Name: High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer een hoogdoorvoer fluorometrische methode voor het kwantificeren van fagocytose en actinepolymerisatie in macrofaagcellijnen. Deze techniek biedt een kosteneffectieve analyse voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de volgende financieringsbronnen bedanken: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (aan S.R) en F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (aan J.N.).

OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt voor meerdere toepassingen zoals kwantificering van fagocytose en actine polymerisatie zoals toegepast in onze eerder gepubliceerde werk 12. Het protocol leent zich voor verschillende wijzigingen, en tabel 1 staan ​​celtypes en deeltjes met succes gebruikt in eerdere studies. Standaard gebruik van dit protocol voor de kwantificering van fagocytose of actine polymerisatie wordt weergegeven in grafiek 1. <img alt="Diagram 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> Diagram 1:. Schema van fluorometrische assay voor het kwantificeren van fagocytose en actine polymerisatie Nadat de cellen geplateerd, behandeld, en liet hechten, partikels gelabeld met groene fluorescentie (FITC) worden toegevoegd aan de cellen voor fagocytose. De reactie wordt gestopt door trypan of antibiotic wash (voor niet-geïnternaliseerde deeltjes te elimineren) en fixatie wordt uitgevoerd met 4% paraformaldehyde. De cellen worden vervolgens gekleurd met rode fluorescerende actine label (rodamine phalloidin) en blauw fluorescent label (DAPI). Indexen van de fagocytose en actine polymerisatie worden gekwantificeerd als een verhouding van relatieve fluorescentie-eenheden van groen / blauw (FITC / DAPI), of rood / blauw (rodamine / DAPI) fluorescentie. 1. Plating en behandelen van Cellen LET OP: Voordat u begint, overweeg dan het uitvoeren van de behandelingen met minstens 4 technische herhalingen, en omvatten de volgende controles in de plaat lay-out: alleen cellen (ongekleurd, met DAPI alleen of rodamine alleen) alleen en deeltje. <ol><li> Voer alle toevoeging van reagentia in stappen 1-4 in een steriele celkweek kap om de monsters te beschermen tegen vervuiling. </li><li> Plate macrofagen (muizen J774 cellijn) in een 96-putjes plaat bij 5/1 x 10 4 cellen in 50 ul (per putje)<html> van aangevuld voorverwarmde media. Ideaal platen voor deze methode zwarte 96-putjesplaten met heldere of zwarte bodems, afhankelijk lezer mogelijkheden. <ol><li> Voor aangevuld medium gebruikt 10% warmte geïnactiveerd FBS interferentie van complement cascade voorkomen, en 1% penicilline / streptomycine (wanneer geen levende bacteriën fagocytose). Bij gebruik van hechtende cellen staan ​​1-2 uur hechting, en voor niet-hechtende cellen, het afsluiten van de plaat met cellen gedurende 10 min bij 500 x g. </li></ol></li><li> Voeg gewenste agonisten / antagonisten of het voertuig op 2x concentratie (opnieuw gesuspendeerd in PBS of met meer voorkeur, in aangevuld medium) in 50 ul van een eindvolume van 100 pl (1x) en incubeer gedurende een gewenste tijd. Meerkanaalspipet en reagentiareservoirs zal snelste verwerking te vergemakkelijken. </li></ol> 2. opsonisatie van fluorescerende deeltjes ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Tabel 1: Getest celtypes en fluorescerende deeltjes in fluorometrische analyse van fagocytose en actine polymerisatie Tabel 1 illustreert combinaties van celtypen (cellijnen en primaire cellen) dat onze groep die via de fluorometrische methode.. Anders dan kijken fagocytose en actine polymerisatie door wild-type cellen, hebben we ook gebruikt sommige van deze deeltjes voor het onderzoek van fagocytose door getransfecteerde cellen die GFP (groen fluorescent eiwit). Fluorescentie van de cellen getransfecteerd met plasmiden die fluorescente reporters kan worden gebruikt als een cellulaire marker naast DAPI Tabel legende:. A - actine polymerisatie; P - fagocytose; PT - fagocytose door GFP gemerkte getransfecteerde cellen; OPDex - opsonized dextran kraal; HKOP - hitte gedood opsonized. <ol><li> Zorg ervoor dat fluorescerende deeltjes en labels worden beschermd tegen het licht te allen tijde, during verwerking, wassen, evenals tijdens de