Name: Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer glycogeen detecteren in perifere bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring. Deze methode visualiseert polysacchariden in humane PBMC's voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het NSERC Discovery-programma, subsidienummer RGPIN 418522-2013. We danken R. Kilgour voor nuttige discussies, en Katelin Gresty en Dr. A. Berghdal voor het verstrekken van de muisspiersecties.

Onderzoek met menselijke bloedmonsters werd goedgekeurd door Concordia University Ethics Review Board, certificaat nummer 10000618. Het werk op de muis spier werd goedgekeurd door Concordia University Ethics Review Board, certificaatnummer 2010BERG. 1. PBMC Isolatie van volbloed OPMERKING: Voer deze procedure in een bioveiligheid kast met behulp van steriele techniek en-fabrikant gesteriliseerde apparatuur. <ol><li> Giet 10-15 ml volbloed uit het gehepariniseerde (anti-coagulant) bloedafnamebuisjes in een 50 ml steriele conische buis. Voor kleine bloed morst, veeg met DDH 2 O en 70% EtOH behulp reiniging weefsel. </li><li> Verdun het bloed in de conische buis een 1: 1 verhouding met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS 1x) pH 7,4. Zorg ervoor dat de maximale totale volume niet meer dan 30 ml. </li><li> Meng voorzichtig met behulp van een serologische pipet pistool vermijden bubbels. OPMERKING: Niet mengen door het buisje om bloed een te vermijdenccumulation in de dop en de daaropvolgende kwel tijdens het centrifugeren. </li><li> Voeg 13 ml Ficoll-Paque (zie materialen en apparatuur tabel), om een nieuwe 50 ml conische buis. Houd de tube rechtop in het rek. </li><li> Met behulp van een transferpipet, neem verdunde bloed, raakt de transferpipet tip om de binnenwand van de buis in de buurt van de top. Met langzame en constante druk, dragen het bloed langs de binnenwand van de buis die een bloed laag bovenop de sucrose laag. Doe deze stap een paar keer tot alle bloed is overgedragen. </li><li> Sluit het buisje stevig en centrifugeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 min bij 700 xg in een schommel rotor met gemiddelde versnelling ingesteld op 5, en vertraging op nul gezet. </li><li> Neemt langzaam uit de buis en zonder verstoring van de lagen, neem het terug naar de bioveiligheid kast. </li><li> Verzamel zorgvuldig de buffycoat (dunne troebel witte laag), waar de PBMC&#39;s worden gevestigd, geplaatst tussen de PBS / plasma eennd ficoll lagen met behulp van een pipet overdracht. Vermijd het verzamelen van sucrose laag en niet de rode bloedcellen laag niet verstoren. </li><li> Breng de buffy coat in een nieuwe 50 ml steriele conische buis. Het kan verscheidene malen herhalen van stap 1.8 alle PBMC is verzameld. </li><li> Voeg PBS pH 7,4 op de buis met de PBMC en vul tot de 45 ml markering. Schud de buis grondig. Doe niet vortex. </li><li> Was 1: Centrifugeer gedurende 15 min bij 480 xg zowel maximale versnelling en vertraging ingesteld op 9. Let vorming van een pellet van PBMC op de bodem van de conische buis. </li><li> Verwijder het PBS (supernatant) in een plastic bekerglas met 10 ml bleekwater. </li><li> Draai cel pellet door voorzichtig &quot;rekken&quot; tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Doe niet vortex. </li><li> Voeg 25 ml verse PBS pH 7,4 tot de buis. Indien meer dan één buis wordt verwerkt, zwembad de pellets samen in deze stap. </li><li> Was 2: Centrifuge de buis gedurende 12 min bij 480 xg with zowel maximale versnelling en vertraging op 9 gezet. </li><li> Gooi het PBS (supernatant) in de plastic beker met een scheutje bleekmiddel. </li><li> Zachtjes &quot;rack&quot; tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Doe niet vortex. </li><li> Voeg 25 ml vers PBS aan de buis. <ol><li> Neem 50 pi van de cellen en overbrengen naar een microcentrifugebuis levensvatbaarheid tellen. </li><li> Voeg een gelijke hoeveelheid (50 pl) van trypaanblauw (a levensvatbaarheid vlek) en pipet op en neer om voorzichtig te mengen. </li></ol></li><li> Neem 10 pi en overbrengen naar een hemocytometer om de levensvatbaarheid van cellen per ml controleren. Noteer het aantal cellen / ml. </li><li> Neem de gewenste hoeveelheid cellen en centrifugeer de buis gedurende 12 min bij 480 xg zowel maximale acceleratie en deceleratie op 9 gezet. </li><li> Gooi het PBS (supernatant) in de beker met bleekmiddel. </li><li> Zachtjes &quot;rack&quot; tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Voeg 80 ul PBS in de buis. </li></ol> 2. Het maken van de PBMC Slide <ol><li> Plaats 80 gl van de cellen op een objectglaasje. Smeer de druppel met behulp van een slede of plaats 2 druppels van 40 pi elk aan beide uiteinden van de schuif. </li><li> Verlaat dia in de biologische veiligheidskabinet te drogen. Label de dia met een potlood op de berijpte kant. </li></ol> 3. Vaststelling van de monsters op de dia <ol><li> Bereid de fixerende oplossing door het mengen van 0,5 ml 37% formaldehyde en 4,5 ml 99% ethanol. </li><li> Na de dia&#39;s worden gedroogd, neem 2 ml van de vers gemaakte fixeeroplossing en giet het op de dia, zodat het gehele oppervlak van de dia wordt gedekt. </li><li> Laat de oplossing op de glijbaan voor 1 min. Spoel de glijbaan voor 1 min met water uit de kraan en laat het aan de lucht drogen. </li></ol> 4. Het maken van de amylase Oplossing voor Negatieve controle <ol><li> Neem 0,25 g amylase poeder en los op in 50 ml diverstilde water. Giet de oplossing in een schoon bekerglas van 100 ml. </li><li> Dompel de dia in het bekerglas dat de helft van de schuif ontvangt de behandeling en de andere helft onbehandeld blijft en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 1C). </li><li> Maak een notitie aan welke kant van de glijbaan is het ontvangen van de amylase behandeling. Teken een lijn op de achterkant van de slede waarin de grens tussen de behandelde en controlegroepen. </li><li> Was de dia&#39;s met DDH 2 O om de amylase oplossing te verwijderen en laat de dia aan de lucht drogen. </li></ol> 5. Voer perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring en Imaging LET OP: PAS reagentia zijn giftig bij inademing en zijn corrosief, dus de stappen die moeten worden gedaan in een zuurkast, en de afvalstoffen moet goed worden afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen. <ol><li> Plaats de dia op een vlakke ondergrond en giet 1,50-2,00 ml perjoodzuur Solution op het monster. Incubate gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> De dia&#39;s te spoelen in een aantal beschuldigingen van gedestilleerd water. </li><li> Giet 1,50-2,00 ml Schiffs reagens op de glijbaan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Was de dia met gedestilleerd water gedurende 5 minuten en laat het aan de lucht drogen. </li><li> Solliciteer 10 ul montage media op de dia en dek af met twee kleine dekglaasjes, of toe te passen 50 ui en gebruik een groot dekglaasje. </li><li> Gelden duidelijke nagellak op de randen van het dekglaasje, laat een nacht drogen. </li></ol> 6. Zorg voor afbeeldingen met de Verrekijker microscoop met de 100X Doelstelling

