Name: Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer proteomics profilering van M1- en M2-macofagen door 2D-differentiële in-gel elektroforese. Deze gevoelige methode detecteert eiwitvariaties met slechts vijf microgram materiaal voor therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Inserm. Marion Bouvet is een medewerker van het Franse Ministerie voor Onderzoek en Technologie. Annie Turkieh is een medewerker die een beurs heeft ontvangen van de Europese Unie FP7 HOMAGE (305507).

Het protocol volgt de richtlijnen van onze instellingen menselijk-ethische toetsingscommissie. Buffy coat van gezonde menselijke donoren werden verkregen uit het Regionaal Bloedtransfusie Center (Lille, Frankrijk). Monsters uit de buffy coats worden gedeclareerd als een Inserm collectie (n ° DC2010-1209). 1. Materiaal en Cultuur Media Voorbereiding <ol><li> Verdun 10x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) in steriel gedestilleerd water tot 1x PBS verkrijgen. </li><li> Voeg RPMI 1640 medium aangevuld met gentamicine (40 ug / ml) en L-glutamine (2 mM), met en zonder 10% gepoold humaan serum. </li></ol> 2. Primaire culturen van Monocyt afgeleide macrofagen (MDM) <ol><li> Verdun buffycoat (25 ml) met 1x PBS. Vul voorzichtig op een Ficoll / Leucosep buis en centrifugeer bij 1600 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verzamel monocyten aan het grensvlak in een nieuwe buis. 3x wassen met 10 ml 1x PBS dat 0,1% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) door opeenvolgende centrifugeren bij 1000 xg, 370 xg en 160 xg gedurende 10 min elk, en vervolgens eenmaal in 1x PBS alleen bij 160 xg gedurende 10 min. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 5 ml RPMI-1640 medium zonder serum en zaden de cellen in 35 mm schalen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen per schaal. </li><li> Na sedimentatie gedurende 90 min in de incubator, gooi het supernatant dat de niet-hechtende cellen. Was de hechtende cellen, bestaande uit monocyten, 3x met 1 ml PBS; voeg 1 ml vers medium bevattende 10% (v / v) humaan serum de eerder serumvrije cellen. </li><li> Na 6 dagen kweken alternatieve gedifferentieerde macrofagen (M2) wordt verkregen, voeg recombinant humaan IL-4 (15 ng / ml) en handhaven 6 dagen. Daarna kunt gedifferentieerde macrofagen met lipopolysaccharide (100 ng / ml) op dag 12 gedurende 4 uur tot M1 macrofagen te verkrijgen. </li></ol> 3. Extractie van M1 en M2 Macrophage Eiwitten voor 2D-elektroforese <ol><li> Wash macrophleeftijden driemaal met 25 mM Tris, pH 7,4, en afval in buffer die 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS), 2 M thioureum en 7 M ureum. </li><li> Lyse cellen met een geschikte mixer gedurende 1,5 ml microcentrifuge buisjes gedurende 5 min in ijs en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bepaal eiwitconcentratie met een commercieel Bradford reagens. WINKEL 100 ul aliquots van de eiwitten bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 4. Isoelectrofocusing OPMERKING: Voer alle procedures etikettering in het donker. <ol><li> Verminder 5 pg van elk monster (M1 en M2 macrofagen) ingesteld op 9 ul met lysis buffer met 2 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Cyanine 3 (Cy3) M1 en M2 extract sulfhydryl-reactieve kleurstof extract toe in een concentratie van 0,8 nM / ug eiwit. Cyanine 5 (Cy5) aan M1 en M2 onttrekt in een concentratie van 0,8 nM / ug eiwit en incubeergedurende 30 min bij 37 ° C. </li><li> Stop de reactie met de toevoeging van een gelijk volume van monsterbuffer bevattende 7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 130 mM dithiothreitol (DTT) en 2% pharmalytes. </li><li> Mix Cy3-gelabeld M1 monsters met een Cy5-gelabelde M2 ​​monsters per hand en Cy3-gelabeld M2 monsters met een Cy5-gelabelde M1 bemonsteringen in een andere hand. </li><li> Rehydrateren een geïmmobiliseerde pH-gradiënt (IPG) strip (240 mm, pH 3-10 lineaire gradiënt) met 450 pl gemerkte gemengde monsters in buffer bevattende 7 M ureum, 2 M thioureum en 4% CHAPS op een isoelektrisch focusseren (IEF) celsysteem gedurende 24 uur zonder dat enige stroom. </li><li> Voer scherpgesteld bij 300 volt (V) gedurende 3 uur en vervolgens met een gradiënt tot 1000 V gedurende 6 uur, bij een verloop op 8000 V gedurende 3 uur en tenslotte bij 8000 V gedurende 3 uur. </li></ol> 5. Tweede dimensie OPMERKING: Voer alle elektroforese procedures in het donker. <ol><li> Incubeer de IPG strips in equilibratiebuffer bevattening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M ureum, 2% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS) en 30% (v / v) glycerol gedurende 10 min. </li><li> Breng de geëquilibreerde IPG strips voor de tweede dimensie (SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE)) op 12,5% PAGE gels en afdichting met laagsmeltende agarose. </li><li> Voeren elektroforese bij 20 ° C met een Ettan-Daltsix systeem een ​​constante spanning van 70 V overnacht gevolgd door 300 V tot de broomfenolblauw achterkant onderkant van de gel bereikt. </li></ol> 6. Image Acquisition en Bioinformatica analyse <ol><li> Scan gels geworpen tussen de twee lage fluorescentie glasplaten met een DIGE Imager scanner bij excitatie / emissie golflengten van 532/580 nm voor Cy3 en 633/670 nm voor Cy5 om beelden te leveren met een pixelgrootte van 100 micrometer. </li><li> Voer beeldanalyse met commerciële software zoals eerder beschreven 12. </li><li> Bereken en normaliseren spot volumes in elk beeld. Wijs een genormaliseerde spot volume als stutortion van de totale waarde van elke vlek waargenomen in de gel. </li><li> Analyse van de verschillen in eiwitpunt volumes elk van macrofagen door de genormaliseerde plaatse volumewaarde tussen de twee groepen (M1 en M2) vergelijken. Beschouw het verschil tussen de vlekvolumes significant beschouwd als de verandering 1,5- (p &lt;0,05, eenzijdige ANOVA). </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Er zijn geen verklaarde belangenconflicten.