incubatie om te voorkomen fotobleken <ol><li> Voor de droge deeltjes, wegen uit fluorescerende hitte gedood opsonized (HKOP) bacteriën (E2861: E. coli K-12 stam), met behulp van de specificaties van de fabrikant. Zorg ervoor dat de massa rekeningen is 10: 1 - 20: 1 bacteriën: celverhouding (of ten minste 10: 1 verhouding - gewoonlijk in kwantificering van fagocytose) 13,14. Aantal deeltjes kunnen door de fabrikant of bepaald via couting seriële verdunningen van 1 mg / ml voorraadoplossing. </li><li> Resuspendeer in 50 ul PBS en vortex gedurende 1 minuut op de hoogste instelling. Zorg voor een goede vortexen (hier en in het protocol) als de deeltjes de neiging te aggregeren die werkzaamheid van opsonisatie kunnen beïnvloeden. </li><li> Voor deeltjes in suspensie zoals fluorescent gelabelde dextran kralen (DEX kralen), vortex de voorraadoplossing gedurende 1 min, neem 50 pl suspensie of afhankelijk van de kraal concentratie in het volume d1 kraal:: etermine mount van kralen om 10 te vergemakkelijken cel ratio. </li></ol></li><li> Voeg een gelijk volume van het opsoniserende reagens aan de deeltjes en krachtig vortex nog een minuut. </li><li> Incubeer de deeltjes met opsoniserende reagens bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na de incubatie, centrifuge de deeltjes gedurende 5 min bij 500 xg en verwijder het supernatant die een overmaat opsoniserende reagens. Was de deeltjes door het toevoegen van 100 ul PBS, vortex de pellet en centrifugaat mengen gedurende 5 minuten bij 500 x g. <ol><li> Herhaal deze stappen twee keer om een ​​goede opsonisatie en verwijdering van ongebonden antilichaam te verzekeren. </li></ol></li><li> De werkoplossing van opsonized deeltjes door resuspenderen in 5 ml medium (voldoende voor een 96-well plaat) en uit de buurt van licht tot toevoeging aan de cellen. </li></ol> 3. Fagocytose <ol><li> Plaats de werkoplossing van deeltjes in een steriele reagensreservoir. Vanaf hier, voeg 5056; l opsonized deeltjes de volgens stap 1 (een eindconcentratie van 50 ng / ml) cellen en laat fagocytose optreedt bij standaard celkweekomstandigheden. Hieronder afgebeeld zijn twee methoden van fagocytose, die kan worden bepaald met behulp van deze methode (diagram 2). </li></ol><img alt="Diagram 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> Diagram 2. Vergelijking van versus continu synchroniseren fagocytose Continue fagocytose geeft continue internalisatie deeltjes tijd als ze langzaam de cellen op de bodem van de put bereikt. Een contrasterende synchronisatie stap (centrifugeren) dwingt de deeltjes bezinken, waarmee de deeltjes contact met de cel, en leiden tot onmiddellijke internalisatie door de cellen. Gesynchroniseerd fagocytose is een sneller proces dat sneller internaliseert deelicles vanwege de verhoogde cel: deeltje contact. <ol><li><ol><li> Voor de continue fagocytose methode (schema 2) waarmee cellen voortdurend fagocyteren opsonized bacteriën ze langzaam zinken naar de bodem en in contact komen met cellen, gebruik langere frames om de bacteriën aan de bodem van de put te bereiken en in raken met de cellen. Bij het uitvoeren van een tijdsverloop experiment bacteriën toe te voegen op verschillende tijdsintervallen en stop het gehele bord reacties tegelijkertijd de verwerkingssnelheid te vergroten. </li><li> Voor de gesynchroniseerde fagocytose methode (schema 2) dat deeltjes verbetert: celcontact via centrifugatie, het afsluiten van de gehele plaat met cellen en deeltjes (5 min bij 500 xg) zodra de deeltjes toegevoegd, om synchronisatie van alle tijdstippen vergemakkelijken en celinteractie: om het deeltje te versnellen. <ol><li> Meet het tijdsverloop begint direct na de voltooiing van de Centrifugation stap. Bij het uitvoeren van een tijdsverloop experiment stop elk tijdstip onafhankelijk verschillende tijdsintervallen zoals hieronder beschreven. </li></ol></li></ol></li></ol> OPMERKING: De gesynchroniseerde fagocytose methode iets omslachtiger dan de vorige, maar geeft hogere fagocytose index in een kortere tijd. 4. Stoppen Fagocytose <ol><li> Voor hechtende cellen, verwijder het supernatant en voeg 50 pl verdund trypan blauw met PBS (1: 2 verdunning), teneinde fluorescentie van niet-geïnternaliseerde