li> Met behulp van de robots pneumatische zuigkracht tooling, pick-up en houd de PDMS stempel 1 mm boven het stempel nesten competitieprogramma zoals in figuur 2C. (Geautomatiseerd proces) </li><li> Met behulp van de opwaartse gerichte camera en LED-verlichting ring afgebeeld in figuur 2D en E, visualiseren referentievierkant merken van een stempel en identificeer ze met de camera software 10 keer om de stempel van de gemiddelde X, Y bepalen, en hoekafwijking van het centrum van de robot tooling as. (Geautomatiseerd proces) </li><li> Zoals in <strong&gt; Figuur 2A, gebruik dan de naar beneden gerichte camera om te visualiseren en op te sporen geëtst merktekens de coverslide&#39;s 10 keer naar de coverslide gemiddelde X, Y center locaties en hoekafwijking van het centrum van de robot tooling as te bepalen. (Geautomatiseerd proces). OPMERKING: Een interne berekening wordt uitgevoerd door de software van het robotsysteem om precies uitlijnen van de stempel en dekglaasje&#39;s X, Y center locaties en hoekige offsets in toekomstige O-μCP stappen. </li><li> 3.8) Plaats de stempel in een bad van alkaanthiol ATRP initiator, ω-mercaptoundecyl broomisobutyraat (2 mM in ethanol) zoals weergegeven in figuur 2F. (Geautomatiseerd proces) </li><li> Verwijder de stempel van de alkaanthiol oplossing en plaats deze over stikstofstroom onder druk om 0,48 bar (5 psi) aan de ethanol verdampen zoals in figuur 2G. Na 1 min de druk op de stikstofstroom is 1,03 bar (15 psi) uniforme droog waarborgen. (Geautomatiseerd proces) OPMERKING: Bij onvolledige droging zal resulteren in geheel of gedeeltelijk verlies van de patroon trouw. </li><li> Na drogen, beweegt de stempel op het berekende middenpositie van de goud gecoate glijbaan en zakken 100 urn porties onder controle Z-as motor force zoals in figuur 2H. OPMERKING: Dit wordt gecommuniceerd als koppel ervaren door de Z-as motor en weergegeven in de robot begeleiding software. (Geautomatiseerd proces) </li><li> Stop verlagen van de stempel wanneer de vooraf bepaalde druk van 79,2 kPa is bereikt, en contact met goud gecoate glijbaan voor 15 sec te handhaven. (Geautomatiseerd proces) OPMERKING: De druk waarden hier zijn geoptimaliseerd voor het huidige stempel design en functie hoogte. Als de stempel ontwerp wordt gewijzigd, specifiek voor hoge aspect ratio postzegels, tune deze dienovereenkomstig door een trial and error proces. </li><li> Verwijder langzaam de stempel van het goud gecoate dia en plaats de stempel terug in de stempel nesten armatuur. (Geautomatiseerd proces) </li></ol&gt; 4. SI-ATRP van PEGMEMA op micropatterned Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Laat onderdruk die de micropatterned coverslide, en overbrengen naar een 50 ml Schlenkkolf. Seal en ontgast de Schlenkkolf behulp van een vacuümpomp. </li><li> Voeg 5,5 ml van ATRP reactiemengsel dat het macromonomeer PEGMEMA (208,75 mmol), water (34,4 ml), methanol (43,8 ml), koper (II) bromide (1 mmol), en 2 &#39;, 2-bipyridine (3 mmol) om de Schlenk kolf. </li><li> Voeg 0,5 ml L-natriumascorbaat (454,3 mM) in water om de reactie te initiëren en deze te blijven gedurende 16 uur bij kamertemperatuur onder inert gas. OPMERKING: Na toevoeging van L-natriumascorbaat, zal reactie kleurverschuiving van lichtgroen tot donkerbruin zoals getoond in figuur 3A-B. OPMERKING: De reactie kan ook na 16 uur, maar het zal niet significante toename van de lengte van de PEG borstels. </li></ol><imgalt = &quot;Afbeelding 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figuur 3. Opening van het SI-ATRP. (A) Inleiding van reactie en (B) de daaropvolgende kleurverandering na toevoeging van L-natrium ascorbaat. (C) microscoop beeld van micropatterned coverslide oppervlak volgende SI-ATRP procedure. Schaalbalk 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Verwijder de micropatterned coverslide van Schenk kolf en spoel met ethanol, water en ethanol en drogen onder een zachte stikstofstroom. OPMERKING: Na SI-ATRP, moet oppervlaktemodificaties zichtbaar voor het oog en kan worden afgebeeld en geanalyseerd onder een microscoop zoals in figuur 3C. Opmerking: Dit is de eenvoudigste manier om de nauwkeurigheid van het proces te testen als het de noodzaak wegneemt om de substraten immunostain. </li></ol> 5. Azide Functionalisering van micropatterned PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Plaats de micropatterned coverslide in een 20 ml glazen reactie flacon. </li><li> Voeg 6 ml N, N-dimethylformamide (DMF) dat 100 mM natriumazide in de reactieflacon. Houd deze reactie bij 37 ° C gedurende 24 uur. OPMERKING: ga DMF alleen in een zuurkast. Wees voorzichtig met het afwegen van natriumazide. </li><li> Na voltooiing, verwijder de micropatterned coverslide van de reactieflacon en spoel met ethanol dan water en drogen onder een stikstofstroom. </li></ol> 6. Passiveren van Broom gefunctionaliseerde PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Plaats micropatterned coverslide in 20 ml glazen reactieflesjes. </li><li> Voeg 6 ml dimethylsulfoxide (DMSO) die 100 mM ethanolamine en 300 mM triethylamine in de reactieflacon. Houd deze reactie bij 40 ° C gedurende 24 uur. OPMERKING: ga DMSO, ethanolamine, en triethylamine alleen in een zuurkast. </li><li> Na voltooiing verwijder de micropatterned coverslide van de reactieflacon, spoel met ethanol dan water en drogen onder een stikstofstroom. </li></ol> 7. R-μCP van Inner Annulus en SI-ATRP van PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Voer R-μCP stappen zoals eerder beschreven in stap 3.2 en 3,6-3,12, vervangen van een PDMS stempel met 300 urn en 600 urn ID OD uitstekende ringvormige openingen, zodat de annuli met kleinere elementen in de eerder micropatterned annuli geplaatst. OPMERKING: De druk drempel voor deze postzegel is 132,0 kPa. Zoals eerder vermeld, worden deze druk optimale instellingen voor de stempel functies wordt gebruikt in dit experiment. </li><li> Uitvoeren van SI-ATRP stappen zoals eerder beschreven in de stappen 4,1-4,4. </li></ol> 8. Acetyleen Functionalisering van micropatterned PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Plaats micropatterned coverslide in een 20 ml glazen reactie flacon. </li><li> Voeg 6 ml DMSO met 100 mMpropargylamine de reactieflacon. Houd deze reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. OPMERKING: ga DMSO en propargylamine alleen in een zuurkast. </li><li> Na voltooiing verwijder de micropatterned coverslide van de reactieflacon en spoel met ethanol dan water en drogen onder een stikstofstroom. </li></ol> 9. Koper-gekatalyseerde &quot;Klik&quot; Biotinylatie van acetyleen Afgebroken PEGMEMA Chains <ol style="margin-left: 40px;"><li> Plaats micropatterned coverslide in een 20 ml glazen reactie flacon. </li><li> Voeg 6 ml kopersulfaat (15 mM) / Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v water / DMF) bevattende 562 pM azide-PEG 4 biotine conjugaat aan de reactieflacon. Voeg 1,2 ml L-ascorbinezuur (0,15 mM) in water aan het mengsel om de reactie te initialiseren. </li><li> Bubble stikstof door het reactiemengsel gedurende 10 sec, sluit de flacon met Parafilm en reageren gedurende 24 uur bij KT. </li><li> Bij completion verwijderen micropatterned coverslide uit de reactie flacon, afspoelen met water en plaats deze in een 12-well polystyreen schaaltje. </li></ol> 10. Immunofluorescente Detectie van Gebiotinyleerde Acetyleen Groepen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Blok micropatterned coverslide in DPBS (3% ezel serum) gedurende 1 uur bij KT. Kleuring voor gebiotinyleerde acetyleen groepen met streptavidine-conjugaat 546 (2 ug / ml) in DBP (3% ezel serum in PBS) gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Spoel micropatterned coverslide 5 keer met DPBS gedurende 10 minuten onder zacht schudden. OPMERKING: Figuur 4B toont een beeld van de schuif na deze stap voltooid. </li></ol> 11. Koper-free &quot;Klik&quot; Biotinylatie van Azide Afgebroken PEGMEMA Chains OPMERKING: Indien gewenst, kan dit substraat modificatie stap in situ worden uitgevoerd tijdens de celcultuur. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Verlaat micropatterned coverslide in 12-well polystyrene gerecht volgende DBPs spoelt. </li><li> Voeg 2 ml DBP (of celkweekmedium) bevattende 20 uM DBCO-PEG 4 biotine, en laat de reactie doorgaan gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (of bij 37 ° C in een incubator). </li><li> Na voltooiing, spoel micropatterned coverslide 5 keer met DPBS (of gewoon een media-verandering uit te voeren). </li></ol> 12. Immunofluorescente Detectie van Gebiotinyleerde Azide Groepen <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kleuring voor gebiotinyleerde azide groepen met streptavidine-conjugaat 488 (2 ug / ml) in 2 ml DPBS (3% ezel serum) gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Spoel micropatterned coverslide 5 keer in DPBS gedurende 10 minuten onder zacht schudden. </li><li> Afbeelding micropatterned coverslide middels confocale fluorescentiemicroscoop. Figuur 4A-C toont afbeeldingen van de schuif na deze stap voltooid. OPMERKING: Bij het gebruik van substraten voor weefselkweek assays, sla paragrafen 10 en 12 van dit protocol. Nadat de gewenste degree functionaliseringsgraad, steriliseren de gemanipuleerde coverslide gespoeld beide kanten met 100% ethanol en drogen onder een stikstofstroom. Overdracht van de dia naar een steriele biologische veiligheid kast en spoel de dia met PBS vijfmaal voordat u verder gaat met mobiele zaaien en cultuur. </li></ol>