De hierin beschreven protocol Gegevens methode om de invloed van verschillende stimuli van de twee subtypes van macrofagen, M1 (pro-inflammatoire) en M2 (anti-inflammatoire) geanalyseerd. Primaire, M1 en M2 macrofagen werden verkregen van de differentiatie van monocyten als eerder gepubliceerd 7. De procedure van 2D DIGE gelelektroforese speciale materialen en uitrusting, zoals IEF cel isoelectrofocusing lage fluorescentie platen voor de SDS-PAGE om tweemaal de gel bij excitatie /...

Macrofagen zijn heterogeen en plastic cellen die kunnen verschillende functionele fenotypes verwerven. In vivo, deze cellen reageren op een grote verscheidenheid aan micro milieu signalssuch microbiële producten, cytokines, etc. 1. In vitro, de pro-inflammatoire fenotype (M1) macrofagen kunnen worden geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) en de anti-inflammatoire fenotype (M2) van bepaalde cytokines zoals interleukine-4 (IL-4). Bovendien kunnen macrofagen schakelen van een geactiveerde M1 M2 fenotype, en omgekeerd, op specifieke signalen 2. Afhankelijk van het fenotype, zal macrofagen verschillende functies. M1 macrofagen cellen die pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor α (TNF-α) produceren, micro-organismen of tumorcellen 3 doden. Daarentegen M2 macrofagen voorkomen dat deze ontstekingsreactie zoals in wondgenezing en fibrose van die anti-inflammatory factoren zoals TGF-β 3,4. Humane perifere bloed mononucleaire cellen van gezonde donoren werden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie zoals eerder beschreven 5 met een techniek aangepast van Boyum 6. Macrofagen in cultuur kan worden onderscheiden in M1 of M2 fenotype na 6 dagen van de primaire cultuur 7. Analyse van eiwitexpressie of eiwit bij de twee subtypes van macrofagen bij verschillende gecontroleerde stimuli, zoals gastheer pathogeniteit of microbiële toxinen, zal nuttig zijn om de functionaliteit van de pro- en anti-inflammatoire macrofagen ontcijferen. Proteomics zijn unieke instrumenten voor directe controle van eiwitten die specifiek up- of down-gereguleerd in menselijke gekweekte macrofagen onder verschillende stimuli. Fluorescerende kleurstoffen opgelost aantal beperkingen van 2D gel elektroforese, zoals lage gevoeligheid en beeldanalyse 8 &lt;<html> / Sup&gt;. De kleurstoffen reactie met cysteïne residuen de detectiegevoeligheid vergeleken met die reageren met lysineresten 9 verhoogd. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat de bruikbaarheid van DIGE verzadiging etikettering van de analyse van schaarse monsters 10 met de klassieke zilvergevlekte 2D electroforese 11. Deze techniek is nuttig bij het snel analyseren eiwitmodificaties tussen de twee subtypes van macrofagen of tussen onbehandelde en behandelde macrofagen uit hetzelfde subtype. De voordelen van deze techniek zijn proteomische toegang tot de informatie van eiwitgrootte en post-translationele modificaties die door analyse van de 2D gel 12. Er moet rekening mee dat dit geen hoge doorvoer techniek worden gehouden, waardoor het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd. De ontwikkeling van high throughput assays op basis van massaspectrometrie als beoordeeld onlangs 13 kan dit verbeteren. _content &quot;&gt; Hier presenteren we hoe 2D DIGE analyse van het eiwit extractie van gekweekte macrofagen te voeren door middel van de processen van elektroforese, isoelectrofocusing, en SDS-PAGE, evenals informatie over het nut van adequate 2D software.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamycin 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>human serum</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;6-wells plate PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filter 0.22 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml cylinder</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-reactive dye</td><td>GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>IPG strip 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean IEF cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Ettan-Daltsix system</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Imager scanner</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Non linear dynamics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>Ur&eacute;e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute;e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>2D clean Up</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Dim&eacute;thylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>electrode wicks</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomics profilering van macrofagen door 2d-elektroforese