bacteriën blussen. </li><li> Voor niet-hechtende cellen, spin down de plaat en verwijder supernatant. Voeg 50 ul van de verwaterde trypaanblauw. Controleer aan de plaat (5-10 min bij 500 xg) tussen elke wassing gecentrifugeerd om de cel te minimaliseren en mogelijk voldoende wassen. </li><li> Na trypan incubatie, wassen cellen tweemaal met PBS om resten trypan verwijderen (tot de PBS uit de put verwijderd wordt helder). Trypan is aangetoond 15,16 fluorescentie van niet-geïnternaliseerde fluorescent gemerkte, hitte gedode, bacteriële deeltjes doven, maar niet levende bacteriën of OPDex kralen. Voor levende bacteriën, zijn voorzien van een wasbeurt met antibiotica zoals penicilline, streptomycine, of gentamicine in plaats van de trypaan wassen om verstorende effecten van de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde deeltjes te voorkomen. </li><li> Bevestig cellen met 100 pl 4% paraformaldehyde, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, daarna wassen met PBS (100 ul per putje per wasbeurt). Bij deze stap sparen de cellen bij 4 ° C gedurende maximaal een week, of direct doorgaan naar kleuring en kwantificering. OPMERKING: Alle volgende stappen vormen dit punt voorwoord kan buiten de celkweek kap worden gedaan. </li><li> Verwijder alle vloeibare en voeg 50 ul van DAPI bij 5 ng / ml gereconstitueerd in PBS. Laat 5 min voor het kleuren, en dan twee keer wassen met PBS. Na de wasstap, voeg 50 ul van PBS aan elk putje en opnemen fagocytose. </li&gt; </ol> 5. actinekleuring OPMERKING: Naast fagocytose zullen fluorometrische wijze kwantificeren actine polymerisatie mogelijk door het meten van de intensiteit van actine, die in remming van lamellipodia, pseudopodiae verminderd en membraan plooien als gevolg van een behandeling met een remmer (figuur 1A). Deze stap is optioneel indien geïnteresseerd in kwantificering van actine polymerisatie naast fagocytose. Als actine polymerisatie is het uiteindelijke doel, met fluorescerende deeltjes voor fagocytose is optioneel. <ol><li> Volgende paraformaldehyde fixatie (stap 4.3), was de plaat tweemaal met PBS bij 100 ul per putje voor elke wasbeurt. Voeg 50 pl 0,1% Triton X-100 in PBS permeabilisatie en incubeer gedurende -5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel 0,1% Triton X-100 2 maal met PBS (zoals hierboven), en blok met 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 20 min niet-specifieke binding van de labe te vermijdenl. </li><li> Naar aanleiding van het blokkeren, verwijdert u de BSA-oplossing en voeg onmiddellijk rodamine phalloidin. De werkende oplossing van rhodamine vlek bereiden, gebruik 100 ul methaanzuur oplossing (geleverd door de fabrikant) in 5 ml PBS (voldoende voor één plaat). Uit de werkoplossing voeg 50 ul per putje en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: De stappen wassen en DAPI kleuring als in stap 4.4 cellen zal klaar zijn voor kwantificering zijn. </li></ol> 6. Kwantificering <ol><li> Om de fagocytose met behulp van een fluorescerende plaat lezer, opnemen groene fluorescentie behulp excitatiefilter bij λ = 488 nm en emissie-filter te kwantificeren bij λ = 518 nm, en een blauwe fluorescentie behulp excitatiefilter bij λ = 355 nm en emissie filter bij λ = 460 nm. </li><li> Aan de actine polymerisatie met behulp van een fluorescerende plaat lezer, opnemen blauwe fluorescentie te kwantificeren via λ = 355 nm en λ = 460 nm (zoals hierboven), en rode grieporescence via excitatiefilter bij λ = 584 nm en emissie filter λ = 620 nm. OPMERKING: Orbital of centrale detectie is aanvaardbaar voor opname. Sommige celtypen verzamelen meer naar de rand van de put dan het midden, waarbij orbitale registratie van voordeel zijn. In het bijzonder zou gemiddeld drie punten rond de baan ook gebruikt worden om nauwkeurigere resultaten te verkrijgen. </li><li> Verdeel het totale RFU van groene of rode fluorescentie met blauwe fluorescentie uitlezing (van DAPI), afhankelijk van het deeltje etiket of fagocytische versus actine kwantificering (Figuur 1). Vanwege de hoge plate-to-plate variantie Gebruik relatieve indexen (bijvoorbeeld ten opzichte van t = 0 control), optimaal illustreren tendensen en trouwbaarheid vergemakkelijken. </li></ol>

