De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om synaptische parameters objectief te kwantificeren, inclusief synapsgrootte, fragmentatie en de relatieve dichtheid van eiwitten in de postsynaptische membraan. Dit wordt bereikt door eerst de betreffende spier uit de experimentele dieren te dissecteren. Vervolgens wordt de gedissecteerde spier cryo-gesecteerd, en de secties worden immuno gekleurd voor fluorescentiemicroscopie.

Vervolgens worden op phos beelden van neuromusculaire juncties van de verschillende behandelingsgroepen objectief bemonsterd, en wordt de relatieve intensiteit van de kleuring voor synaptische specialisaties gekwantificeerd. Uiteindelijk worden reproduceerbare kwantitatieve metingen van de effecten van een behandeling of genetische modificatie op de structurele organisatie van de neuromusculaire junctie verkregen door confocale microscopie. Welnu, deze methode biedt gestandaardiseerde objectieve protocollen met behulp van confocale microscopie om veranderingen in de structuur van de neuromusculaire junctie te beoordelen in muismodellen van aandoeningen zoals myasthenia gravis en motor neuron ziekte.

Over het algemeen kunnen mensen die deze methode proberen het moeilijk vinden omdat het bemonsteren van NPLS op de confocale microscoop op een onbevooroordeelde en objectieve manier planning vereist Na het bemonsteren moet de analyse van NPLS op een consistente en reproduceerbare manier worden uitgevoerd, waarbij de variatie tussen de nplate-parameters van dier tot dier dit moeilijk kan maken. Na het isoleren van cryosecteren en immunofluorescent kleuring, worden muis neuromusculaire juncties of njs, volgens het tekstprotocol, blind gemaakt door ze te labelen met een willekeurig nummer dat alleen bekend is bij een tweede onderzoeker totdat de kwantificering van NMJ-parameters is voltooid. Plaats een schuifje op het microscoopplatform en gebruik een trit C-filterset om het onder breedveldverlichting te bekijken.

Beweeg progressief door de velden van links naar rechts en terug totdat een endplaat verschijnt in het veld met de confocale pinhulp ingesteld op 1,0 airy-eenheid, en gebruik met lage laservermogen de versterkings- en offsetniveaus voor trit C rood BGT bij de endplaat die moet worden afgebeeld. Gebruik vervolgens de 488 nanometer laser om de fit C-fluorescentie te optimaliseren, die synaptofysine vertegenwoordigt, en verzamel vervolgens een Z-stack van de endplaat met een interval van 0,7 micron tussen elke optische plak. Sla de afbeeldingen op met een bestandsnaam die de datum van de beeldacquisitiesessie, de codenaam van de schuif en het nummer van de endplaat bevat.

Herhaal de zojuist gedemonstreerde bemonsterings- en beeldacquisitieprocedure totdat er 20 endplaten van de schuif of het monster zijn verzameld. Herhaal vervolgens het proces voor de resterende gecodeerde schuiven onder dezelfde confocale instellingen. Neem een paar afbeeldingen van de controleschuif.

Gebruik Image J freeware om een Zack te openen en in één fluorescent kanaal een maximale projectie afbeelding voor te bereiden. Sla de projecties op als TIF-bestanden met de bestandsnaam, inclusief de beeldacquisitiesessiedatum, de steekproefcode, het endplatenummer en het fluorescente kanaal. Gebruik nu Image J om de Z-projectie te openen.

Selecteer de acetylcholinereceptor of A CHR-beeldkanaal en selecteer afbeeldingstype acht bit om de 24 bit RGB-gekleurde afbeelding om te zetten in een acht bit grijstintenbeeld op het scherm met het polygoonhulpmiddel. Teken in het rode BGT-kleuringskanaal een ruwe omtrek rond de endplaat van belang, met uitsluiting van elke kleuring die niet afkomstig is van de endplaat van belang. Selecteer afbeeldingsaanpassingsdrempelwaarde om een minimale intensiteitsdrempel toe te passen op de afbeelding.

Stel de drempelwaarde in om de A CHR-gekleurde delen te isoleren terwijl de omringende achtergrondsignaal als subdrempel wordt uitgesloten. Open vervolgens een tweede venster met de originele volledige toon afbeelding voor vergelijking. Om de drempelinstellingen te bevestigen met de polygoon omtrek nog steeds aanwezig, selecteer analyse, analyseer deeltjes in het pop-upmenu.

Specificeer het bereik van maten in aantal pixels als 50 tot oneindig, wat de selectie van kleine artefacten elimineert die voortkomen uit elektrische ruis. Klik in de fotovermenigvuldiger op analyseer deeltjes om een venster te genereren met een lijst van discrete supra-drempelgebieden en hun fluorescentie-intensiteitswaarden genummerd zoals ze verschijnen in de binaire afbeelding. Kopieer deze gegevens naar een gelabelde spreadsheet om het totale endplate-oppervlak te meten.

Selecteer binnen het polygoon Analyseer meten, kopieer en plak de gegevens voor A CHR-gebieden en intensiteiten in een spreadsheet met gelabelde kolommen. Schakel over naar het synaptofysinekanaal. Bereid een maximale projectie afbeelding voor.

Selecteer een gebied van belang en stel de minimale intensiteitsdrempel in zoals net is gedemonstreerd. Om het overlapgebied te meten, past u de volgende stappen toe. Open het originele bestand met de afbeeldingen van de twee kanalen en selecteer afbeeldingsstacks.

Stapel de afbeeldingen om het in twee afzonderlijke afbeeldingen te splitsen. