Name: Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor whole-mount imaging van sensorische axonprojecties in muizenembryo's. Deze methode maakt snelle beoordeling van nociceptieve axongroei mogelijk en ondersteunt onderzoek naar genetische invloeden op sensorische ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Dr Louis Reichardt bedanken voor de TrkA taulacZ muizen en Dr. Annette Markus voor inzichtelijke discussie en suggesties. Dit werk werd ondersteund door het opstarten van fondsen van de Burke Stichting en Whitehall Foundation onderzoeksbeurs 2010-08-61, een onderzoeksbeurs van Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), verlenen ZB1-1102-1 uit de Christopher &amp; Dana Reeve Foundation, en subsidies 1R01EY022409 en 3R01EY022409-01S1 van het National Eye Institute, om JZ. KJO is een Goldsmith collega.

OPMERKING: Alle procedures voldoen aan de NIH Gids voor het gebruik en onderhoud van proefdieren. Het dier protocol werd goedgekeurd door de IACUC in het Weill Cornell Medical College. 1. Tissue Voorbereiding <ol><li> Euthanaseren getimede-zwangerschap vrouwtjes door cervicale dislocatie 15. Ontleden embryonale E16 - E18 embryo&#39;s van getimede zwangerschap vrouwen en plaats embryo afzonderlijk in de putjes van een 6-wells schaal, gevuld met koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Spoel embryo&#39;s in koude PBS. </li><li> Verwijderen van een klein deel van het amniotische membraan van het embryo en in een voorbereide proteinase K oplossing voor daaropvolgende genotypering. Indien daarentegen het amniotische membraan verloren gaat, verwijdert een klein deel van het uiteinde van de embryo staart en plaats deze in proteinase K oplossing </li><li> Por gaten in de huid rondom het embryo met insect pennen (tenminste 100 per zijde). </li><li> Verwijder PBS en voeg langzaam verse 2% paraformaldehyde (PFA),pH 7,4, om de put. </li><li> Schud gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Spoel embryo tweemaal in PBS en opgeslagen in PBS bij 4 ° C tot kleuring. </li></ol> 2. Genotyping <ol><li> Dompel vliezen of embryo staarten in proteinase K mengsel volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Incubeer bij 56 ° C gedurende 10 min. </li><li> Extract DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-zuivering kit. </li><li> Neem 0.5 ul van de totale 200 ul gezuiverd genomisch DNA-oplossing, combineren met 0,5 pi van elk van de gen-specifieke sense en antisense primers (10 uM), 2 pl dNTP mix (2,5 mM van dATP, dCTP, dGTP en dTTP) 0,2 pl Taq polymerase (5 U / pl) en 2 pi PCR buffer (10x), voeg H2O tot een totaal volume van 20 pl. OPMERKING: Primer sequenties zijn als volgt (tabel 1): TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC GCC GCG ATG, TrkA_R: GAA GCC GCC TGC GCG GCT CTG CCA GGG TG; PCR fragment lengte: 400 basenparen (bp). Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR-fragment lengtes: wild-type, 304 bp; Bax null, 507 bp. TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR-fragment lengte: 360 bp. </li><li> Voer een PCR met het volgende programma TrkA: stap 1: 1 min bij 95 ° C, stap 2: 10 s bij 95 ° C, stap 3: 20 s bij 68 ° C, stap 4: 30 s bij 72 ° C. Herhaal de stappen 2-4 voor 40 cycli. <ol><li> Voor LacZ en Bax, uitvoeren van een PCR met het volgende programma: stap 1: 1 min bij 95 ° C, stap 2: 10 s bij 95 ° C, stap 3: 1 min bij 54 ° C, stap 4: 1 min bij 72 ° C, herhaalt u de stappen 2-4 voor 35 cycli. </li></ol></li><li> Run PCR monsters op een 2% agarosegel bij 100 V in 1x Tris-acetaat-EDTA-buffer gedurende 20 min met een rijstrook DNA ladder