Name: Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer de isolatie van primaire murine hersenmicrovasculaire endotheelcellen voor bloed-hersenbarrièreonderzoek. Deze methode combineert mechanische homogenisatie, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 - CIM), Universiteit van Münster (aan SB en SGM) en door de Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 aan SB en SGM). Wij danken Heike Blum voor de uitstekende illustraties.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Duitsland&quot;) en uitgevoerd volgens de Duitse wet van de dierenbescherming. 1. Algemene opmerkingen voor Mouse Experimenten <ol><li> Voer alle experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de respectievelijke Institutional Animal Care en gebruik Comite. </li><li> Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat stellen om de toegang tot voedsel en water ad libitum te hebben. </li><li> Gebruik voor leeftijd en geslacht gematchte muizen in de experimentele groepen, omdat biologische eigenschappen kunnen variëren met leeftijd en geslacht. </li><li> Waar mogelijk proberen te verminderen, verfijnen of vervangen dierproeven. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Percoll Gradient <ol><li> Meng 19 ml 1X PBS met 1 ml 10x PBS, 1 ml FCS en 10 ml Percoll. </li><li> Voer steRILE filtratie in een glazen buis (diameter filter poriën: 0,2 urn). Daarna de oplossing bij 4 ° C opgeslagen. </li></ol> 3. Bereiding van endotheel celmedium en Coating van celkweekplaten <ol><li> Endotheelcellen medium: <ol><li> Bereiding van 500 ml medium: (. Ongeveer 20%) Meng 400 ml DMEM medium (. Ongeveer 80%) met 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml; circa 0,05%), 0,5 ml heparine (100 pl / ml,. ongeveer 0,1%) en 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml,. ongeveer 0,1%). Voeg pyrumycin alleen celkweekmedium in de eerste 2 dagen kweken. </li><li> Voer steriele filtratie in een glazen buis (diameter filter poriën: 0,2 urn). Daarna de oplossing bij 4 ° C opgeslagen. </li></ol></li><li> Coating van celkweek platen: <ol><li> 1 ml van coating opgelost, een oplossing van 500 pl DDH 2 O, 400 ul collageen IV (0,4 mg / ml) en 100 gl fibronectine (0,1 mg / ml). </li><li> Bedek het hele oppervlak van each goed van de celkweek plaat met de coating oplossing. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht. </li></ol></li></ol> 4. Isolatie van Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen (MBMEC) <ol><li> Offer 10 volwassen muizen (8-12 weken oud, C57BL / 6) door cervicale dislocatie. Daarna isoleren de muis-hersenen en opslaan in 5 ml PBS (Waarschuwing: Werk steriel). </li><li> Verwijderen hersenen stengels, cerebella en Thalami met een pincet. Los hersenvliezen door voorzichtig het rollen van de hersenen op een steriele vloeipapier. Verzamel de overgebleven hersenvliezen-vrije voorhersenen. </li><li> Breng de hersenen om een ​​50 ml Falcon buis gevuld met 13,5 ml van DMEM. </li><li> Hak het weefsel eerst met een pipet 25 ml, vervolgens met een pipet 10 ml, totdat de media wordt melkachtig. </li><li> Verteren dan het weefsel met een mengsel van 0,6 ml collagenase CLS2 (10 mg / ml in DMEM) en 0,2 ml DNAse (1 mg / ml in PBS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) gedurende 1 uur bij 37 ° C op een orbitale schuddenr 180 rpm. </li><li> Voeg 10 ml DMEM toegevoegd aan de weefselsuspensie en centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Weggooien supernatant (Waarschuwing:! Pellet wordt makkelijk kwijt te raken) </li><li> De myeline verwijderen, resuspendeer de pellet met een pipet 25 ml in 25 ml van BSA-DMEM (20% w / v) (ong. 25 keer) en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Gooi de bovenste myelinelaag (melkachtig) met een gebroken glazen Pasteur pipet met grotere diameter, en vervolgens de BSA laag met een normale Pasteur pipet ontdoen. </li><li> Resuspendeer de pellet in 9 ml DMEM en voeg 1 ml collagenase / dispase (eindconcentratie 1 mg / ml) en 0,1 ml DNAse. Digest de oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C op een orbitale schudder bij 180 rpm (waarschuwing: geen pipet om resuspenderen - cellen verloren). </li><li> Tijdens de vertering wordt gecentrifugeerd Percoll oplossing om de dichtheidsgradiënt met een ultracentrifuge bij 3000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C, met versnelling, without rem. </li><li> Voeg 10 ml van DMEM aan de geknipte