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

Het doel van het hier beschreven tweedimensionale (2D) elektroforeseprotocol is om te laten zien hoe het fenotype van gekweekte menselijke macrofagen kan worden geanalyseerd. De belangrijke rol van macrofagen is aangetoond bij verschillende pathologische aandoeningen zoals inflammatoire, immunologische en infectieziekten. In dit protocol gebruiken we primaire culturen van menselijke monocyte-afgeleide macrofagen die kunnen worden gedifferentieerd in de M1 (pro-inflammatoire) of de M2 (anti-inflammatoire) fenotypus. Dit in vitro model is betrouwbaar voor het bestuderen van de biologische activiteiten van M1 en M2 macrofagen en ook voor een proteomische aanpak. Proteomische technieken zijn nuttig voor het vergelijken van het fenotype en gedrag van M1 en M2 macrofagen tijdens gastheerpathogeniciteit. 2D gelelektroforese is een krachtige proteomische techniek voor het in kaart brengen van grote aantallen eiwitten of polypeptiden gelijktijdig. We beschrijven het protocol van 2D elektroforese met behulp van fluorescerende kleurstoffen, genaamd 2D Differentiële Gel Elektroforese (DIGE). De M1 en M2 macrofagen eiwitten worden gelabeld met cyanine kleurstoffen voorafgaand aan scheiding door iso-elektrisch focusseren, volgens hun iso-elektrisch punt in de eerste dimensie, en hun moleculaire massa, in de tweede dimensie. Gescheiden eiwit- of polypeptidische vlekken worden vervolgens gebruikt om verschillen in eiwit- of polypeptide expressieniveaus te detecteren. De hier beschreven proteomische benaderingen maken de onderzoek van macrofaag-eiwitveranderingen geassocieerd met verschillende aandoeningen zoals gastheerpathogeniciteit of microbiële toxines mogelijk.

Om passende differentiële proteomics analyses uit te voeren, moet de verwerking van de te analyseren monsters worden geverifieerd. In de gepresenteerde voorbeeld, wordt de celkweek kwaliteit van macrofagen die voor morfologische en moleculaire aspecten eerder gepubliceerd 5. De differentiatie van monocyten in macrofagen en de homogeniteit van de kweek werd gevolgd door fase-microscopie. Figuur 1 vertoonde een voorbeeld van primaire, M1 en M2 macrofagen. Zoals geto...

Macrofagen zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij de pathogeniteit van de gastheer. Macrofagen vertonen fenotypische en functionele diversiteit die kan worden geanalyseerd en gedetecteerd door middel van proteomische analyse. Dit artikel beschrijft hoe je 2D-elektroforese uitvoert van primaire culturen van humane macrofagen die zijn gedifferentieerd in M1- of M2-fenotype.