<ol><li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology%3A+Current+Applications+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li>
<li>Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li>
<li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Pursuit+of+Zero%3A+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li>
<li>Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click%E2%80%9D+Chemistry+by+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Click” Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li>
<li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li>
<li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li>
<li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD%E2%80%94Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li>
<li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li>
<li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Self-Assembled+Monolayers%3A+Efficient%2C+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li>
<li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li>
<li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Fouling%E2%80%9D+Oligo%28ethylene+glycol%29-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li>
<li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li>
<li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).</li>
<li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+robotic+microcontact+printing+%28R-%CE%BCCP%29+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li>
<li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo%28ethylene+glycol%29+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li>
<li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li>
<li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li>
<li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283%2B2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li>
<li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
<li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Ideaal substraten voor tissue engineering zou worden bioinspired en daardoor recapituleren de ruimtelijke verdeling van kritische bioactieve liganden gevonden binnen de cellen. Ook zou bezitten dynamiek die tijdelijke aanpassing van de liganden en de ruimtelijke patronen waarin zij worden aangeboden aan gerichte weefsel morfogenese toe en ruimtelijk beperkte inductie van lot van de cel mogelijk maken. Fabricage van dergelijke substraten vereist het immobiliseren van meerdere biochemische signalen in complexe en zeer geo...

