Fenotypering Mouse Longfunctie In Vivo Met de Lung diffusiecapaciteit
January 6th, 2015
We beschrijven een manier om snel en eenvoudig de long diffusiecapaciteit bij muizen te meten en laten zien dat het voldoende gevoelig is voor fenotypeveranderingen in meerdere veelvoorkomende longpathologieën. Deze metriek brengt dus directe translationele relevantie voor de muismodellen, aangezien diffusiecapaciteit ook gemakkelijk bij mensen kan worden gemeten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om te leren hoe de diffusiecapaciteit van de longen van een muis te meten met behulp van een gekalibreerde gaschromatograaf. Dit wordt bereikt door de longen van een verdoofde muis op te blazen met gas dat neon en koolmonoxide bevat, het gas gedurende negen seconden in de longen vast te houden en het gas te verzamelen. Het gas dat uit de longen wordt onttrokken, wordt vervolgens verdund tot twee milliliter en in de gaschromatograaf geïnjecteerd.
De differentiële opname van neon en koolmonoxide in de long wordt gebruikt om de diffusiecapaciteit te berekenen. Deze meting kan worden gebruikt om het verlies van longfunctie te beoordelen in een breed spectrum van longziektemodellen. Het grote voordeel van deze techniek boven alle andere bestaande methoden om de longfunctie bij de muis te meten, is dat dit een zeer eenvoudige reproduceerbare meting is die direct kan worden vergeleken met soortgelijke metingen bij mensen.
Deze methode kan worden gebruikt om de veranderingen in longstructuur te volgen die optreden bij een verscheidenheid aan longpathologieën. Dit protocol begint met het instellen van de gaschromatograafmodule die bij de machine wordt geleverd om pieken voor stikstof, zuurstof, neon en koolmonoxide te meten. Voor deze toepassing is alleen de neon- en koolmonoxidegegevens nodig.
Het instrument gebruikt een moleculaire zeefkolom met helium als dragergas. Deze specifieke gaschromatograaf heeft een kolom van 0,8 milliliter en er wordt een monster van twee milliliter gebruikt om voldoende zuivering van deze kolom te garanderen voordat met het meten wordt begonnen. Een reeks metingen kalibreert altijd de machine met behulp van twee milliliter gas rechtstreeks uit de gasmonsterzak.
De eerste piek die verschijnt is de neon, vervolgens zuurstof en stikstof, die we voor deze procedure niet meten. Ten slotte verschijnt de koolmonoxidepiek in de tijd voor de gaschromatograaf. Het meten van al deze pieken duurt iets minder dan een minuut.
Om te beginnen, verdooft u de muizen met ketamine en xylazine. Bevestig de verdoving door de afwezigheid van reflexbewegingen als reactie op een teenprik. Om de ogen te beschermen, brengt u vervolgens veterinaire zalf aan en voert u tracheostomie uit bij de muizen met een studencannule.
Gebruik een canule van 18 gauge voor volwassenen of een canule van 20 gauge voor zeer jonge muizen. Start vervolgens de metronoom met hoorbare klikjes om de seconde. Voor muizen ouder dan zes weken, gebruikt u een spuit van drie milliliter om 0,8 milliliter gas uit de gasmengselzak te trekken.
Als de muis jonger is dan vier weken, gebruikt u 0,4 milliliter gas, verbindt u de spuit vervolgens met de tracheacanule en blaast u snel de longen op. Begin met het mentaal tellen van één tot tien in synchroon met de metronoomklikken. Wanneer het tellen 10 bereikt, trekt u snel het volume van 0,8 milliliter terug.
Verdun dit uitgeademde gas tot twee milliliter door ruimte toe te voegen, lucht en minimaal 15 seconden te wegen. Het is erg belangrijk om de longen zo snel mogelijk op te blazen en te laten ontspannen. Een snelle inflatie is heel gemakkelijk, maar het vergt een beetje oefening om de 0,8 ml snel en nauwkeurig terug te trekken. Injecteer vervolgens het hele monster in de gaschromatograaf.