fragmentlengten beoordelen. </li><li> Analyseer embryo&#39;s op de aanwezigheid van wildtype TrkA, TRKA-tauLacZ en Bax null allelen. De genotypen van experimentele embryo&#39;s TrkA taulacZ / WT: Bax - / - en TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - afhankelijk van de experimentele vragen. Embryo&#39;s die niet over de tauLacZ reporter zal negatief voor axonale vlekken en kan daarom dienen als negatieve controles aan de kleuring proces te kalibreren. </li></ol> 3. Embryo kleuring <ol><li> Gebruik een commerciële kit voor lacZ kleuring met enige modificaties zoals hieronder beschreven in secties 3,2-3,8. Hier, gebruik maken van de Millipore kit. </li><li> Dompel embryo in buffer A gedurende ten minste 1 uur zachtjes schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Dompel embryo in buffer B gedurende 15 min, zacht schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl embryo&#39;s in buffer A / B, voorverwarmen Tissue Base oplossing bij 37 ° C. Gebruik 5 ml Tissue Base oplossing per embryo. </li><li> Terwijl embryo&#39;s zijn in buffer A / B, voor te bereiden verse 5-bromo- 4- chloor-3- indolyl α-D-galactopyranoside (X-gal) in een concentratie van 40 mg / ml in 100% dimethylsulfoxide (DMSO). </li><li> Verdun X-gal in de voorverwarmde Tissue Base oplossing bij een concentratie van 1 mg / ml en voeg 5 ml X-gal / Tissue basismengsel een glazen scintillatieflesje. </li><li> Transfer embryo een glazen scintillatieflesje met X-gal / Tissue basismengsel. Verbinding deksel met Parafilm en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht, het controleren op aanwezigheid van blauwe vlekken. </li><li> Postfix embryo&#39;s met verse 4% PFA, pH 7,4. Schud gedurende 4 uur bij 4 ° C. </li><li> Spoel embryo tweemaal met koud PBS. </li></ol> 4. Tissue Uitdroging en Clearing <ol><li> Plaats embryo in 50% methanol / 50% PBS mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur schudden in de glazen flesjes. </li><li> Blijf drogen in 75% methanol / 25% PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur schudden in glazen flesjes. </li><li> Blijven uitdrogen in 90% methanol / 10% PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur schudden in glazen flesjes. </li><li> Verder uitdrogen in 100% methanol gedurende 30 min (2x) bij kamertemperatuur schudden in glazen flesjes. </li><li> Terwijl embryo&#39;s dehydrateren, stelt een 1: 1 (v: v) mengsel van benzoyl alcohol en benzoylbenzoaat. OPMERKING: Benzoyl alcohol en benzoylbenzoaat giftig. </li><li> Dompel embryo in het 1: 1 (v: v) mengsel van 100% methanol: 100% BABB gedurende 15 min. Gebruik glas alleen omdat de BABB plastic zal oplossen. </li><li> Dompel embryo&#39;s in 100% BABB om helemaal duidelijk het weefsel en X-gal kleuring te visualiseren in de ontruimde embryo. OPMERKING: Beeld spoedig mogelijk omdat de X-gal kleuring vervagen in de tijd. </li></ol> 5. Hele Mount Imaging <ol><li> Stabiliseren van het embryo, ondergedompeld in 100% BABB, op de juiste hoeken voor fotografie met behulp van metalen tang. Verlichten met behulp van een combinatie van up-light en onder-licht lichtbronnen. </li><li> Verwerven van beelden met een dissectiemicroscoopuitgerust met een digitale camera. Neem meerdere helder veld blootstellingen op vijf opeenvolgende brandpuntsvlakken 0,5 mm van elkaar langs de Z-as. De belichtingstijden en f-stops kunnen variëren afhankelijk van verlichting en camera specs en moeten worden geoptimaliseerd voor elke setup. </li><li> Gebruik standaard beeldverwerking software om overlay-afbeeldingen te verwerken en het genereren van fotomontages. </li></ol>