Het vermogen van PEG-geënte oppervlakken covalent gebonden biochemische liganden geven en tegelijkertijd het handhaven van inherent niet-fouling eigenschappen maken ze een ideale keuze voor techniek aangepaste microschaal omgevingen op cultuur substraten 1,2,3. De biospecifieke interacties gemedieerd door ligand geconjugeerd PEG borstels maakt reductionistische analyse van de effecten van biochemische signalen binnen complex in vivo weefsel microenvironments op individuele cel fenotypes. Bovendien kan bio-orthogonaal &quot;click&quot; chemie worden gebruikt om gericht immobilisatie van liganden, zodat zij worden gepresenteerd in natieve conformaties 4-6. Zo microschaal ruimtelijke patronen van PEG borstels is een veelzijdige tool om designer in vitro niches creëren om cell signaling geïnduceerd door geïmmobiliseerd biochemische 6,7 signalen te onderzoeken. Een gebruikelijke methode voor het genereren van ruimtelijke patronen van biochemische cues meebrengt microcontactprinten (μCP) goud gecoate substraten met patronen van PEG geconjugeerde alkaanthiolen. Vervolgens de micropatterned monolaag (SAM) van PEG-ylated alkaanthiolen beperkt fysische adsorptie van biochemische moleculen, zoals eiwitten, alleen zonder patroon gebieden van het substraat 8,9. Echter, de opbrengst van deze techniek SAM&#39;s zijn gevoelig voor oxidatie in lange termijn celcultuur media. Aldus μCP&#39;d alkaanthiol SAMs vaak verder geënt met PEG polymeerborstels met oppervlak geïnitieerde atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie (SI-ATRP) de regio aangroeiloze stabiliteit 10 verhogen. Specifiek μCP van de alkaanthiol polymerisatie-initiator, ω-meraptoundecyl broomisobutyraat op goud gecoate oppervlakken gevolgd door SI ATRP-poly (ethyleenglycol) methyl ether methacrylaat (PEGMEMA) monomeren genereert oppervlakken micropatterned lange termijn stabiele en niet- fouling PEG borstels. Bovendien zijn deze<html> kunnen worden gewijzigd naar aanleiding van diverse chemische eenheden 11 aanwezig. Gebruik te maken van deze eigenschap, Sha et. al. een methode ontwikkeld om de cultuur substraten met meerdere componenten PEGMEMA borstels presenteren orthogonaal &quot;click&quot; chemie engineer. Bij deze werkwijze gebruikt men een reeks μCP / SI-ATRP stappen afgewisseld met sequentiële natriumazide, ethanolamine en propargylamine nucleofiele substituties cultuur substraten presenteren microschaal patronen van meerdere geïmmobiliseerde liganden 6 maken. Terwijl de mogelijkheden van het gebruik van dergelijke chemie in combinatie met handmatige μCP op nieuwe cultuur substraten ingenieur is enorm, wordt beperkt door de precisie en nauwkeurigheid waarmee meerdere μCP stappen kunnen worden uitgelijnd op een enkel substraat. Een hoog niveau van precisie en nauwkeurigheid zou moeten reproduceerbaar vervaardigen complex in vitro nissen met deze veelzijdige technieken. e_content &quot;&gt; Om deze beperking te pakken, zijn er verschillende geautomatiseerde en semi-geautomatiseerde μCP systemen gegenereerd. Chakra et. al. ontwikkelden een μCP systeem waarin aangepaste stempels op een railsysteem worden geplaatst en bracht in conforme contact met goud gecoate dia&#39;s met behulp een computergestuurde pneumatische actuator. Deze werkwijze vereist de precieze fabricage van eigen stempel ontwerpen en meldt 10 micrometer nauwkeurigheid geen melding van de bereikte nauwkeurigheid bij het ​​uitvoeren van meerdere μCP stap 12. Meer recent is een methode waarbij een geïntegreerd kinematische koppelsysteem gemeld precisie dan 1 urn met één patroon, maar konden meerdere patronen nauwkeurig uitlijnen door een gebrek aan nauwkeurige controle stempel functies van matrijs vormen 13. Bovendien beide vorige methoden vereisen het substraat vast blijven tussen patroonvorming stappen waardoor aanzienlijk beperken van de diversiteit van oppervlaktemodificatie chemie die kunnen wordengebruikt. Hier beschrijven we een geautomatiseerde R-μCP systeem dat in staat accurate en nauwkeurige uitlijning van meerdere μCP stappen terwijl het toestaan ​​van maximale flexibiliteit in het stempel ontwerp en fabricage. Bovendien kan de gevormde substraten herhaaldelijk worden verwijderd uit het systeem van stampen, waarbij het gebruik van diverse substraat wijziging verbindingen, inclusief opeenvolgende nucleofiele substituties toelaat. Substraten ontwikkeld die dergelijke chemie zijn gebruikt voor celkweek eerder door zowel ons 6,14 en 7 anderen. Zo hebben we R-μCP en sequentiële nucleofiele substitutiereacties samengevoegd tot een werkwijze voor schaalbare vervaardiging van cultuur substraten met complexe en micropatterned biochemische signalen ontwikkelen.

<table><tbody><tr><td>SCARA&nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Higher end modellen met verhoogde precisie zijn beschikbaar indien gewenst.&nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>VOORZICHT, Alleen te hanteren in een chemisch afzuigkap. Wanneer wafers worden silanized mag niemand de kap betreden totdat alle slaan is verdampt.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Thoroughly degasse oplossingen via vacuüm blootstelling vóór gebruik. Alternatieve kits zoals Kit 182 zijn acceptabel.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>Deze kunnen worden gekocht bij een aantal leveranciers met verschillende afmetingen om aan de behoefte te voldoen.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Vereist gespecialiseerde training.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Opslaan bij -20 &deg;C. Andere ATRP initiatieven kunnen worden gebruikt, aangezien dit R-&mu;CP platform van toepassing is op alle micropatterning modaliteiten.&nbsp;</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Vereist rubberen stoppen met diaphram.</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Verstuurd met MEHQ en BHT vrije radicale remmers.</td></tr><tr><td>Methanol (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Copper(II) Bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>VOORZICHT, beperk de blootstelling met een chirurgisch masker.</td></tr><tr><td>2,2'-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>VOORZICHT, beperk de blootstelling met een chirurgisch masker.</td></tr><tr><td>Sodium L-Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>VOORZICHT, beperk de blootstelling met een chirurgisch masker.</td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>VOORZICHT, alleen hanteren in chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Gesolubiliseerd in DMF</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>VOORZICHT, beperk de blootstelling met een chirurgisch masker.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Donkey serum verontreinigde items worden beschouwd als biologisch gevaarlijk materiaal en moeten dienovereenkomstig worden weggegooid. Diverse andere verbindingen (bijv. BSA) zijn beschikbaar en dienen dit doel.</td></tr><tr><td>12-Well Polystyrene Plate</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Platen kunnen worden gekocht bij een aantal leveranciers met verschillende afmetingen.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Gesolubiliseerd in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Gesolubiliseerd in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Gesolubiliseerd in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>Een epifluorescente microscoop is voldoende om gefunctionaliseerde microgepatternde substraten te beeldvormen.</td></tr></tbody></table>

