Fabriceren Complex Cultuur Substrates behulp Robotic Microcontact Printing (R-μCP) en Sequential Nucleofiele Substitutie
31 oktober 2014
Celcultuur substraten die gefunctionaliseerd zijn met microscopische patronen van biologische liganden hebben een immense bruikbaarheid op het gebied van weefselengineering. Hier demonstreren we de veelzijdige en geautomatiseerde productie van celcultuur substraten met meerdere, microgepatteerde poly(ethyleenglycol) borstels die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken.
Het algemene doel van het volgende experiment is om weefselkweeksubstraten te genereren met meerdere micropatroon PEG-borstels, die orthogonale chemieën presenteren die ruimtelijk nauwkeurige en locatiespecifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk maken. Dit wordt bereikt door arrays van acan thiol, een TRP-initiator, door middel van een robotische microcontactbedrukking op goud gecoate substraten af te zetten. Als tweede stap wordt SI, een TRP uitgevoerd op de micropatroonsubstraten, wat PEG-borstels met terminale broomgroepen genereert.
Vervolgens worden de terminale broomgroepen gefunctionaliseerd met een of twee chemisch reactieve groepen om IM-mobilisatie van geschikt voorbereide biologische liganden mogelijk te maken. Vervolgens wordt het hele proces herhaald om te functionaliseren met een tweede chemische groep. De resultaten tonen microarrays van twee orthogonaal gefunctioneerde, PEG-borstels gesuperponeerd met een nauwkeurigheid van 10 micron.
Dit wordt geverifieerd met behulp van aangepaste beeldanalysesoftware na conjugatie van de reactieve groepen met fluorescente moleculen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van methoden zoals handmatige microcontactbedrukking is dat robotische microcontactbedrukking in staat is om meerdere bedrukkingsstappen met micronauwkeurigheid te superponeren, terwijl ook maximale flexibiliteit en substraatontwerp mogelijk is. De nauwkeurigheid die door deze methode wordt geboden, gekoppeld aan sequentiële nucleofiele substitutiereacties, stelt ons in staat om weefselkweeksubstraten te genereren die zijn gefunctionaliseerd met meerdere biologische liganden die vervolgens in staat zijn om temporele en ruimtelijke controle van sulfaat op micrometerschaal uit te oefenen.
Voor S-I-A-T-R-P moet een goud gecoate dekglasplaat zijn gepatroon door een A-P-D-M-S stempel. Deze relatief gebruikelijke procedure wordt uitgelegd in een tekstprotocol. Begin met het verwijderen van de gepatenteerde dekglasplaat uit de robot door de vacuüm los te laten.
Breng het vervolgens over naar een flacon met een lengte van 50 ml, sluit de flacon en breng een negatieve vacuüm van 30 PSI aan. Voeg vervolgens 5,5 milliliter van een A TRP-reactiemengsel toe aan de flacon met een spuit, gevolgd door het toevoegen van 0,5 milliliter L-natriumascorbinezuur in water, ook via een spuit. Observeer dat de reactie van kleur verandert van lichtgroen naar donkerbruin.
Laat de reactie 16 uur onder inert gas doorgaan. Wanneer de reactie voltooid is, verwijdert u de dekglasplaat en spoelt u deze af met ethanol, vervolgens met water en opnieuw met ethanol. Droog het vervolgens voorzichtig af met stikstof.
De microarray van geënte P-E-G-M-E-M-A-borstels zou zichtbaar moeten zijn voor het blote oog. Gebruik microscopie om deze veranderingen in detail te onthullen om Azad te functionaliseren, de P-E-G-M-E-M-A-ketens. Breng de patroondekglasplaat over naar een glazen reactiefles van 20 ml en voeg zes ml DMF toe met 100 millimolair natriumaziet.
Laat de reactie 24 uur bij 37 graden Celsius doorgaan. Was de volgende dag de gepatenteerde dekglasplaat met ethanol en droog hem af onder een zachte stikstofstroom om de resterende broomgefunctionaliseerde P-E-G-M-E-M-A-ketens te kalmeren. Breng de micropatroondekglasplaat over naar een glazen reactiefles van 20 ml en voeg zes ml DMSO toe met 100 millimolair ethanolamine en 300 millimolair triethylamine.
Laat deze reactie 24 uur bij 40 graden Celsius doorgaan de volgende dag. Was de patroondekglasplaat met ethanol en droog hem voorzichtig af onder een stikstofstroom. De volgende stap is om de robotmicrocontactbedrukking te herhalen met behulp van een tweede PDMS-stempel en volgende stempelen.
Gebruik SI A TRP opnieuw om de tweede microarray PEG-borstel te tekenen. Dan is het tijd om de tweede microarray P-E-G-M-E-A-ketens van Francois te acetyleenfunctionaliseren. De micropatroondek.
Plaats in een glazen reactiefles van 20 ml met zes milliliter 100 millimolair propagamine in DMF. Laat de reactie 24 uur doorgaan. Was de volgende dag op kamertemperatuur de gepatenteerde dekglasplaat met ethanol en droog onder een zachte stikstofstroom.
De gepatenteerde dekglasplaat is vervolgens klaar voor biotin-elatatie. Begin door de micropatroondekglasplaat in een glazen reactiefles van 20 ml te plaatsen. Eerst, biotinate de acetyleenbeëindigde ketens.