<ol><li>Verze, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+innervation+in+hereditary+sensory+and+autonomic+neuropathy+type+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV.</a> Neurology. 55, 126-128 (2000).</li>
<li>Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+sensory+abnormalities+in+children+and+adolescents+with+complex+regional+pain+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes.</a> Pain. 131, 153-161 (2007).</li>
<li>Uceyler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fibers+in+Fabry+disease%3A+baseline+and+follow-up+data+under+enzyme+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy.</a> J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).</li>
<li>Reichardt, L. F., Mobley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+the+distance%2C+or+not%2C+with+neurotrophin+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Going the distance, or not, with neurotrophin signals.</a> Cell. 118, 141-143 (2004).</li>
<li>White, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+onset+of+NGF+and+TrkA+survival+dependence+in+developing+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia.</a> J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).</li>
<li>Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurotrophin+and+Trk+receptor+functions+in+developing+sensory+ganglia%3A+direct+NT-3+activation+of+TrkB+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo.</a> Neuron. 21, 325-334 (1998).</li>
<li>Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+and+akt+mediate+distinct+aspects+of+sensory+axon+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth.</a> Neuron. 35, 65-76 (2002).</li>
<li>Kuruvilla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotrophin+signaling+cascade+coordinates+sympathetic+neuron+development+through+differential+control+of+TrkA+trafficking+and+retrograde+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling.</a> Cell. 118, 243-255 (2004).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinase+signaling+functions+in+sensory+neuron+differentiation+and+axon+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo.</a> Nature. 10, 598-607 (2007).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+olfactory+sensory+map+develops+in+the+absence+of+normal+projection+neurons+or+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons.</a> Neuron. 21, 1273-1282 (1998).</li>
<li>Moqrich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressing+TrkC+from+the+TrkA+locus+causes+a+subset+of+dorsal+root+ganglia+neurons+to+switch+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate.</a> Nature. 7, 812-818 (2004).</li>
<li>Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax-deficient+mice+with+lymphoid+hyperplasia+and+male+germ+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death.</a> Science. 270 (5233), 96-99 (1995).</li>
<li>Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+support+the+development+of+diverse+sensory+axon+morphologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies.</a> J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).</li>
<li>Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sensory+neurons+in+the+absence+of+NGF%2FTrkA+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo.</a> Neuron. 25, 345-357 (2000).</li>
<li>Donovan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-RAF+kinase+drives+developmental+axon+growth+and+promotes+axon+regeneration+in+the+injured+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.</a> The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).</li>
<li>Mercer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+endogenous+oncogenic+V600EB-raf+induces+proliferation+and+developmental+defects+in+mice+and+transformation+of+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts.</a> Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).</li>
<li>Tronche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+glucocorticoid+receptor+gene+in+the+nervous+system+results+in+reduced+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety.</a> Nature genetics. 23, 99-103 (1999).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI-labeling+of+DRG+neurons+to+study+axonal+branching+in+a+whole+mount+preparation+of+mouse+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn.

De hierboven beschreven X-gal kleuring van embryonale TrkA taulacZ muizen zorgt voor een snelle en nauwkeurige visualisaties van interlokale axon projecties in het intacte embryo vastgesteld. Door de Bax nul achtergrond deze muizen oog op het aftasten van signalering mechanismen die kunnen bijdragen aan zowel axon groei en neuronale overleving. Paring met transgene of knockout muizen interessant maakt voor een uitgebreide evaluatie van de axonale fenotypes en kan als nuttige leidraad voor to...

