High Throughput Fluorometrische Techniek voor Evaluatie van Macrophage Fagocytose en actine polymerisatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de veranderingen in het fagocytische proces of de actinepolymerisatie na toevoeging van agonisten of antagonisten te kwantificeren. Dit wordt bereikt door fluorescerende gelabelde deeltjes toe te voegen aan de fagocytische cellen en voldoende tijd te geven voor fagocytose. Als tweede stap om fagocytose te stoppen, worden cellen behandeld met triam blauw om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde deeltjes te doven, gewassen en later gefixeerd met paraldehyde.

Vervolgens is er kleuring en kwantificering. Om de fluorescente detectie van cellen en deeltjes te vergemakkelijken, worden cellen behandeld met DPI of actine, de resultaten tonen het effect van de behandeling op fagocytose en actinepolymerisatie, gekwantificeerd door een verhouding groen-rood fluoresceren naar blauw op basis van fluorimetrische analyse. Het belangrijkste voordeel van de fluorimetrische techniek boven bestaande methoden is dat het een kosteneffectieve methode is voor het beoordelen van fagocytose met een hoge doorvoer.

Het maakt minimale monstermanipulatie en snelle kwantificering van fluorescentie-intensiteit per cel mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie en celbiologie, zoals hoe effectief en hoe snel deze ziekteverwekkerreiniging is. Actinepolymerisatie die verandert tijdens fagocytose en hoe fagocytose of axonenpolymerisatie wordt gemoduleerd door agonisten of antagonisten.

Om het proces te beginnen, plateert u de macrofagen van de Murine J 7 74-cellijn in een 96-well plate met een heldere of zwarte bodem. Laat de hechtingscellen bij 37 graden Celsius een tot twee uur incuberen om adion aan de plaat toe te staan. Voeg vervolgens de gewenste agonisten of antagonisten of voertuigcontrole toe aan de cellen bij een tweevoudige concentratie in 50 microliters PBS of gesupplementeerd medium en incubeer gedurende een gewenste hoeveelheid tijd. Zorg er in deze stap voor dat de fluorescerende deeltjes en labels te allen tijde tijdens verwerking, wassen en incubatie beschermd zijn tegen licht.

Om fotobleken te voorkomen, gebruikt u de deeltjes in suspensie, zoals fluorescerend gelabelde dextrabijen of het stockoplossing gedurende één minuut. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid opsoniserend reagens toe aan de fluorescerende deeltjes en vortex gedurende nog een minuut. Vervolgens incubeert u het mengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie centrifugeert u de deeltjes gedurende vijf minuten.

Bij 500 keer G. Verwijder het supernatant dat overtollig opsoniserend reagens bevat. Was vervolgens de deeltjes met 100 microliters PBS. Vortex het monster om het pellet opnieuw te suspenderen en centrifugeer het gedurende vijf minuten van 500 keer G. Herhaal deze stappen nog twee keer om een goede optimalisatie en verwijdering van niet-gebonden antilichaam te garanderen.

Om de werkoplossing van geïoniseerde deeltjes voor te bereiden, suspendeert u de deeltjes in vijf milliliter medium. Bewaar het vervolgens buiten het licht tot verder gebruik. Plaats nu de werkoplossing van deeltjes in een steriele reagent reservoir.

Voeg 50 microliters opsoniseerde deeltjes toe aan de eerder bereide cellen tot een eindconcentratie van 15 nanogram per milliliter en laat de fagocytose plaatsvinden onder standaard celkweekcondities. Voor de continue fagocytosemethode, laat 30 minuten tot één uur voor de fluorescerende deeltjes om de bodem van de put te bereiken en in contact te komen met de cellen. Als u een tijdsverloopexperiment uitvoert, voegt u bacteriën toe op verschillende tijdsintervallen en stopt u de volledige plaat van reacties tegelijkertijd.

Om de verwerkingssnelheid voor hechtingscellen te verbeteren, verwijdert u de sennet en voegt u 50 microliters verdund triam blauw met PBS toe om de fluorescentie van niet-geïnternaliseerde bacteriën te doven na trian incubatie. Was de plaat twee keer met PBS om eventueel restant trian te verwijderen. Fixeer vervolgens de cellen met 50 microliters 4% paraldehyde en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.

Was vervolgens de plaat met PBS. Verwijder alle vloeistof en voeg 50 microliters DPI toe. Na vijf minuten kleuring, was de plaat twee keer met PBS. Voeg vervolgens 50 microliters PBS toe aan elke put en registreer de fagocytose na paraldehydefixatie.

Was de plaat twee keer met 100 microliters PBS per put voor elke wassing. Voeg vervolgens 50 microliters 0,1% Triton X 100 in PBS toe aan de cellen voor permeabilisatie en incubeer ze gedurende drie tot vijf minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de 0,1% Triton X weg met PBS twee keer.

Blokkeer vervolgens de cellen met 1% BSA gedurende 20 minuten om niet-specifieke binding van het label te voorkomen. Bereid nu de werkoplossing van Rod domine kleurstof voor door 100 microliters methanol stockoplossing toe te voegen aan vijf milliliters PBS. Verwijder de BSA-oplossing onmiddellijk na het blokkeren.

Voeg 50 microliters rumine foid en werkoplossing toe aan elke put en incubeer de cellen in het donker gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Om de fagocytose te kwantificeren, plaatst u de plaat in een fluorescente platelezer. Neem groene fluorescentie op met een excitatiefilter bij een golflengte van 488 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 518 nanometer en blauwe fluorescentie met een excitatiefilter bij een golflengte van 355 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 460 nanometer. Om de actinepolymerisatie te kwantificeren, gebruikt u een fluorescente platelezer om rode fluorescentie op te nemen met een excitatiefilter bij een golflengte van 584 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 620 nanometer en blauwe fluorescentie.

Brand en excitatiefilter bij een golflengte van 355 nanometer en een emissiefilter bij een golflengte van 460 nanometer. Verdeel vervolgens de totale RFU van groene of rode fluorescentie door de blauwe fluorescentie-uitlezing, afhankelijk van het deeltjeslabel of fagocytische versus actine kwantificering vanwege hoge plaat. Gebruik