<ol><li>Rich, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+keilin%27s+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of keilin's respiratory chain.</a> Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).</li>
<li>Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiles+of+three+fiber+types+of+skeletal+muscle+in+guinea+pigs+and+rabbits%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits).</a> Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).</li>
<li>Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+glycogen+content+in+various+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte glycogen content in various disease.</a> J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).</li>
<li>Scott, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+in+human+peripheral+blood+leukocytes.+I.+characteristics+of+the+synthesis+and+turnover+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).</li>
<li>Fedele, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((positive+index+of+lymphocytes+and+metabolic+control+in+insulin-treated+and+type+II+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabete+Metab%22%5BJournal%5D)">positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus.</a> Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).</li>
<li>Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+peripheral+blood+granulocytes+and+lymphocytes+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Pol.Med.Sci.Hist.Bull%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).</li>
<li>Yunis, A. A., Arimura, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+of+glycogen+metabolism+in+white+blood+cells.+I.+glycogen+phosphorylase+in+normal+and+leukemic+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%2C+Res%22%5BJournal%5D)">Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes.</a> Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).</li>
<li>Hagemans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAS-positive+lymphocyte+vacuoles+can+be+used+as+diagnostic+screening+test+for+pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inherit.+Metab.+Dis%22%5BJournal%5D)">PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease.</a> J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).</li>
<li>Totsuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+performance+and+soleus+muscle+fiber+composition+in+wild-derived+and+laboratory+inbred+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains.</a> 95 (2), 720-727 (2003).</li>
<li>Murat, J. C., Serfaty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+enzymatic+determination+of+polysaccharide+%28glycogen%29+content+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues.</a> Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).</li>
<li>Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+protein+regulates+glycogen+phosphorylase+activation+and+controls+interleukin+%28IL%29-2-dependent+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation.</a> J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).</li>
<li>Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+titration+of+glycogen+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical titration of glycogen in vitro.</a> J.Vis.Exp. (81), (2013).</li>
<li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagliabracci+V.S.+Glycogen+and+its+metabolism%3A+Some+new+developments+and+old+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.J%22%5BJournal%5D)">Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes.</a> Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).</li>
<li>Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+of+glycogen+in+rat+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence of glycogen in rat thymus.</a> Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).</li>
<li>Darlington, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+Th17+%28not+Th1%29+responses+underlie+multiple+sclerosis+disease+abrogation+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.Neurol%22%5BJournal%5D)">Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).</li>
<li>Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atlasofms.org">http://www.atlasofms.org</a> (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De kritische stappen van deze video artikel waren tijdens het wassen en amylase behandeling van de cellen. Terwijl het wassen van de dia&#39;s, werd de belangrijkste stap met behulp van een plastic samendrukbare wassen fles en het water te laten zachtjes lopen door het monster op de dia en niet direct gericht op de monsters. Zelfs de geringste directe waterdruk zou ertoe leiden dat de cellen af ​​te komen van de glijbaan. Een andere belangrijke stap was dezelfde dia gebruiken ± amylase omstandigheden. Nadat de PBMC geha...

Perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring is een immunohistochemische techniek die algemeen wordt gebruikt in de spieren onderzoek en diagnostiek. Het wordt ook gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel op bloedmonsters. De techniek werkt door het aanbrengen van periodieke zuuroplossing aan het monster, welke eenheden oxideert in het polysaccharide maken aldehydegroepen die reageren met de kleurloze Schiff reagens waardoor een diep magenta product produceren. De stappen van deze werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. De vlek wordt alles met magenta polysacchariden, zoals glycogeen, glycoproteïnen, glycolipiden, mucinen of andere moleculen met polysaccharide eenheden. PAS kleuring wordt vaak gebruikt om glycogeen niveaus spiervezels meten. Spieren coupes zijn ideaal voor de techniek als ze stevig aan de glijbaan en bestand tegen meerdere stappen wassen en vlekken. Glycogeen is het meest aanwezig in fast twitch type II spiervezels, die een grote vraag hebbenvoor snelle ATP productie vereisen glycogeen voor maximale prestaties 1,2. Glycogeen is een vertakt polymeer van glucose dat in het vrije glucose kan worden gebroken door de werking van glycogeen fosforylase enzymen. In tijden van rust en voedingswaarde-genoegzaamheid, wordt glycogeen aangevuld door het proces van glycogenese, terwijl in tijden van nutritionele insufficiëntie of hoge-energie-vraag; glycogeen wordt afgebroken tot glucose door glycogenolyse. Al sinds 1950 clinicus wetenschappers ontdekt PAS-kleuring op bloedmonsters glycogeengehalte in verschillende ziekten 3-7 analyseren. Bijvoorbeeld, in Pompe ziekte een bonafide glycogeen opslag ziekte-witte bloedcellen accumuleren grote hoeveelheden glycogeen die aanzienlijk verschilt van gezonde controles 8. Dit video-artikel wordt een aangepaste versie van PAS kleuring voor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) monsters uit veneus bloed van gezonde vrijwilligers. PBMCs bevatten meestal lymfocyten van T lymfocyten en B-lymfocyten families, evenals andere immuuncellen zoals natuurlijke killer-cellen en monocyten. De eerste zuiveringsstap verwijdert erytrocyten, neutrofielen en andere granulocyten. Deze techniek verschaft gegevens over een geconcentreerde hoeveelheid lymfocyten waardoor robuustere opsomming van PAS-positieve cellen in vergelijking met volbloed uitstrijkjes. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52199/52199fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. Stapsgewijze methode PAS kleuring van PBMC (A) Ten eerste wordt isolatie van PBMC bereikt door Ficoll, het linkerpaneel toont de bereiding vóór centrifugatie, het rechter paneel toont het na centrifugeren waarbij de bufferlaag die de PBMC waargenomen in het midden van de buis. (B) Geïsoleerde PBMC worden bevestigd op de slede met formaline-ethanol fixeermiddel oplostie. De slede wordt voorzichtig gespoeld met gedestilleerd water uit een plastic wasfles. (C) Het objectglaasje wordt vervolgens in een 100 ml bekerglas halverwege gevuld met amylase oplossing die glycogeen zal oplossen. De slede wordt voorzichtig gespoeld. (D) De schuif wordt met periodieke zuuroplossing, waarbij oxidatie van sachariden plaatsvindt. Dia&#39;s worden voorzichtig gespoeld; Dit zal de overmaat perjoodzuur verwijderen en stop de oxidatiestap. (E) Wanneer de Schiffs reagens wordt toegevoegd aan de dia, zal het reageren met aldehyden die tijdens de oxidatiestap. Deze kleurloze reagens resulteert dan in een donkerrode magenta product. Dia&#39;s worden voorzichtig gespoeld om het overtollige Schiff reagens te verwijderen.