Vaststelling van nauwkeurige neuronale netwerken is een complex ontwikkelingsproces essentieel voor de werking van het zenuwstelsel. Verstoring van dit proces leidt tot neuronale disfunctie die is betrokken bij humane neurologische aandoeningen 1-3. Om de onderliggende moleculaire mechanismen van axon groei en target innervatie bij zoogdieren bestuderen, hebben we een protocol om de axonale trajecten van TrkA tot expressie sensorische neuronen met een combinatie van twee genetisch gemodificeerde muizenlijnen visualiseren ontwikkeld. TrkA is een receptor voor zenuwgroeifactor NGF en een functionele merker van nociceptieve sensorische neuronen 4. TrkA is sterk uitgedrukt in nociceptieve neuronen tijdens de vroege ontwikkeling en bemiddelt NGF-afhankelijke neuron overleving, axon groei, arborization en target innervatie 5-9. In TrkA taulacZ muizen, wordt het wild-type TrkA-gen vervangen door een taulacZ uitdrukking cassette 10, zodanig dat de axonale morfologie vermeende TrkA-positieve neuronen kunnen worden gevisualiseerd door β-gal (X-gal) kleuring 11. Met een heterozygote TrkA taulacZ / WT lijn, kunnen we factoren die kunnen reguleren of interfereren met de ontwikkeling van sensorische afferente projecties in vivo onderzocht. Bovendien TrkA expressie afwezig is in homozygote TrkA taulacZ / taulacZ muizen, die dus kunnen worden gebruikt om de axon groei bevorderende mechanismen in de afwezigheid van NGF / TrkA signalering beoordelen. Aangezien nociceptieve neuronen afhankelijk NGF / TrkA signalering niet alleen axon groei, maar ook om te overleven, gebruiken we een muis lijn, zonder de pro-apoptotische Bax gen apoptose remmen embryonale DRG neuronen te redden van celdood die anders is waargenomen in de afwezigheid van TrkA signalering. De Bax - / - achtergrond 12 zorgt daarmee voor de molecuLAR dissectie van signaalwegen die specifiek van invloed zijn axongroei 7-9,13-15. In TrkA- - / -: Bax - / - muizen, DRG neuronen overleven, maar sensorische afferente innervatie in de huid wordt volledig afgeschaft 14,15. We kunnen selectief activeren signaalwegen hun respectieve bijdragen aan de ontwikkeling van axon projecties te bepalen. De bruikbaarheid van deze methode is dat het de beoordeling van veranderingen in axonale groei fenotypes wanneer verschillende genetische modificaties worden gekweekt op de TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - of TrkA taulacZ / WT: Bax - / - achtergronden.

<table><tbody><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Tech</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Rinse Solution A</td><td>Millipore</td><td>BG-6-B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Rinse Solution B</td><td>Millipore</td><td>BG-7-B</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Stain Base Solution</td><td>Millipore</td><td>BG-8-C</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintiallation vial</td><td>Kimble Chase</td><td>74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Labline</td><td>Model 120</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>FST</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>6-well dish</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td>custom DNA primers</td><td></td></tr><tr><td>Takara dNTP mixture</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA buffer</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>Takara LA Taq</td><td>Takara</td><td>RR002A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M205A</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC310FX</td><td></td></tr><tr><td>Ring light</td><td>Leica&nbsp;</td><td>MEB110</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 4.0</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-mount imaging van muis embryo sensory axon projecties

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

De visualisatie van volledige lengte neuronale uitsteeksels in embryo is essentieel voor een begrip van hoe zoogdieren neuronale netwerken ontwikkelen krijgen. Hier beschrijven we een methode om te labelen in situ een subset van de dorsale wortel ganglion (DRG) axon projecties om hun fenotypische kenmerken te beoordelen met behulp van verschillende genetisch gemanipuleerde muis lijnen. De TrkA-positieve neuronen zijn nociceptorneuronen, gewijd aan de overdracht van pijnsignalen. We maken gebruik van een TrkA- taulacZ muis lijn naar de trajecten van alle TrkA-positieve perifere axonen de etikettering in de intacte muis embryo. We de TrkA taulacZ lijn op een Bax null achtergrond, die hoofdzakelijk opheft neuronale apoptose verder kweken, om groei vragen onafhankelijk van mogelijke effecten van genetische manipulaties op neuronale overleving te bepalen. Vervolgens genetisch gemodificeerde muizen die van belang zijn gefokt met de TrkA TaulACZ / Bax nul lijn en zijn dan klaar voor studie met behulp van de hierin beschreven technieken. Deze presentatie bevat gedetailleerde informatie over muis kweekplannen, genotypering ten tijde van dissectie, weefselbereiding, kleuring en opheldering mogelijk te maken visualisatie van volledige lengte axonale trajecten geheel-mount preparaat.

De genotypen van TrkA WT / taulacZ: Bax - / - en TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embryo&#39;s kan worden vastgesteld door standaard PCR genotypering (figuur 1). X-gal kleuring toont gedetailleerde perifere axonale assen subcutaan conventioneel gekleurde embryo&#39;s (figuren 2, 3a) en in de gehele embryo na weefsel clearing (figuren 3b, 4). We hebben gefokt de TrkA WT / taulacZ: Bax <s...