Voeg zes milliliter kopersulfaat toe met het azide PEG vier biotin-conjugaat aan de reactiefles, gevolgd door 1,2 milliliter van 0,15. Millimolair rbic-zuur in water om de reactie te initialiseren, bebbel de reactie gedurende 10 seconden met stikstof. Vervolgens verzegel de fles met paraform en laat de reactie 24 uur doorgaan.
Was de volgende dag op kamertemperatuur de dekglasplaat met water en breng deze over naar een 12-wels polystyreenschaal. Vervolgens op kamertemperatuur bij DPBS met ezelsserum gedurende een uur een uur later, kleuren in de biotin-elateerde groepen met strep DEIN 5 46-conjugaat bij twee microgram per milliliter in DPBS gedurende twee uur bij kamertemperatuur twee uur later. Was de dekglasplaat in DPBS vijf keer met zachte vegetatie.
Tobi ITIN aate de azi-beëindigde ketens. Plaats de dekglashoepel in een wel van een zes-wels polystyreenplaat en breng twee milliliter DPBS aan met 20 micromolair D-B-C-O-P-G vier biotin. Breng vervolgens de dekglasplaat gedurende 24 uur bij kamertemperatuur onder incubatie gedurende 24 uur later.
Was de dekglasplaat zoals eerder vier en kleuren het met streptavidin 4 88. Conjugaat bij twee microgram per milliliter in DPBS. Twee uur later.
Was de dekglasplaat opnieuw, en beeld het af met microscopie. Met behulp van dit robotmicrocontactbedrukkingsprotocol. Een nauwkeurig gepatroond array van PEG-borstel ANN UI met terminale alkin-groepen werd gepatroon binnen een afzonderlijk array van grote
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie toont de geautomatiseerde fabricage van weefselkweeksubstraten met microgepatternde poly(ethyleenglycol) (PEG) borstels. Deze borstels presenteren orthogonale chemieën die de ruimtelijk precieze en locatie-specifieke immobilisatie van biologische liganden vergemakkelijken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Weefselengineering
- Biomaterialen
- Microfabricage
Achtergrond
- Celkweeksubstraten zijn essentieel voor weefselengineeringtoepassingen.
- Micropatterning staat nauwkeurige controle over ligandpresentatie toe.
- PEG borstels zijn veelzijdige materialen voor functionalisering.
- Orthogonale chemieën maken complexe oppervlaktemodificaties mogelijk.
Doel van de studie
- Om weefselkweeksubstraten met meerdere micro-gepatternde PEG borstels te creëren.
- Om locatie-specifieke immobilisatie van biologische liganden mogelijk te maken.
- Om de automatisering van het fabricageproces te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Robotische micro contact printing van acan thiol op goud-gecoate substraten.
- Sequentiële oppervlakte-geïnitieerde atoomtransfer radicale polymerisatie (SI-ATRP) om PEG borstels te genereren.
- Functionalisering van terminale broomgroepen met reactieve chemische groepen.
- Herhaling van het proces om dubbele functionalisering te bereiken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van microarrays met twee orthogonaal functionele PEG borstels.
- Bereikte superimpositienauwkeurigheid van 10 micrometer.
- Aangetoonde veelzijdigheid in substraatfunctionalisering.
- Ruimtelijk nauwkeurige ligand immobilisatie mogelijk gemaakt.
Conclusies
- De methode staat complexe oppervlaktemodificaties in weefselengineering toe.
- Geautomatiseerde processen verbeteren reproduceerbaarheid en efficiëntie.
- Mogelijke toepassingen in verschillende biologische onderzoeksvelden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robotic microcontact printing (R-µCP) with sequential nucleophilic substitution enables the fabrication of culture substrates with highly ordered, micron-scale patterns of orthogonally functionalized PEG brushes. This precision supports spatially controlled ligand immobilization, directly impacting early discovery and target validation workflows in tissue engineering and advanced cell models. The method's reproducibility and alignment accuracy address critical needs for predictive confidence and translational continuity in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-matrix interactions with spatially defined ligand presentation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing precise control of microenvironmental cues.
- Facilitates functional target validation through site-specific immobilization of biological ligands.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible substrates for downstream cell-based assays.
- Delivers quantitative, spatially resolved outputs for compound or ligand screening.
- Enables scalable and reusable platform design for high-content screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro substrate architecture with in vivo tissue microenvironments for disease-relevant modeling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling complex tissue engineering.
- Provides predictive de-risking for biomaterial and cell therapy development pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery, assay development, and translational research, enabling seamless progression from hypothesis testing to preclinical model validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of cell behavior in engineered microenvironments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing ligand or compound effects.
- Analytics: Supports high-resolution imaging and quantitative analysis of spatial patterning and ligand immobilization.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo relevance by mimicking tissue-specific architectures.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse R&D programs requiring spatially controlled substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, micron-scale alignment, and flexible substrate design.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue engineering and cell therapy assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, robotics, and microfabrication techniques.
- Demands access to robotic microcontact printing instrumentation and imaging analytics.
- Necessitates cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different cell types or ligand chemistries.
- Micron-scale alignment is limited by the precision of robotic and imaging systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Surface-initiated Atom Transfer Radical Polymerization (SI-ATRP) of PEGMEMA
3:15
Functionalization of Micropatterned PEGMEMA Chains
5:11
"Click" Biotinylation of PEGMEMA Chains Including Staining
7:10
Results: System Accuracy
7:57
Conclusion