<table><tbody><tr><td>Periodic Acid Schiff Kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>395B</td><td>Voor gebruik op kamertemperatuur brengen. De materialen in deze kit zijn toxisch en schadelijk. Gebruik voorzichtigheid.</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase uit varkenspancreas</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>A3176</td><td></td></tr><tr><td>Binoculaire microscoop</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axio Lab A0</td><td></td></tr><tr><td>Glycogeenasay-kit</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en&amp;amp;region=CA" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>MAK016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td><a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR, GE Healthcare</a></td><td>17-1440-02</td><td>Niet-ionair synthetisch polymeer van sucrose.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td>Voor de isolatie van PBMC werden swing-out rotoren gebruikt.</td></tr></tbody></table>

detecteren glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met periodic acid schiff kleuring

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) kleuring is een immunohistechemische techniek die wordt gebruikt op spierbiopsieën en als diagnostisch hulpmiddel voor bloedmonsters. Polysachariden zoals glycogeen, glycoproteïnen en glycolipiden kleuren helder magenta, waardoor het gemakkelijk is om positieve en negatieve cellen binnen het weefsel te tellen. In spiercellen wordt PAS-kleuring gebruikt om het glycogeengehalte in verschillende soorten spiercellen te bepalen, terwijl bij bloedcellen PAS-kleuring is onderzocht als diagnostisch hulpmiddel voor verschillende aandoeningen. Bloed bevat een deel van de witte bloedcellen die tot het immuunsysteem behoren. De gedachte dat cellen van het immuunsysteem glycogeen bevatten en dit als energiebron gebruiken, is niet veel onderzocht. Hier beschrijven we een aangepaste versie van het PAS-kleuringsprotocol dat kan worden toegepast op perifere bloedmononucleaire immuuncellen uit menselijk veneus bloed. Kleine cellen met PAS-positieve korrels en grotere cellen met diffuse PAS-kleuring werden waargenomen. Behandeling van monsters met amylase neemt deze patronen weg, wat de specificiteit van de kleuring bevestigt. Een alternatieve techniek op basis van enzymatische spijsvertering bevestigde de aanwezigheid en hoeveelheid glycogeen in de monsters. Dit protocol is nuttig voor hematologen of immunologen die het polysacharidegehalte in bloedafgeleide lymfocyten bestuderen.

De reagentia en basistechniek valideren, werd PAS-kleuring uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant op muis soleus spier secties. De kleuring werd uitgevoerd op dezelfde dag als het offer en in de laatste stap van de kleuring werden de coupes vastgesteld door xyleen. De soleus spier is bekend dat 35% glycogeen-positieve cellen bevatten 9 ~. De gekleurde spiercellen weergegeven twee verschillende PAS-positieve functies-punctata korrels in de cel, en een doorlopende lijn markeren van de celmembraan <s...

Periodienzuur-Schiff-kleuring is een techniek die het polysacharidegehalte van weefsels visualiseert. Dit artikel demonstreert het protocol voor periodienzuur-Schiff-kleuring dat is aangepast voor gebruik op mononucleaire cellen uit perifeer bloed, gezuiverd uit menselijk veneus bloed. Dergelijke monsters zijn verrijkt met lymfocyten en andere witte bloedcellen van het immuunsysteem.