Voor analyse is het belangrijk om besmetting van het monster te voorkomen bij het overbrengen naar en van het dier en naar de gaschromatograaf. Dit kan zorgvuldig worden gedaan door het signaal met een vinger af te dekken terwijl de GC het monster meet. Blaas de long van de muis op met nog eens 0,8 milliliter gasmengsel uit de zak en verwerk vervolgens dit monster identiek aan de eerste.
Gebruik de gemiddelde waarden van de twee metingen om de DFCO te berekenen. De C-subscript verwijst naar de kalibratiegassen en de negen-subscript verwijst naar de monsters die van het dier zijn verzameld. Na de ademstilstand van negen seconden.
Een nominale controle-DFCO-waarde genomen van C 57 zwarte zes muizen is ongeveer 0,77. In een studie met behulp van een PR acht influenzamodel, werd een progressieve functieverlies waargenomen op dag zes en acht in een model van emfyseem 21 dagen na installatie van elastase. De DFCO was matig verminderd, maar er waren veel grotere veranderingen in het model van fibrose geïnduceerd door Blio Mycin installatie.
De fibrotische route veroorzaakt door bleomycine resulteerde in de grootste verandering in DFCO die werd waargenomen in elk van de pathologische modellen. Dit is belangrijk omdat de diffusiecapaciteit ook een betrouwbare marker is voor fibrose bij mensen. Het CFTR-gen speelt een cruciale rol bij cystische fibrose en in een studie van muizen zonder dit gen, was er een significante afname in DFCO.
De DFCO werd verder verminderd met schimmelinfectie in deze knockout-muizen. Een veel gebruikt model voor longbeschadiging wordt veroorzaakt door LPS. Bij muizen die aan LPS werden blootgesteld, was er progressieve tijdsafhankelijke verlies van longfunctie van dag één tot vier zoals beoordeeld door DFCO-metingen, de meting van DFCO kan met succes worden gemaakt bij muizen zo jong als twee weken oud.
De kleinere grootte van de long vereist een kleinere opblaasvolume van 0,4 milliliter. De DFCO gemeten met dit kleinere volume is in staat om de verwachte toename te tonen naarmate de long rijpt. Eenmaal onder de knie. Deze techniek kan in slechts enkele minuten per muis worden uitgevoerd voordat andere longfunctiemetingen of beoordelingen worden gedaan.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de stap van opblazen en ontblazen snel wordt uitgevoerd en om voorzichtig te zijn bij het overbrengen van het monster om besmetting te voorkomen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van de diffusiecapaciteit van de longen bij muizen met behulp van een gekalibreerd gaschromatograaf. De techniek is gevoelig voor fenotypeveranderingen in verschillende longpathologieën, waardoor het relevant is voor translationeel onderzoek.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Respiratoire fysiologie
- Translationeel onderzoek
Achtergrond
- Longdiffusiecapaciteit is een cruciale maatstaf voor de longfunctie.
- Bestaande methoden voor het meten van longfunctie bij muizen kunnen complex zijn.
- Vergelijkende studies tussen muizen en mensen zijn essentieel voor translationele relevantie.
- Eenvoudige en reproduceerbare technieken zijn nodig voor effectief onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het meten van de diffusiecapaciteit van de longen bij muizen.
- Om het verlies van longfunctie te beoordelen in verschillende longziektemodellen.
- Om vergelijkingen van longfunctiemetingen tussen muizen en mensen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Inflatie van verdovde muizenlongen met een gasmengsel dat neon en koolmonoxide bevat.
- Het gas negen seconden in de longen houden voor verzameling.
- Verdunning van het verzamelde gas tot twee milliliter voor analyse.
- Gebruik van een gaschromatograaf om de differentiële opname van gassen te meten.
Belangrijkste resultaten
- De methode biedt een betrouwbare meting van de diffusiecapaciteit van de longen.
- Het is gevoelig voor veranderingen in longfunctie geassocieerd met verschillende pathologieën.
- De techniek is eenvoudig en reproduceerbaar, waardoor het toepasbaar is in onderzoek.
- Resultaten kunnen direct worden vergeleken met soortgelijke metingen bij mensen.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het beoordelen van de longfunctie in muizenmodellen.
- Het ondersteunt translationeel onderzoek door metingen tussen muizen en mensen te verbinden.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken om longpathologieën effectiever te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