We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol om foetale muizen te genotyperen, kleuren en voorbereiden voor de beeldvorming van perifere nociceptor axon projecties in het hele dier, als een effectieve methode om sensorische axon groei fenotypen te beoordelen in zich ontwikkelende genetisch gemodificeerde muizen.

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om effectief de groeifenotipen van sensorische axonen te beoordelen bij zich ontwikkelende foetale muizen. Dit wordt bereikt door eerst tre a tau laxy reportermuizen op de juiste manier te fokken en te genotyperen, zodat downstream kleurreacties als tweede stap kunnen worden uitgevoerd. De muizenembryo's worden gefixeerd en gekleurd om visualisatie van projecties van sensorische axonen in het hele dier mogelijk te maken.Vervolgens worden de embryo's gedehydrateerd en verduidelijkt om de diepliggende axonprojecties die anders niet zichtbaar zouden zijn, volledig te kunnen visualiseren. De resultaten tonen aan dat deze methoden een effectieve manier zijn om snel fenotypes van embryonale nociceptieve axongroei te beoordelen. Met behulp van de track a Tau Lae reporter kan deze methode helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van groei van sensorische axonen door onderzoekers in staat te stellen hun gen van belang op de track a tlac Z achtergrond te kruisen en te screenen op eventuele veranderingen in fenotypes van sensorische axongroei.De implicaties van onze techniek strekken zich uit naar therapie in de zin dat

whole-mount-imaging-of-mouse-embryo-sensory-axon-projections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Liau, E. S. et al. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (2018). This video demonstrates the use of light sheet fluorescence microscopy to image motor neuron projections and axon branching in transgenic mouse embryos. It outlines the steps involved in sample preparation, imaging, and 3D reconstruction of axonal branching for assessing motor neuron growth and connectivity.

Visualizing Motor Neuron Projections and Axon Branching Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Source: Jeong, S. Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the visualization of axonal projections in Drosophila embryos. Immunolabeling of motor neurons, precise dissection to expose neuronal structures, and differential interference contrast microscopy collectively reveal detailed neuronal architecture, emphasizing the axonal projection patterns.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Zoogdierhuid bevat een divers scala aan structuren - zoals haarfollikels en zenuwuiteinden - die onderscheidend patronen van ruimtelijke organisatie vertonen. Het analyseren van de huid als een platte berg maakt gebruik van de 2-dimensionale geometrie van dit weefsel tot volledige dikte van hoge-resolutie afbeeldingen van de huid structuren te produceren.

Flat Mount beeldvorming van de huid van muizen en de toepassing ervan op de Analyse van Haarzakje Patterning en Sensorische Axon morfologie

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

Het knooppunt en de notochordal plaat zijn voorbijgaande signalering organisatoren in het ontwikkelen van muis-embryo's die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van verschillende technieken. Hier beschrijven we in detail hoe uit te voeren van twee van de technieken voor het bestuderen van hun structuur en morfogenese: 1) scanning elektronen microscopie (SEM); en 2) hele mount immunofluorescentie (WMIF).

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Deze studie presenteert een in vivo twee-foton beeldvormingsbenadering om de structuren van laag-drempel mechanoreceptor (LTMR) axonterminalen in de voorpoothuid van muizen te visualiseren. Met behulp van herhaalde, hoogresolutiebeeldvorming van individuele axonen biedt deze methode een nieuw platform voor het bestuderen van de structuur en functie van het cutane sensorische circuit tijdens de ontwikkeling en bij volwassenen.

Intravitale tweefotonbeeldvorming van aanrakingssensorische axonmorfologie in muizenhuid

Leer een geoptimaliseerd protocol voor whole-mount imaging van sensorische axonprojecties in muizenembryo's. Deze methode maakt snelle beoordeling van nociceptieve axongroei mogelijk en ondersteunt onderzoek naar genetische invloeden op sensorische ontwikkeling.

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

Meer video's verkennen