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de glycogeeninhoud van mononucleaire cellen uit het perifere bloed te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst P BMC's te isoleren uit menselijk volbloed met behulp van dichtheidsgradientcentrifugering. De tweede stap is het voorbereiden van monsterschuiven door de bloedcellen uit te smeren of ermee te pipetteren en ze vervolgens te behandelen met fixeeroplossing, gevolgd door een wasbeurt voor een negatieve controle.De helft van de schuif wordt ondergedompeld in een amylase-oplossing, die glycogeenpolymeren oplost, gevolgd door een wasbeurt. Nu worden de monsters gekleurd met periodezuuroplossing gevolgd door een wasbeurt. De laatste stap is het toevoegen van de shift-reagens gevolgd door een wasbeurt.Uiteindelijk wordt lichtmicroscopie gebruikt om de glycogeenvoorraden in de cellen te laten zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat er meer mononucleaire cellen per schuif zijn in vergelijking met het kleuren van volbloed. Daarom is het efficiënter om de glycogeeninhoud en lymfocyten te analyseren, omdat neutrofielen en rode bloedcellen afwezig zijn.Om deze procedure in een bioveiligheidskabinet te starten, draag zorgvuldig 10 tot 15 milliliter volbloed van de heparine-gevulde bloedafnamebuis over naar een steriele 50 milliliter kegelbuis. Verdun vervolgens het bloed in PBS een keer bij pH 7,4 in een verhouding van één op één en zorg ervoor dat het maximale totale volume niet meer dan 30 milliliter bedraagt. Meng het voorzichtig met een serologische pipettenpistool en vermijd het ontstaan van luchtbelletjes.Breng vervolgens 13 milliliter niet-ionisch synthetisch polymeer van sucrose, FICO over naar een nieuwe 15 milliliter kegelbuis. Voeg vervolgens het verdunde bloed toe met langzame en gelijkmatige druk om een bloedlaag bovenop de FICO-laag te vormen. Voer deze stap meerdere keren uit totdat al het bloed is overgebracht.Vervolgens wordt de buis stevig afgesloten en gecentrifugeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 400 Gs. Daarna neem je de buis langzaam uit en breng je hem terug naar het bioveiligheidskabinet. Verzamel vervolgens voorzichtig de buffycoat tussen de PBS-plasma- en FICO-lagen waar de PBMC's zich bevinden. Vermijd het verzamelen van de FICO-laag en verontrust de rode bloedcel-laag niet.Breng vervolgens de buffycoat over in een nieuwe steriele 50 milliliter kegelbuis. Voeg PBS toe aan de buis met de P BMC's en vul deze op tot de 45 milliliter markering. Schud de buis vervolgens grondig.Centrifugeer het vervolgens gedurende 15 minuten. Bij 277 gs zal er een pallet van p BMC's worden gevormd op de bodem van de kegelbuis. Gooi daarna de supernatant in een plastic beker met 10 milliliter bleekmiddel.Verlos het celpellet door de buis voorzichtig tegen een gegolfd oppervlak te schudden. Voeg 20 milliliter verse PBS toe aan de buis. Als er meer dan één buis wordt verwerkt, verzamel de pellets in deze stap samen.Centrifugeer vervolgens de buis gedurende 12 minuten bij 480 gs. Gooi de supernatant in de plastic beker met een scheut bleekmiddel. Schud vervolgens voorzichtig de buis tegen een gegolfd oppervlak.Voeg daarna weer 25 milliliter verse PBS toe aan de buis. Breng 50 microliter van de cellen over in een microcentrifugebuis. Voor de levensvatbaarheid, tel om de cellen te tellen.Voeg 50 microliter trian blauw toe en pipet op en neer voorzichtig om te mengen. Breng vervolgens 10 microliter van het mengsel over naar een hemo cytometer. Om de levensvatbaarheid van cellen te controleren en het aantal cellen per milliliter vast te leggen.Neem de gewenste hoeveelheid cellen en centrifugeer de buis gedurende 12 minuten bij 177 gs. Gooi daarna de SUP natant in de beker met bleekmiddel. Schud vervolgens de buis voorzichtig tegen een gegolfd oppervlak, gevolgd door het toevoegen van 80 microliter PBS in de buis.Plaats de PBMC-schuif door 80 microliter van de cellen op een vooraf gelabelde microscoopschuur. Smeer de druppel met behulp van een andere schuif of plaats twee druppels van 40 microliter aan beide uiteinden van de schuif. Laat de schuif in de biologische veiligheidskast drogen. Bereid vervolgens de fixeeroplossing voor door 0,5 milliliter 37% formaldehyde te mengen met 4,5 milliliter 99% ethanol.Nadat de schuiven zijn opgedroogd, voeg je twee milliliter van de vers gemaakte fixeeroplossing toe aan de schuif om het hele oppervlak te bedekken. Laat de oplossing een minuut op de schuif zitten voordat je het met kraanwater een minuut lang afspoelt. Laat het vervolgens aan de lucht drogen.Los nu op. Punt 25 gram amylasepoeder in 50 milliliter gedistilleerd water. Giet de oplossing in een 100 milliliter beker.Dompel vervolgens de helft van de schuif in de beker en incubeer gedurende 15 minuten. Op kamertemperatuur, maak een aantekening op de zijkant die de amylase-behandeling ontvangt. Trek een lijn op de achterkant van de schuif aan om de grens aan te geven tussen de behandeling en controle.Was daarna de schuif met gedistilleerd water om de amylase-oplossing te verwijderen. Laat de schuif vervolgens aan de lucht drogen. Plaats in deze stap een schuif op een vlakke ondergrond. Breng twee milliliter periodezuuroplossing aan op het monster en incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Spoel vervolgens de schuif meerdere keren met gedistilleerd water. Breng twee milliliter shift-reagens op de schuif aan en incubeer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de schuif vijf minuten lang met gedistilleerd water en laat het vervolgens aan de lucht drogen.Breng vervolgens 100 microliter montagemedium aan op de schuif en bedek deze met één grote dekschuif, of breng