celsuspensie. Centrifugeer de suspensie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi dan het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml DMEM. </li><li> Voeg de geresuspendeerde cellen voorzichtig op de Percoll gradiënt en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C zonder versnelling en rem. Opmerking: De cellen zijn zichtbaar als een wolk in de interfase. </li><li> Neem ca. 12 ml van de interfase met cellen met een lange steriele naald en plaats deze in een nieuwe 50 ml Falcon met 5 ml van DMEM. </li><li> Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Daarna resuspendeer de pellet in endotheelcellen medium (gebruik ong. 0,2 ml medium per 1 cm2 oppervlak van celkweekplaat). </li><li> Verwijder coating oplossing uit gecoate celcultuur platen (zie stap 3.2) en spoel elke goed met steriele PBS in twee opeenvolgende stappen wassen. </li><li> Handhaaf celculturen in endothelialecelmedium bij 37 ° C en 5% CO2 in een steriele incubator. Verander het medium elke twee tot drie dagen. Split cellen 90% samenvloeiing. </li></ol>

<ol><li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li>
<li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain%3B+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+%28TREK1%29+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li>
<li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li>
<li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li>
<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li>
<li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-to-cell+junctions%3A+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li>
<li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmunepharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li>
<li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crawl%2C+cross%3A+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li>
<li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li>
<li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li>
<li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BNKG2D%2B+T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455(2013).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmaceutal+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3%2C+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li>
<li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li>
<li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Bloed-hersen-barrière disfunctie is een kenmerk van diverse schadelijke CNS ziekten, bijvoorbeeld een uitsplitsing van de BBB bij multiple sclerose faciliteert uitvoerig de CNS invasie door autoreactieve immuuncellen en maakt de ontmoeting en de vernietiging van oligodendrocyten. In ischemische beroerte de verstoring van de BBB en de daaropvolgende vorming van hersenoedeem zijn kritische factoren die secundaire infarct groei en de algehele overleving van de patiënten 6 beïnvloeden. Bovendien, door veranderingen van de BBB in afgelegen gebieden focale ischemische letsels zijn in staat om op grote schaal functionele veranderingen in de hersenen veroorzaken. De onderliggende moleculaire mechanismen grotendeels onbekend 5. In tegenstelling, de hoge dichtheid en diversiteit van transporters in functionele BMECs vermindert de concentratie van heilzame geneesmiddelen zoals chemotherapeutische middelen voor de hersenen maligniteiten of antibiotica infectieziekten. Daarom is een dieper begrip van de bloed-hersen-barrier functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden moet farmacologische middelen die in staat zijn specifiek de barrièrefunctie van de favoriete richting 21 te ontwikkelen. Betrouwbaar in vitro modellen van de BBB zijn onmisbare hulpmiddelen voor de regulerende mechanismen op BBB bestuderen. Vele geïmmortaliseerde hersenen endotheliale cellijnen werden bepaald en gebruikt als in vitro modellen BBB 22. Deze cellijnen bieden bepaalde voordelen ten opzichte van de primaire BMECs omdat ze sneller groeien en houden bepaalde BBB kenmerken over verschillende passages. Echter, endotheliale cellijnen niet volledig vervangen primaire cellen als belangrijkste eigenschappen zijn veranderd vermengen met de overdraagbaarheid van experimentele bevindingen aan de in vivo situatie. Bijvoorbeeld, het murine hersenen endotheelcellijn bEnd.5 expressie slechts lage niveaus van discontinu verdeelde tight junction eiwitten leidt tot hoge Paracellular permeabiliteit 23. BEnd.3, een andere vaak gebruikte muizen hersenen endotheelcellijn, demonstreert dicht en continu verdeeld krappe kruispunten, een hoge transendothele weerstand, diverse transporters en lage paracellulaire permeabiliteit. Echter, bEnd.3 cellagen opzichte primaire BMECs missen een echte discriminatie bij de permeatie van bepaalde transcellulaire en paracellulaire substraten 24. In de voorbereidingen van primaire celculturen kunnen besmetten cellen significant interfereren met de validiteit van experimentele bevindingen. In het beschreven protocol, wordt pyrumicin als selectiemiddel voor endotheelcellen hoge zuiverheid te bereiken. Niettemin wordt een regelmatige kwaliteitscontrole van de celkweek onvermijdelijk ter garantie voor een betrouwbare experimenten. Er zijn verschillende methoden voor de kwaliteitscontrole, naast typische morfologische eigenschappen van endotheelcellen (zie figuur 1A), de transendothelial weerstand kan worden gemeten of de expressie van endotheelcel merker zoals CD31 (zie figuur 1B) of von Willebrand factor (vWF) kan worden geëvalueerd. Het aantal brein endotheelcellen geïsoleerd van muizenhersenen relatief laag en om een ​​goede celkweek voor meerdere experimenten, de hersenen van verschillende muizen worden samengevoegd. In onze ervaring hebben minstens 10 muizen worden gebruikt voor een experiment dat een beperkende factor kan zijn afhankelijk van de middelen van het betreffende dier faciliteit. Om vertekening en verstorende factoren te vermijden, mag alleen muizen met een identieke genetische achtergrond en omgevingsfactoren worden gebundeld. Daarentegen runderen en varkens hersenen endotheelcellen preparaten bieden een groot aantal brein endotheelcellen in één hersenen. Echter, naast de ongecompliceerde fokken en huisvesting, het brede en steeds groeiende repertoire van beschikbare transgene muizen renders primaire muizen BMECs als een ideaalmodel om bloed-hersen-barrière functie te bestuderen. Enkele belangrijke bevindingen met betrekking tot de functies van de BBB en de onderliggende moleculaire mechanismen zijn afkomstig uit studies in 2D weefselkweeksystemen. Onlangs hebben 3D kweeksystemen ontwikkeld 25, waarbij endotheelcellen in een collageen matrix waardoor zij lumen en buisvormige netwerken vormen geplaatst. Deze nieuwe celkweek systemen zorgen voor een nog nauwkeurigere weergave van vasculaire processen in het intacte organisme in vivo. De betrokkenheid van verdere cellen van de NVU in 3D celkweek systemen, zoals pericyten en astrocyten zou een revolutie op de in vitro bestuderen van de bloed-hersen-barrière-functie; eerste modellen zijn recentelijk ontwikkeld 26. Er zijn een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen. Allereerst steriel werken is essentieel voor de kwaliteit van de endotheliale celkweek. Ten tweede moet pyrumycin alleen worden toegevoegd voor mobielegebruikte kweekmedium in de eerste 2 dagen van de cultuur, misschien langer toepassing leiden tot een verhoogde MBMEC celdood en lage kwaliteit barrièrefunctie. Ten derde moet het toegepast in dit protocol enzymen worden gebruikt en opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant; anders hun functie zouden kunnen worden aangetast. Bovendien zou de coating van celkweek platen worden gewijzigd indien endotheelcellen niet hechten. Concentraties van fibronectine en collageen kan worden veranderd of andere matrixeiwitten kunnen worden toegevoegd aan de bekledingsoplossing. Ten slotte, leeftijd, geslacht, tijd van het jaar en de omgevingsomstandigheden binnen het dier faciliteit zijn belangrijke factoren die de kwaliteit van MBMEC isolatie en vergelijkbaarheid van experimenten zouden kunnen beïnvloeden. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen onafhankelijke experimenten. De beschreven protocol moet worden beschouwd als een basis neuroimmunologische methode murine BMECs isoleren. De geïsoleerde cellen kunnen zijn used voor een breed scala van toepassingen in om meer informatie BBB functie, zoals migratie assays, gen- en eiwitexpressie studies, elektrofysiologische evaluaties of permeabiliteit experimenten krijgen. Zoals hierboven aangegeven kan 3D celculturen van BMECs nieuwe mogelijkheden om de complexe mechanismen betrokken bij de regulatie van de BBB in de context van de NVU onderzoek te verrichten. Daarom zal de isolatie van primaire endotheelcellen een waardevolle techniek op het gebied van BBB onderzoek in de toekomst blijven.