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om het fenotype van humane pro-inflammatoire M1 en anti-inflammatoire M twee macrofaag subpopulaties te analyseren door middel van 2D differentiële in-gel elektroforese. Dit wordt bereikt door eerst eiwitten te labelen die zijn geëxtraheerd uit primaire M1 en M twee macrofaag culturen met sine kleurstoffen. In de tweede stap worden de eiwitten samen gemengd en wordt ISO elektro focussering door rehydratie uitgevoerd op de monsters.Daarna wordt de tweede dimensie, elektroforese uitgevoerd met een gemobiliseerde pH-gradiënt of IPG strips in het donker, en vervolgens worden de gels gescand met de differentiële in-gel elektroforese scanner. Uiteindelijk wordt analyse van de genummerde beelden uitgevoerd om de verschillen in de polyp peptische spots tussen M1 en M twee macrofaag subpopulaties te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals klassieke todi gel elektroforese, is dat deze techniek gevoeliger is en slechts vijf microgram eiwitten vereist, wat erg belangrijk is voor monsters die zijn verkregen van menselijke patiënten.Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door Mario Bove, een PhD student, Olivia Beza en Magac technicus uit mijn laboratorium. Om primaire culturen van monocyt-afgeleide macrofagen voor te bereiden, begint u met het verdunnen van 25 milliliter Buffy coat in 25 milliliter PBS. Laad vervolgens het verdunde bloed voorzichtig op een scheidingsgradiënt en centrifugeer de cellen gedurende 20 minuten bij 1600 Gs en kamertemperatuur wanneer de cellen klaar zijn met draaien. Verzamel de monocyten op de interfacelaag, gevolgd door drie opeenvolgende wasbeurten van de geoogste cellen in 10 milliliter PBS met 0,1% EDTA na de derde wasbeurt.Centrifugeer de cellen nog een keer in PBS alleen en suspendeer vervolgens het pellet in vijf milliliter RPMI 1640 medium zonder serumzaad. De cellen in 35 millimeter schotels bij een dichtheid van een keer 10 tot de zes cellen per schaal, en vervolgens na een 90 minuten durende sedimentatie in de incubator, gooi het supernatant weg en was de aderente monocyten drie keer met een milliliter PBS. Vervolgens, kweek de cellen in 10 milliliter vers medium dat 10% volume per volume menselijk serum bevat gedurende zes dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Vervolgens, om anti-inflammatoire M twee macrofagen te verkrijgen, suppleer sommige van de culturen met 15 nanogram per milliliter van IL vier op dag zes van cultuur om pro-inflammatoire macrofagen op dag 12 te verkrijgen. Behandel de andere culturen van gedifferentieerde macrofagen met 100 nanogram per milliliter van LPS gedurende vier uur om de macrofaag subpopulaties voor 2D elektroforese te isoleren. Was vervolgens de cultuur van belang drie keer met 25 millimolar tris, en laat vervolgens de cellen los vanaf de bodem van de platen met chaps extractie buffer.Vervolgens, breng de cellen over in een 1,5 milliliter micro centrifugeerbuisje en zet ze op vier graden Celsius. Na vijf minuten, breng de cellen over in 100 microliter aliquots naar min 20 graden Celsius opslag tot de eiwitconcentratie analyse voor ISO elektro focussering van de macrofaag subpopulaties. Pas eerst de monsters aan tot negen microliter aliquots, en vervolgens reduceer de celoplossingen met lysis buffer gesupplementeerd met twee millimolar van TCEP bij 37 graden Celsius.Na een uur, incubeer de extracten met S SI drie en S SI vijf bij 37 graden Celsius, stop de reactie na 30 minuten met de toevoeging van een gelijk volume aan monsters buffer. Maak vervolgens twee afzonderlijke mengsels van gelijke volumes van S SI drie gelabelde M1 eiwitten met SCI vijf gelabelde M twee eiwitten. Hydrateer vervolgens een IPG strip met 450 microliters van de gelabelde gemengde monsters in chaps extractie buffer op een iso-elektrisch focussering cel systeem gedurende 24 uur zonder enige stroom toe te passen.De volgende dag, start de focussering bij 300 volt gedurende drie uur, stel vervolgens een gradiënt in tot 1000 volt gedurende zes uur, gevolgd door twee 8.000 volt gradiënten gedurende drie uur elk om tweede dimensie elektroforese uit te voeren. Incubeer de IPG strips in equilibratie buffer. Na 10 minuten, breng de strips over op 12,5% pagina gels en verzegel ze met laag smeltend aros. Gebruik vervolgens een edin dsic systeem bij een constante spanning van 70 volt om de elektroforese uit te voeren bij 20 graden Celsius gedurende de nacht, gevolgd door een 300 volt run totdat de bromo fenol blauw front de bodem van de gel bereikt om beelden van de gels te verkrijgen.Plaats ze tussen de twee laag fluorescente glazen platen van een differentiële en gel elektroforese beeldscanner, en scan de gels bij excitatie emissie golflengten van 5 32, 5 80 nanometer voors drie en 6 33 6 70 nanometer voors vijf om beelden met een pixelgrootte van 100 micrometer te verkrijgen. Analyseer ze met de geschikte software en bereken en normaliseer vervolgens de spot volumes in elk beeld, door een genormaliseerd spot volume toe te wijzen als een verhouding van de totale waarde van elke spot gedetecteerd in de gel. Analyseer de verschillen in eiwit spot volumes voor elk type macrofaag door de genormaliseerde spot volume waarde te vergelijken tussen de twee macrofaag groepen, waarbij het verschil tussen de spot volumes als significant wordt beschouwd als de verandering 1,5 keer is.In dit experiment. De 2D eiwitpatronen van de twee subtypes van macrofagen M1 pro-inflammatoire en M twee anti-inflammatoire werden bepaald door 2D differentiële. In gel elektroforese werd hetzelfde patroon van eiwitten waargenomen voor zowel M1 als M twee onafhankelijk van de gebruikte cyaan kleurstoffen.Interessant is dat bio-informatica analyse van de gel 20 gebieden met spots onthulde, toenames en afnames tussen de spot volumes werden gekwantificeerd zoals gevisualiseerd door de gele, blauwe en groene kleuring. Spots werden beschouwd als een significante differentiële expressie te hebben als de fold change van het genormaliseerde spot volume groter was dan 1,5 met een P waarde minder dan 0,05. Na deze CHE, kunnen methoden zoals kwantitatieve, massaspectrometrie of aanvullende prote