detecting-glycogen-peripheral-blood-mononuclear-cells-with-periodic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the periodic acid-Schiff staining technique for assessing glycogen levels of peripheral blood mononuclear cells in vitro. The stain imparts a magenta color to intracellular glycogen granules, rendering them visible under a microscope.

Periodic Acid-Schiff Staining of Cells: An In Vitro Technique to Detect Glycogen Levels in Peripheral Blood Mononuclear Cells

In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

We beschrijven hier een nauwkeurige, reproduceerbare en handige biochemische methode voor titratie van glycogeen in vitro. Deze techniek gebruikt de Abcam Glycogen testkit en is gebaseerd op opeenvolgende hydrolyse van glycogeen tot glucose en glucose titratie van fluorescentie.

Biochemische Titratie van glycogeen<em&gt; In vitro</em

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Technieken om de activiteit van belangrijke enzymen van glycogeenmetabolisme te meten, worden gepresenteerd, met behulp van een eenvoudige spectrofotometer die in het zichtbare bereik werkt.

Spectrofotometrische methoden voor de studie van eukaryote glycogeenmetabolisme

Voor de extractie van leverglycogeen werd een optimale sucroseconcentratie bepaald met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. De toevoeging van een kookstap van 10 minuten om glycogeenafbrekende enzymen te remmen, bleek gunstig.

De extractie van leverglycogeenmoleculen voor de bepaling van de glycogeenstructuur

Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.

Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie

Het onderwijs in biologische wetenschappen kan voor studenten stimulerender worden gemaakt door het gebruik van experimenten. Dit manuscript presenteert twee verschillende maar complementaire protocollen die in de klas kunnen worden gebruikt om studenten aan te moedigen hypothesen te formuleren en te testen met betrekking tot calorierijke diëten, uithongering en veroudering.

Goedkope kleurstoffen gebruiken om glycogeenaccumulatie en darmintegriteit bij Caenorhabditis elegans te visualiseren

De test op dierlijk weefsel maakt gebruik van nucleaire scintillatiedetectie om de enzymatische activiteit van glycogeensynthase te bepalen door de opname van radioactief gelabelde glucose in glycogeen te meten.

Radiochemische beoordeling van de enzymactiviteit van glycogeensynthase in dierlijk weefsel

De peritoneale holte in zoogdieren bevat verschillende immuun cel populaties cruciaal voor de aangeboren immuunrespons. Een efficiënte isolatie methode is vereist voor biochemische en functionele analyse van deze cellen. Hier bieden wij een uitgebreide methode voor de isolatie van de peritoneale holte cellen in de muis.

Isolatie van Mouse buikholte Cellen

Leer glycogeen detecteren in perifere bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring. Deze methode visualiseert polysacchariden in humane PBMC's voor immunologisch onderzoek.

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Meer video's verkennen