fabriceren complex cultuur substrates behulp robotic microcontact printing (r-μcp) en sequential nucleofiele substitutie

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In de weefselengineering is het wenselijk om ruimtelijke controle over weefselmorfologie en celbestemming in cultuur op microschaal te vertonen. Cultuursubstraten met gegrefde poly(ethyleenglycol) (PEG) borstels kunnen worden gebruikt om deze taak te bereiken door microschaal, niet-aanhechtende en celhechtingsresistente gebieden te creëren, evenals gebieden waar cellen deelnemen aan biospecifieke interacties met covalent aangebrachte liganden. Om complexe weefsels te ontwikkelen met behulp van dergelijke substraten, zal het nodig zijn om meerdere PEG-borstels sequentieel te patrouilleren, functioneel gemaakt om differentiële bioactiviteiten te verlenen en uitgelijnd in microschaal oriëntaties die in vivo niches nabootsen. Microcontact printen (μCP) is een veelzijdige techniek om dergelijke gegrefde PEG-borstels te patrouilleren, maar handmatig μCP kan niet met microschaal precisie worden uitgevoerd. Daarom hebben we geavanceerde robotica gecombineerd met soft-lithografietechnieken en opkomende oppervlaktechemische reacties om een robotgestuurde microcontact printen (R-μCP)-geassisteerde methode te ontwikkelen voor het fabriceren van cultuursubstraten met complexe, microschaal en zeer geordende patronen van PEG-borstels die orthogonale ‘klik’ chemieën presenteren. Hier beschrijven we in detail de workflow om dergelijke substraten te fabriceren.

Het gebruik van handmatige aanpassing μCP technieken cultuur substraten met arrays van PEG-geënte borstels gefunctionaliseerd met orthogonale engineering &quot;klik&quot; chemie is in voorafgaand werk 6. Dit biedt echter weinig controle patroon oriëntatie en vaak resulteert in overlap van gefunctionaliseerde gebieden. Hier wordt een nieuw R-μCP systeem om deze beperking te overwinnen, en het accuraat patroon een reeks PEG borstel annuli 300 urn en 600 urn ID OD presenteren eindstandige alkyngroepen in een afz...

Celcultuur substraten die gefunctionaliseerd zijn met microscopische patronen van biologische liganden hebben een immense bruikbaarheid op het gebied van weefselengineering. Hier demonstreren we de veelzijdige en geautomatiseerde productie van celcultuur substraten met meerdere, microgepatteerde poly(ethyleenglycol) borstels die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken.

Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om weefselkweeksubstraten te genereren met meerdere micropatroon PEG-borstels, die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken. Dit wordt bereikt door arrays van acan thiol, een TRP-initiator, door middel van een robotische microcontactbedrukking op goud gecoate substraten af te zetten. Als tweede stap wordt SI, een TRP uitgevoerd op de micropatroonsubstraten, wat PEG-borstels met terminale broomgroepen genereert.Vervolgens worden de terminale broomgroepen gefunctionaliseerd met een of twee chemisch reactieve groepen om IM-mobilisatie van geschikt voorbereide biologische liganden mogelijk te maken. Vervolgens wordt het hele proces herhaald om te functionaliseren met een tweede chemische groep. De resultaten tonen microarrays van twee orthogonaal gefunctioneerde, PEG-borstels gesuperponeerd met een nauwkeurigheid van 10 micron.Dit wordt geverifieerd met behulp van aangepaste beeldanalysesoftware na conjugatie van de reactieve groepen met fluorescente moleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van methoden zoals handmatige microcontactbedrukking is dat robotische microcontactbedrukking in staat is om meerdere bedrukkingsstappen met micronauwkeurigheid te superponeren, terwijl ook maximale flexibiliteit en substraatontwerp mogelijk is. De nauwkeurigheid die door deze methode wordt geboden, gekoppeld aan sequentiële nucleofiele substitutiereacties, stelt ons in staat om weefselkweeksubstraten te genereren die zijn gefunctionaliseerd met meerdere biologische liganden die vervolgens in staat zijn om temporele en ruimtelijke controle van sulfaat op micrometerschaal uit te oefenen.Voor S-I-A-T-R-P moet een goud gecoate dekglasplaat zijn gepatroon door een A-P-D-M-S stempel. Deze relatief gebruikelijke procedure wordt uitgelegd in een tekstprotocol. Begin met het verwijderen van de gepatenteerde dekglasplaat uit de robot door de vacuüm los te laten.Breng het vervolgens over naar een flacon met een lengte van 50 ml, sluit de flacon en breng een negatieve vacuüm van 30 PSI aan. Voeg vervolgens 5,5 milliliter van een A TRP-reactiemengsel toe aan de flacon met een spuit, gevolgd door het toevoegen van 0,5 milliliter L-natriumascorbinezuur in water, ook via een spuit. Observeer dat de reactie van kleur verandert van lichtgroen naar donkerbruin.Laat de reactie 16 uur onder inert gas doorgaan. Wanneer de reactie voltooid is, verwijdert u de dekglasplaat en spoelt u deze af met ethanol, vervolgens met water en opnieuw met ethanol. Droog het vervolgens voorzichtig af met stikstof.De microarray van geënte P-E-G-M-E-M-A-borstels zou zichtbaar moeten zijn voor het blote oog. Gebruik microscopie om deze veranderingen in detail te onthullen om Azad te functionaliseren, de P-E-G-M-E-M-A-ketens. Breng de patroondekglasplaat over naar een glazen reactiefles van 20 ml en voeg zes ml DMF toe met 100 millimolair natriumaziet.Laat de reactie 24 uur bij 37 graden Celsius doorgaan. Was de volgende dag de gepatenteerde dekglasplaat met ethanol en droog hem af onder een zachte stikstofstroom om de resterende broomgefunctionaliseerde P-E-G-M-E-M-A-ketens te kalmeren. Breng de micropatroondekglasplaat over naar een glazen reactiefles van 20 ml en voeg zes ml DMSO toe met 100 millimolair ethanolamine en 300 millimolair triethylamine.Laat deze reactie 24 uur bij 40 graden Celsius doorgaan de volgende dag. Was de patroondekglasplaat met ethanol en droog hem voorzichtig af onder een stikstofstroom. De volgende stap is om de robotmicrocontactbedrukking te herhalen met behulp van een tweede PDMS-stempel en volgende stempelen.Gebruik SI A TRP opnieuw om de tweede microarray PEG-borstel te tekenen. Dan is het tijd om de tweede microarray P-E-G-M-E-A-ketens van Francois te acetyleenfunctionaliseren. De micropatroondek.Plaats in een glazen reactiefles van 20 ml met zes milliliter 100 millimolair propagamine in DMF. Laat de reactie 24 uur doorgaan. Was de volgende dag op kamertemperatuur de gepatenteerde dekglasplaat met ethanol en droog onder een zachte stikstofstroom.De gepatenteerde dekglasplaat is vervolgens klaar voor biotin-elatatie. Begin door de micropatroondekglasplaat in een glazen reactiefles van 20 ml te plaatsen. Eerst, biotinate de acetyleenbeëindigde ketens.Voeg zes milliliter kopersulfaat toe met het azide PEG vier biotin-conjugaat aan de reactiefles, gevolgd door 1,2 milliliter van 0,15. Millimolair rbic-zuur in water om de reactie te initialiseren, bebbel de reactie gedurende 10 seconden met stikstof. Vervolgens verzegel de fles met paraform en laat de reactie 24 uur doorgaan.Was de volgende dag op kamertemperatuur de dekglasplaat met water en breng deze over naar een 12-wels polystyreenschaal. Vervolgens op kamertemperatuur bij DPBS met ezelsserum gedurende een uur een uur later, kleuren in de biotin-elateerde groepen met strep DEIN 5 46-conjugaat bij twee microgram per milliliter in DPBS gedurende twee uur bij kamertemperatuur twee uur later. Was de dekglasplaat in DPBS vijf keer met zachte vegetatie.Tobi ITIN aate de azi-beëindigde ketens. Plaats de dekglashoepel in een wel van een zes-wels polystyreenplaat en breng twee milliliter DPBS aan met 20 micromolair D-B-C-O-P-G vier biotin. Breng vervolgens de dekglasplaat gedurende 24 uur bij kamertemperatuur onder incubatie gedurende 24 uur later.Was de dekglasplaat zoals eerder vier en kleuren het met streptavidin 4 88. Conjugaat bij twee microgram per milliliter in DPBS. Twee uur later.Was de dekglasplaat opnieuw, en beeld het af met microscopie. Met behulp van dit robotmicrocontactbedrukkingsprotocol. Een nauwkeurig gepatroond array van PEG-borstel ANN UI met terminale alkin-groepen werd gepatroon binnen een afzonderlijk array van grote