proteomic-profiling-of-macrophages-by-2d-electrophoresis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Dit protocol beschrijft het gebruik van hele-cel MALDI-TOF massaspectrometrie op eukaryote cellen. Hier illustreren we de nauwkeurigheid van deze techniek door de meerdere activeringstoestanden van macrofagen te analyseren als reactie op hun micro-omgeving.

Whole-cell MALDI-TOF massaspectrometrie is een nauwkeurige en snelle methode om verschillende vormen van macrofaagactivering Analyseer

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Hier beschrijven we een protocol dat paren twee proteomics technieken, namelijk de 2-dimensionale elektroforese (2DE) en massaspectrometrie (MS), te identificeren differentieel tot expressie / post-translationeel gemodificeerde eiwitten tussen twee of meer groepen van primaire monsters. Deze aanpak, in combinatie met functionele experimenten, maakt de identificatie en karakterisering van prognostische markers / therapeutische doelen.

Van een 2DE-Gel Spot aan Protein Functie: Lesson Learned From HS1 in Chronische Lymfatische Leukemie

Metabolische herprogrammering is een kenmerkend en vereist kenmerk voor M1 en M2 macrofaagpolarisatie. Dit manuscript beschrijft een test voor de meting van fundamentele parameters van glycolyse en mitochondriale functie in muis-beenmerg-afgeleide macrofagen. Deze tool kan worden toegepast om te onderzoeken hoe bepaalde factoren het metabolisme en fenotype van macrofagen beïnvloeden.

Metabole karakterisering van gepolariseerde M1 en M2 Bone Marrow-afgeleide macrofagen met behulp van real-time extracellulaire Flux Analysis

Dit protocol kan een onderzoeker te isoleren en karakteriseren weefsel-ingezeten macrofagen in diverse hallmark ontstoken weefsels dieet-geïnduceerde modellen van metabolische wanorde is onttrokken.

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

Presenteren we een protocol voor het verkrijgen van proteomic handtekeningen van menselijke macrofagen en dit toepassen op de bepaling van de invloed van een lage zuurstof milieu op macrophage polarisatie.

Proteoom analyse van menselijke Macrophage polarisatie onder een lage zuurstof-omgeving

We beschrijven ons protocol voor het meten van biologische ritmes in eiwit katabolisme via autophagy en het proteasoom in muis lever.

Het meten van de diurnale ritmes in autophagic en Proteasomale flux

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Leer proteomics profilering van M1- en M2-macofagen door 2D-differentiële in-gel elektroforese. Deze gevoelige methode detecteert eiwitvariaties met slechts vijf microgram materiaal voor therapeutisch onderzoek.

Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

Meer video's verkennen