<ol><li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurphy%2C+K+%22Janeway%27s+Immunobiology%22">Janeway's Immunobiology</a>. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).</li>
<li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+Of+Bone+And+Joint+Surgery.+British+Volume%22%5BJournal%5D)">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633(2013).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621(2012).</li>
<li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development%2C+stress+response%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li>
<li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li>
<li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li>
<li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory%2C+GM-CSF-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898(2013).</li>
<li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li>
<li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRP%2Fanti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70(2011).</li>
<li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-%2C+Rac-1-%2C+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+Of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li>
<li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193(2007).</li>
<li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li>
<li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22132%22%5BJournal%5D)">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li>
<li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Belangrijke beperkingen van de fluorometrische technieken zijn variantie en celverlies geassocieerd met uitgebreid wassen en gebruik van niet-hechtende cellen. Variantie is grotendeels waargenomen als gevolg van de variatie in de fluorescente deeltjes wegen en pipetteren tijdens de bereiding van de voorraadoplossing geen exacte manier die hetzelfde aantal deeltjes uit experiment experimenteren. Om het probleem van de variantie tussen de experimenten aan te pakken, kunnen de gegevens worden u...

Kwantificering van fluorescentiesignaal is op grote schaal gebruikt in een groot aantal wetenschappelijke methoden variërend van PCR, flowcytometrie, confocale microscopie en FRET analyse multiplexen ELISA. Fluorescentie beeldvorming en kwantificering heeft een brede toepassing en kan een geweldig hulpmiddel voor de kwantitatieve analyse van verschillende cellulaire processen zijn. Het gebruik van fluorescente merkers en het signaal is een revolutie in het afgelopen decennium ontstaan ​​van fluorescerende plaatlezers heeft de hoge doorvoer kwantificering van fluorescentie uitgezonden tijdens cellulaire processen vergemakkelijkt. Fluorimetrische analyse kan dienen als een groot hulpmiddel kwantificering van fagocytose. Fagocytose is onderzocht sinds de ontdekking van fagocyten door Metchnikoff in 1800 1. Loop der jaren is een verscheidenheid van werkwijzen toegepast om deze belangrijke proces onderzoekt essentieel innate immune afweer tegen binnendringende bacteriën, virussen, schimmels en parasitaire pathogenen 2-5. Vorige werkwijzen kwantificering gebruikte microscopie en stereological technieken om cellen die fagocytose, die vervolgens werden gekwantificeerd door het tellen van geïnternaliseerde deeltjes (handmatig of met behulp van software) 6-8 visualiseren. Een aantal nadelen aan het gebruik van microscopie alleen voor de kwantitatieve analyse zijn dat handmatige telling van bacteriën is arbeidsintensief en meer vatbaar voor waarnemer vooringenomenheid. Een andere werkwijze die voor kwantificering van fagocytose is de microbiologische techniek uitplaten van bacteriën uit cellysaten (na fagocytose) van bacteriën kweekplaten, maar deze methode kan alleen verklaren bactericide mechanismen en aanwezigheid van gedeeltelijk geïnternaliseerde bacteriën. Deze methode is nog arbeidsintensiever vergelijking met microscopie en duurt enkele dagen te analyseren. Flowcytometrie lijkt de snelste, meest effectieve manier om fagocytose te kwantificeren zijn en is gebruikt door vele groepen 9-11, maar de hoge kosten vaak geassocieerd met de instrument oog op de analyse maakt het de meest dure methode in vergelijking met de eerder genoemde assays. De fluorometrische werkwijze is een goed alternatief voor flowcytometrie analyse van deeltjes internalisatie omdat het biedt onpartijdige kwantificering van fluorescentie met apparatuur die niet zo onbetaalbaar. Andere extra voordelen van fluorometrie zijn hoge efficiency, en hoge doorvoer mogelijkheden voor het kwantificeren van fluorescentie uitgezonden door de gelabelde geïnternaliseerde deeltjes. Voordelen van fluorometrie kan worden geëxtrapoleerd naar kwantificering van andere dan fagocytose processen. Zo kan fluorometrische analyse toegepast op elk proces dat leidt tot veranderingen in expressie van intracellulaire of membraangebonden receptoren, veranderingen in celdoorlaatbaarheid / levensvatbaarheid, transfectie efficiëntie en modulatie in actine polymerisatie bestuderen. Een nadeel van fluorometrische techniek is dat, afhankelijk van de gebruikte etiketten, kan er een hoogexperiment om variabiliteit die meestal kan worden opgelost door aan te tonen van gegevens door middel van relatieve kwantificatie, zoals voudige verandering of procent stijging van controle experimenteren.

<table><tbody><tr><td>1 &mu;m geel-groene fluorescente Fluo-Spheres;</td><td>Molecular Probes</td><td>F8852</td><td>combineer 50&mu;l met 50&mu;l opsoniserend reagens gedurende 30 min bij 37oC vóór gebruik</td></tr><tr><td>Verhit dode E. coli BioParticles fluoresceïnekonjugaat</td><td>Molecular Probes</td><td>E2861</td><td>reconstitueer (5 mg) in 50 &mu;l PBS en combineer met 50 &mu;l opsoniserend reagens gedurende 30 min bij 37 &deg;C vóór gebruik</td></tr><tr><td>Opsoniserend reagens</td><td>Molecular Probes</td><td>E2870</td><td></td></tr><tr><td>Rodamine phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">De onderstaande items zijn verkrijgbaar bij veel merken, maar de items die we in dit onderzoek hebben gebruikt, zijn van de volgende fabrikanten:</td></tr><tr><td>RPMI Celgroeimedia</td><td>Gibco</td><td></td><td>Aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine; opwarmen in 37 &deg;C vóór gebruik</td></tr><tr><td>Fluorescente platenlezer - Fluostar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16%)</td><td>Fischer Scientific</td><td>AA433689M</td><td>verdun tot 4% vóór gebruik</td></tr><tr><td>96-wells platen</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>helder of zwart of helder bodem - zwarte platen</td></tr><tr><td>Multikanaals pipet (8 - 12 kanalen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagens reservoirs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge buizen (0,6 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conicles (10 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput fluorometrische techniek voor evaluatie van macrophage fagocytose en actine polymerisatie

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Het doel van fluorometrische analyse dienen als een efficiënte, rendabele, high throughput werkwijze voor het analyseren fagocytose en andere cellulaire processen. Deze techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van celtypen, zowel hechtende en niet-hechtende, om een ​​verscheidenheid van cellulaire eigenschappen onderzocht. Bij het bestuderen van fagocytose, fluorometrische technieken gebruikt fagocytische celtypes zoals macrofagen en fluorescent gelabelde geopsoniseerde deeltjes waarvan de fluorescentie gedoofd in aanwezigheid van trypan blauw. Na plating hechtende macrofagen in 96-well platen, fluorescerende deeltjes (groen of rood) toegediend en cellen mogen fagocyteren voor uiteenlopende hoeveelheden tijd. Na internalisering van fluorescerende deeltjes, worden de cellen gewassen met trypan blauw, die uitdoving van fluorescent signaal maakt van bacteriën die niet zijn geïnternaliseerd, of alleen hechten aan het celoppervlak. Na de trypan wassen worden de cellen gewassen met PBS, gefixeerd, eennd gekleurd met DAPI (nucleaire blauw fluorescent label), die dient om kernen van cellen te labelen. Door een simpele fluorometrisch kwantificering door plaat lezing van nucleaire (blauw) of een deeltje (rood / groen) fluorescentie kunnen we de verhouding van de relatieve fluorescentie-eenheden van groene onderzoeken: blauw en bepalen een fagocytische index indicatief bedrag van fluorescerende bacteriën geïnternaliseerd per cel. De duur van de test met behulp van een 96-well methode en multichannel pipetten voor het wassen, van eind tot eind fagocytose data acquisitie, minder dan 45 min. Flowcytometrie kan worden gebruikt op soortgelijke wijze maar het voordeel van fluorometrie is zijn hoge throughput, snelle beoordelingsmethode met minimale manipulatie van monsters en snelle kwantificering van fluorescentie-intensiteit per cel. Soortgelijke strategieën kunnen worden toegepast op niet hechtende cellen, levende gemerkte bacteriën, actine polymerisatie en wezen elke werkwijze waarbij fluorescentie. Daarom fluorometrie is een veelbelovende methode voor de lage kosten, hoge throughput-mogelijkheden in de studie van cellulaire processen.

Twee belangrijke manieren kwantificeren fagocytose en de daaropvolgende actine polymerisatie door het gebruik van dit protocol is het continue of gesynchroniseerde fagocytose observeren. Microscopische analyse (Figuur 1B) illustreert fluorescerende beelden vergelijkbaar met wat de fluorometer opneemt (zie ook grafiek 1). In figuur 1B zijn rode fluorescentie van actine, groen 268 fluorescentie van FITC etiketten HKOP E. coli, nucleai...

Hier presenteren we een protocol om fagocytose van fluorescerende deeltjes door een adherante macrofaag-cellijn te kwantificeren met behulp van een fluorometrische methode. Deze methode maakt een hoge doorvoerkwantificering van deeltjesinternalisatie mogelijk, evenals de resulterende actinepolymerisatie.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de veranderingen in het fagocytische proces of de actinepolymerisatie na toevoeging van agonisten of antagonisten te kwantificeren. Dit wordt bereikt door fluorescerende gelabelde deeltjes toe te voegen aan de fagocytische cellen en voldoende tijd te geven voor fagocytose. Als tweede stap om fagocytose te stoppen, worden cellen behandeld met triam blauw om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde deeltjes te doven, gewassen en later gefixeerd met paraldehyde.Vervolgens is er kleuring en kwantificering. Om de fluorescente detectie van cellen en deeltjes te vergemakkelijken, worden cellen behandeld met DPI of actine, de resultaten tonen het effect van de behandeling op fagocytose en actinepolymerisatie, gekwantificeerd door een verhouding groen-rood fluoresceren naar blauw op basis van fluorimetrische analyse. Het belangrijkste voordeel van de fluorimetrische techniek boven bestaande methoden is dat het een kosteneffectieve methode is voor het beoordelen van fagocytose met een hoge doorvoer.Het maakt minimale monstermanipulatie en snelle kwantificering van fluorescentie-intensiteit per cel mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie en celbiologie, zoals hoe effectief en hoe snel deze ziekteverwekkerreiniging is. Actinepolymerisatie die verandert tijdens fagocytose en hoe fagocytose of axonenpolymerisatie wordt gemoduleerd door agonisten of antagonisten.Om het proces te beginnen, plateert u de macrofagen van de Murine J 7 74-cellijn in een 96-well plate met een heldere of zwarte bodem. Laat de hechtingscellen bij 37 graden Celsius een tot twee uur incuberen om adion aan de plaat toe te staan. Voeg vervolgens de gewenste agonisten of antagonisten of voertuigcontrole toe aan de cellen bij een tweevoudige concentratie in 50 microliters PBS of gesupplementeerd medium en incubeer gedurende een gewenste hoeveelheid tijd. Zorg er in deze stap voor dat de fluorescerende deeltjes en labels te allen tijde tijdens verwerking, wassen en incubatie beschermd zijn tegen licht.Om fotobleken te voorkomen, gebruikt u de deeltjes in suspensie, zoals fluorescerend gelabelde dextrabijen of het stockoplossing gedurende één minuut. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid opsoniserend reagens toe aan de fluorescerende deeltjes en vortex gedurende nog een minuut. Vervolgens incubeert u het mengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie centrifugeert u de deeltjes gedurende vijf minuten.Bij 500 keer G. Verwijder het supernatant dat overtollig opsoniserend reagens bevat. Was vervolgens de deeltjes met 100 microliters PBS. Vortex het monster om het pellet opnieuw te suspenderen en centrifugeer het gedurende vijf minuten van 500 keer G. Herhaal deze stappen nog twee keer om een goede optimalisatie en verwijdering van niet-gebonden antilichaam te garanderen.Om de werkoplossing van geïoniseerde deeltjes voor te bereiden, suspendeert u de deeltjes in vijf milliliter medium. Bewaar het vervolgens buiten het licht tot verder gebruik. Plaats nu de werkoplossing van deeltjes in een steriele reagent reservoir.Voeg 50 microliters opsoniseerde deeltjes toe aan de eerder bereide cellen tot een eindconcentratie van 15 nanogram per milliliter en laat de fagocytose plaatsvinden onder standaard celkweekcondities. Voor de continue fagocytosemethode, laat 30 minuten tot één uur voor de fluorescerende deeltjes om de bodem van de put te bereiken en in contact te komen met de cellen. Als u een tijdsverloopexperiment uitvoert, voegt u bacteriën toe op verschillende tijdsintervallen en stopt u de volledige plaat van reacties tegelijkertijd.Om de verwerkingssnelheid voor hechtingscellen te verbeteren, verwijdert u de sennet en voegt u 50 microliters verdund triam blauw met PBS toe om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde bacteriën te doven na trian incubatie. Was de plaat twee keer met PBS om eventueel restant trian te verwijderen. Fixeer vervolgens de cellen met 50 microliters 4% paraldehyde en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.Was vervolgens de plaat met PBS. Verwijder alle vloeistof en voeg 50 microliters DPI toe. Na vijf minuten kleuring, was de plaat twee keer met PBS. Voeg vervolgens 50 microliters PBS toe aan elke put en registreer de fagocytose na paraldehydefixatie.Was de plaat twee keer met 100 microliters PBS per put voor elke wassing. Voeg vervolgens 50 microliters 0,1% Triton X 100 in PBS toe aan de cellen voor permeabilisatie en incubeer ze gedurende drie tot vijf minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de 0,1% Triton X weg met PBS twee keer.Blokkeer vervolgens de cellen met 1% BSA gedurende 20 minuten om niet-specifieke binding van het label te voorkomen. Bereid nu de werkoplossing van Rod domine kleurstof voor door 100 microliters methanol stockoplossing toe te voegen aan vijf milliliters PBS. Verwijder de BSA-oplossing onmiddellijk na het blokkeren.Voeg 50 microliters rumine foid en werkoplossing toe aan elke put en incubeer de cellen in het donker gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Om de fagocytose te kwantificeren, plaatst u de plaat in een fluorescente platelezer. Neem groene fluorescentie op met een excitatiefilter bij een golflengte van 488 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 518 nanometer en blauwe fluorescentie met een excitatiefilter bij een golflengte van 355 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 460 nanometer. Om de actinepolymerisatie te kwantificeren, gebruikt u een fluorescente platelezer om rode fluorescentie op te nemen met een excitatiefilter bij een golflengte van 584 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 620 nanometer en blauwe fluorescentie.Brand en excitatiefilter bij een golflengte van 355 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 460 nanometer. Verdeel vervolgens de totale RFU van groene of rode fluorescentie door de blauwe fluorescentie-uitlezing, afhankelijk van het deeltjeslabel of fagocytische versus actine kwantificering vanwege hoge plaat. Gebruik

high-throughput-fluorometric-technique-for-assessment-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we study tumor-macrophage interaction using fluorescence-based transwell macrophage interaction assay. The assay involves the analysis of the migration of macrophages through chemical-induced chemotaxis.

Fluorescence Based Transwell Macrophage Attraction Assay: An In Vitro Method to Study Tumor-Macrophage Interaction Through Chemical-Induced Chemotaxis

We beschrijven een experimentele opstelling om fagosoombevorming en -afsluiting in drie dimensies in levende macrofagen met ongekend hoge resolutie te visualiseren, met behulp van total internal reflection fluorescentiemicroscopie. Het maakt het mogelijk om de basis van de fagocytische cup, de uitbreidende pseudopoden, evenals de precieze plaats van fagosooombaan te monitoren.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; naar phagosome Formatie Visualiseer in drie dimensies behulp van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM)

Hier beschrijven we methoden draaiende schijf confocale microscopie afbeelding één fagocytische gebeurtenissen via muis resident peritoneale macrofagen. De protocollen kunnen worden uitgebreid tot andere fagocytische cellen.

Time-lapse 3D beeldvorming van fagocytose door macrofagen van de muis

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van muis peritoneale macrofaag fagocytose met behulp van verbeterde groene fluorescentie eiwit-uiting van Escherichia coli.

Met behulp van verbeterde eiwit-uiting van groene fluorescentie Escherichia Coli te beoordelen muis peritoneale Macrophage fagocytose

Neurodegeneratieve ziekten worden geassocieerd met ontregelde microgliafuncties. Dit artikel schetst een in vitro test van fagocytose van neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen. Kwantitatieve microscopie-uitleingen worden beschreven voor zowel live-cell time-lapse imaging als fixed-cell high-content imaging.

In vitro kwantitatieve beeldvormingstest voor fagocytose van dode neuroblastoomcellen door iPSC-macrofagen

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Geautomatiseerde assays met behulp van multi-well microplaten zijn voordelige benaderingen voor het identificeren van pathway-regulatoren door de beoordeling van een groot aantal omstandigheden in één experiment mogelijk te maken. Hier hebben we het gevestigde macropinosoombeeldvormings- en kwantificeringsprotocol aangepast aan een 96-well microplaatformaat en bieden we een uitgebreid overzicht voor automatisering met behulp van een multi-mode plaatlezer.

Geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de kwantificering van fluorescerend gelabelde macropinosomen

Leer een hoogdoorvoer fluorometrische methode voor het kwantificeren van fagocytose en actinepolymerisatie in macrofaagcellijnen. Deze techniek biedt een kosteneffectieve analyse voor immunologisch onderzoek.

High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Meer video's verkennen