<html> Brain microvasculaire endotheelcellen (BMEC) vorm monolagen die een integraal onderdeel van de zeer gespecialiseerde bloed-hersen-barrière (BBB). BMECs zijn verbonden door junction eiwitten aan een basale membraan. Samen met pericyten, gladde spiercellen, astrocytische end voeten en circulerende bloedcellen bouwen zij de zogenaamde neurovasculaire eenheid (NVU) 1. Tegen de vorige notie van een ondoordringbare barrière tussen het bloed en de centrale-zenuwstelsel (CNS), de NVU is een dynamische, zeer specifieke en gereglementeerde interface die de overgang van vloeistoffen, moleculen en cellen tussen cerebrale bloedvaten en de CNS 2 regelt . Een disfunctie of ontregeling van de NVU kan initiëren en / of bijdragen aan verschillende neurovasculaire, infectueuze, ontstekings- of degeneratieve ziekten van het CZS, zoals ischemische beroerte, HIV-encefalopathie, multiple sclerosis, Alzheimer of Parkinson&#39;s ziekte 3-6. _content &quot;&gt; De BMEC monolaag goed afgesloten door een Junctional complex gevormd van vast (TJ) en contactplaatsen (AJ) 7. De hoge elektrische weerstand en de lage paracellulaire permeabiliteit van de BBB zijn voornamelijk gebaseerd op TJ eiwitten 8. De TJs zijn complexen gevormd door de transmembraan eiwitten van de claudin en occludin familie, die gekoppeld zijn aan het cytoskelet van de endotheelcellen door adapter moleculen, zoals zonulaoccludens (ZO) eiwitten ZO1-3 4. contactplaatsen hoofdzakelijk samengesteld door het integrale membraaneiwit vasculaire endotheliale (VE) -cadherin, gekoppeld aan het cytoskelet via cateninen 8. De afdichting van de BBB voorkomt dat de vrije uitwisseling van substraten en cellen tussen bloed en CSF. Uitzonderingen op deze regel zijn lipofiele, kleine moleculen met een molecuulgewicht &lt;400 Da, die in staat zijn om de BBB oversteken lipidegemedieerde diffusie 9 zijn. De passage van grotere en / ofhydrofiele moleculen, zoals glucose, aminozuren, peptiden, proteïnen en veel medicijnen beperkt tot sterk gecontroleerde transcellulaire transportsystemen 10, die kunnen worden ingedeeld in vijf hoofdcategorieën: carrier-gemedieerd transport, ionentransport, actieve efflux transport, receptor gemedieerde vervoer, en-caveolae gemedieerd transport 4. Deze transporter systemen helpen handhaven van de homeostase van het CZS, die nodig is voor een nauwkeurig signaal genereren, transductie en integratie. Bovendien BMECs kunnen actieve regeling van de overgang afzonderlijke moleculen door de expressie van verschillende ectoenzymes. Deze enzymen zijn gelokaliseerd op het celoppervlak en wijzigen specifieke endogene en exogene substraten hinderen of voor de overgang van de BBB 11. Overwegende dat de CNS werd beschouwd als een immuun-bevoorrechte orgel voor een lange tijd, recente bevindingen suggereren een vrij dynamisch en strak gereguleerd systeem van immuun surveillance van de CNS. De BMECs spelen een kritieke rol in de regulatie van het immuunsysteem cel transmigratie. Door de expressie van selectinen op hun oppervlak lymfocyten selectief geïnduceerd losjes hechten aan het endotheel. De afscheiding van chemokinen die ontmoeting met specifieke receptoren op leukocyten leidt tot de expressie of conformatieveranderingen van leukocyt integrinen, zoals LFA-1 (lymfocyt functie-geassocieerde antigen 1) en VLA-4 (zeer laat antigeen-4). De integrines bemiddelen een stevige hechting door binding hun endotheliale tegenreceptoren, bijvoorbeeld VCAM-I (vasculaire celadhesiemolecuul), ICAM-I (intercellulaire adhesie molecuul), waardoor de transmigratie in de hersenen parenchym tussen of over BMECs van de BBB 12-14. Deze en andere bevindingen onderstrepen de actieve rol van het endotheel zich in het reguleren van het immuunsysteem cel migratie. Bovendien BMECs als onderdeel van de NVU zijn betrokken bij de regulatie van de bloedtoevoer naar de hersenen linked lokale neuronale metabole eisen. Bij astrocytaire stimulatie endotheliale cellen vasoactieve stoffen zoals stikstofoxide waardoor relaxatie van vasculaire gladde spiercellen 15. Angiogenese en neurogenese in de ontwikkeling en in het volwassen hersenshow parallelle patronen en ontwikkeling en hebben veel eigenschappen van voorschrift 1, 4. Endotheelcellen kritieke rol in deze processen 16, 17. Samenvattend BMECs essentiële elementen om ontwikkeling en werking van het CZS rechtvaardigen. BBB disfunctie is verbonden met vele ernstige neurologische aandoeningen. Echter, slechts een gering aantal targets geïdentificeerd in de hersenen-vaatstelsel interface voor een specifieke en efficiënte behandeling 18. Vereenvoudigde in vitro modellen gebruikt om de betrokken functie en regulering van complexe fysiologische systemen voor lo mechanismen te begrijpenng tijd. De isolatie zoals beschreven door dit manuscript en het in vitro onderzoek van muizen BMECs, gezien de grote verscheidenheid van specifieke knockout muizen-stammen, kan een verder begrip van BBB functie en regulatie verschaffen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden openen van nieuwe therapeutische middelen.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Basic fibroblast growth factor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Bovine serum albumin</td></tr><tr><td>Collagenase CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>High relative level of protease activity</td></tr><tr><td>Collagenase-dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenase uit V. alginolyticus, Dispase uit B. polymyxa</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>Van Engelbreth-Holm-Swarm muis-sarcoombeslagmembraan</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Verwarmen in 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Desoxyribonuclease I uit runderpancreas</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Foetaal kalfserum (ook wel foetaal bovien serum genoemd)</td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulans</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Plasma-afgeleid serum</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Verwarmen tot kamertemperatuur voor gebruik</td></tr><tr><td>Pyrumycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Mag alleen worden gebruikt in de eerste 2 dagen van de kweek</td></tr></tbody></table>

isolatie van primary muriene brain microvasculaire endotheelcellen

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

De bloed-hersenbarrière wordt ultrastructureel samengesteld door een monolaag van hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) die onderling verbonden zijn door een junctionaal complex van tight en adherens junctions. Samen met andere celtypen zoals astrocyten of pericyten vormen ze de neurovasculaire eenheid (NVU), die specifiek de uitwisseling van vloeistoffen, moleculen en cellen tussen het perifere bloed en het CZS reguleert. Door dit complexe en dynamische systeem zijn BMEC's betrokken bij verschillende processen die de homeostase van het CZS handhaven. Een disfunctie van de BBB wordt waargenomen als een essentiële stap in de pathogenese van veel ernstige CZS-ziekten. Specifieke en gerichte therapieën zijn echter zeer beperkt, omdat de onderliggende mechanismen nog verre van begrepen zijn.
Dier- en in vitro modellen zijn uitgebreid gebruikt om een diepgaande kennis te verkrijgen van complexe fysiologische en pathofysiologische processen. Door reductie en vereenvoudiging is het mogelijk om de onderzoeksaanpak te richten op het onderwerp van belang en om een verscheidenheid aan verstorende factoren uit te sluiten. Vergelijkbaarheid en overdraagbaarheid zijn echter ook verminderd in modelsystemen, waarmee rekening moet worden gehouden bij evaluatie. De meest voorkomende diermodellen zijn gebaseerd op muizen, onder andere vanwege de steeds toenemende mogelijkheden van methodologie. In vitro studies van geïsoleerde murine BMEC's kunnen een diepgaande analyse van hun eigenschappen en van de bloed-hersenbarrière onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden mogelijk maken. Verdere inzichten in de complexe mechanismen bij de BBB vormen mogelijk de basis voor nieuwe therapeutische strategieën.
Dit protocol beschrijft een methode om primaire murine microvasculaire endotheelcellen te isoleren door een reeks fysische en chemische zuiveringsstappen. Speciale overwegingen voor zuiverheid en cultivatie van MBMEC's evenals kwaliteitscontrole, potentiële toepassingen en beperkingen worden besproken.