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

In dit artikel wordt een hoge doorvoer methode voorgesteld voor de synthese van Oligosacchariden en de bevestiging aan het oppervlak van polyanhydride nanodeeltjes voor verder gebruik in voor specifieke receptoren op antigeen-presenterende cellen.

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

CRISPR / Cas systemen bemiddelen adaptieve immuniteit in Bacteria en Archaea. Veel Cas eiwitten worden voorgesteld om op te treden als endoribonucleases handelen crRNA voorlopers van verschillende lengte. Hier illustreren we drie verschillende benaderingen voor uw crRNA substraten voor de biochemische analyse van Cas endonuclease activiteit te genereren.

Substraat Generatie voor endonucleasen van CRISPR / Cas Systems

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

In dit artikel presenteren en bespreken we nieuwe ontwikkelingen in de synthese en toepassingen van nucleïnezuur micro arrays die in situ zijn gefabriceerd. Concreet laten we zien hoe de protocollen voor DNA-synthese kunnen worden uitgebreid naar RNA en hoe micro arrays kunnen worden gebruikt om opvraagbaar nucleïnezuur bibliotheken te creëren.

High-density DNA en RNA micro arrays-Photolithografische synthese, hybridisatie en voorbereiding van grote nucleïnezuur bibliotheken

Hier beschrijven we een protocol om discrete en nauwkeurige anorganische nanostructuren op substraten te maken met behulp van DNA-origami vormen als leidende templates. De methode wordt aangetoond door het creëren van plasmonic gouden bowtie-vormige antennes op een transparante ondergrond (Sapphire).

DNA origami-gemedieerde substraat nano-Atterning van anorganische structuren voor sensing toepassingen

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn noodzakelijk voor het ontwerp van nieuwe genetische circuits. Hier beschrijven we een kosteneffectieve, high-throughput methode voor het snel karakteriseren van genetische delen. Onze methode vermindert kosten en tijd door celvrije lysaten, lineair DNA om klonen te voorkomen en akoestische vloeistofverwerking te combineren om de doorvoer te verhogen en reactievolumes te verminderen.

Snelle karakterisering van genetische delen met celvrije systemen

3D-printen op micrometerschaal maakt snelle prototyping mogelijk van polymere apparaten voor neuronale celculturen. Als proof-of-principle werden structurele verbindingen tussen neuronen beperkt door barrières en kanalen te creëren die de uitgroei van neurieten beïnvloedden, terwijl de functionele gevolgen van dergelijke manipulatie werden waargenomen door extracellulaire elektrofysiologie.

Twee-foton polymerisatie 3D-printen van neuronale celkweekapparaten op microschaal

Leer het fabriceren van complexe weefselkweeksubstraten met micropatronen van PEG-borstels via robotische microcontactprinten. Deze methode maakt ruimtelijk nauwkeurige immobilisatie van biologische liganden mogelijk.

Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie

Meer video's verkennen