Onmiddellijk na isolatie van muis BMECs en contaminerende cellen vormen conglomeraten drijvend in het celkweekmedium (Figuur 1A, dag 0). De behandeling met pyrumycin leidt tot een selectie van murine BMECs aangezien hoge niveaus van effluxtransporters zoals P-glycoproteïne leidt tot een relatieve resistentie tegen toxines. Contaminerende cellen veel gevoeliger voor cytotoxiciteit 19 pyrumycin. Tijdens het pyrumicin selectie contaminerende cellen binnen apoptotische of necrotische celdood, terwijl MBMECs gaan hechten aan het collageen IV / fibronectine gecoate celcultuur platen (Figuur 1A, dag 1 en dag 2). Tot dag 5, de MBMECs prolifereren tot een dichtheid van circa. 80-90%. Kenmerkend is de typische spoelvormige uiterlijk. Bij samenvloeiing, vormen ze een monolaag van samengeperst longitudinaal uitgelijnd en niet-overlappende contact geremde cellen (Figuur 1A, dag 5). Doorpyrumicin keuze, een hoge zuiverheid tot 99% MBMEC bereikt zoals blijkt uit de endotheelcellen marker CD31 (PECAM1 Figuur 1B). De MBMECs vormen strak verzegelde monolagen verbonden door tight junction eiwitten. Na 7-8 dagen kweken, de endotheelcel lagen opgebouwd stabiele waarden voor elektrische weerstand (tot specifieke waarden tussen 20 - 30 Ω cm x 2). En capaciteit (figuur 1C) Op dit tijdpunt functionele assays zoals cel- migratie experimenten 3, 20,21 en permeabiliteit testen, bijvoorbeeld met Evans blauw of dextran, moet worden uitgevoerd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Morfologische en functionele eigenschappen van Muriene BMECs. (A) Vertegenwoordiger tijdsverloop van gekweekte BMECs bekeken door transmissie licht microscopie over 5 dagen. Schaalbalk geldt voor alle beelden. (B) Immunofluorescentiekleuring de endotheliale merker CD31 op dag 5. CD31 (groen) en DAPI (blauw). (C) cellen werden voorgekweekt gedurende 5 dagen en vervolgens overgebracht naar een geautomatiseerd systeem voor analyse van de biofysische eigenschappen (weerstand en capaciteit). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Het algemene doel van deze procedure is om primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen of MBX te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst de meninges van de vrije voorhersenen van volwassen muizen te isoleren en vervolgens te homogeniseren. In de tweede stap wordt het weefselhomogenaat verder verwerkt door enzymatische vertering.In de laatste stap worden de endotheelcellen vervolgens gescheiden op dichtheid, gradiënt, centrifugatie en geplaat voor celcultuur. Uiteindelijk kan immunofluorescente kleuring van de geïsoleerde cellen op CD 31-expressie worden gebruikt om de zuiverheid van de MB mech-cultuur te bevestigen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden, zoals het gebruik van geïmmortaliseerde hersen-endotheelcellijnen, is dat de resultaten die met primaire cellen worden verkregen, een betere overdraagbaarheid naar de in vivo-situatie bieden.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de bloed-hersenbarrière, bijvoorbeeld welke paden betrokken zijn bij immuuncelldenken. De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van neurovasculaire, infectieuze, inflammatoire of degeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel. Aangezien bloed-hersenbarrièredisfunctie kritisch betrokken is bij de pathogenese van dergelijke ziekten.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Lisa Eeping, een afstudeerstudent uit ons lab. Nadat de hersenen zijn geïsoleerd van tien acht tot 12 weken oude C 57 BL zes muizen, bewaar de weefsels in vijf milliliter steriele PBS. Gebruik vervolgens een pincet om de hersenstam, kleine hersenen en thalami te verwijderen en rol vervolgens elke hersen voorzichtig op steriele droogpapier.Om de meninges te verwijderen, verzamel de hersenen in een 50 milliliter falconbuis en voeg 13,5 milliliter DM em toe, hak vervolgens het weefsel eerst met een 25 milliliter pipette en vervolgens met een 10 milliliter pipette tot het medium melkachtig wordt. Verteer het weefsel in collageenase en DNA bij 37 graden Celsius op een orbitale schudder bij 180 RPM. Voeg na een uur 10 milliliter DM em toe aan de weefselsuspensie en centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 1000 Gs en vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg en zorg ervoor dat de losse pellet niet wordt verstoord, en gebruik vervolgens een 25 milliliter pipette om de pellet ongeveer 25 keer in 25 milliliter B-S-A-D-M-E-M te trijven. Nadat de cellen weer zijn gecentrifugeerd, gebruik een gebroken glazen pipette met een grote diameter om de melkachtige bovenste myelinelaag te verwijderen. Verwijder vervolgens de BSA-laag met een normale PEs of pipette.Suspendeer de pellet in negen milliliter DM em en voeg vervolgens een milliliter collageenase disc space en 0,1 milliliter DNAs toe aan de cellen. Verteer de oplossing bij 37 graden Celsius op de orbitale schudder bij 180 RPM. Tijdens de vertering wordt een perca-dichtheidsgradiënt in een ultracentrifuge ingesteld.Na een uur voeg je 10 milliliter DM E em toe aan de verwerkte celsuspensie om de reactie te stoppen en vervolgens de cellen te centrifugeren en het pellet opnieuw op te schorten in twee milliliter DM E em, voeg de celsuspensie voorzichtig bovenop de per call-gradiënt en scheid vervolgens de cellen door centrifugatie. Na de scheiding kunnen de cellen zichtbaar zijn als een troebele interface. Dompel voorzichtig een steriele naald in de interface onder een hoek van 30 graden en verzamel ongeveer 12 milliliter van de oplossing.De interface is vaak niet zichtbaar om zoveel mogelijk cellen met zo min mogelijk besmetting te verkrijgen. Een kleine hoeveelheid van de interface moet worden afgezogen. Daarnaast moet de punt van de steriele naald voorzichtig en continu naar elk deel van de interface worden bewogen. Breng de cellen over in een nieuwe 50 milliliter Falcon met vijf milliliter DM em en suspendeer na het opnieuw centrifugeren van de cellen het palet in 0,2 milliliter endotheelcelmedium per één vierkante centimeter oppervlakte van een celcultuurplaat.Verwijder vervolgens de coatingoplossing van gecoate celcultuurplaten en spoel elke put met steriele PBS in twee opeenvolgende wasstappen. Bewaar ten slotte de celculturen in endotheelcelmedium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een steriele incubator. Ververs het medium elke twee tot drie dagen onmiddellijk na isolatie.Muis BM e en verontreinigende cellen vormen conglomeraten die drijvend in de celcultuur kunnen worden waargenomen. Mediumbehandeling met mycine leidt tot de selectie van muis BMAX omdat verontreinigende cellen veel gevoeliger zijn voor puromycine-gemedieerde cytotoxiciteit en de onaangetaste BM E zich beginnen te hechten aan de collageen vier fibronectine gecoate celcultuurplaten tot dag vijf, de BME vermenigvuldigt zich tot een dichtheid van ongeveer 80 tot 90% en vormt een monolaag van nauw gepakte, longitudinaal uitgelijnde en niet overlappende contactgeïnhibeerde cellen gekenmerkt door hun typische spindelvormige uiterlijk door puram Mycine selectie, een hoge zuiverheid van maximaal 99% muis BMAX wordt bereikt zoals bevestigd door de endotheelcelmarker CD 31. De BM E vormen nauw afgesloten monolagen die met elkaar verbonden zijn door tight junction-eiwitten.Na zeven tot acht dagen cultiveren, bouwen deze cellagen stabiele waarden op voor elektrische weerstand tussen 20 tot 30 ohm per vierkante centimeter en een gezonde capaciteit op dit moment kunnen functionele assays zoals celmigratie-experimenten of permeabiliteitstests met Evans blue of dextran worden uitgevoerd. Eenmaal onder de knie kan deze techniek in vier tot vijf uur volgens deze procedure worden uitgevoerd. Andere methoden zoals migratie-assays, permeabiliteitsexperimenten of elektrofysiologische metingen kunnen worden uitgevoerd om die vragen te beantwoorden, bijvoorbeeld hoe wordt immuunceltraffick gewijzigd onder bepaalde experimentele omstandigheden?Of hoe zijn ijzerkanalen betrokken bij de regulatie van de bloed-hersenbarrière? Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u urine, hersenmicrovasculaire endotheelcellen kunt isoleren door mechanische homogenisatie, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntcentrifugering.

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse's brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

De vasculaire endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij veel belangrijke cardiovasculaire aandoeningen. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om endotheelcellen te isoleren en uit te breiden van de muisaorta zonder het gebruik van speciale apparatuur. Ons protocol biedt een effectieve manier om mechanismen in de fysiopathologie van endotheelcellen te identificeren.

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de "myovascular-eenheid".

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Leer de isolatie van primaire murine hersenmicrovasculaire endotheelcellen voor bloed-hersenbarrièreonderzoek. Deze methode combineert mechanische homogenisatie, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

Meer video's verkennen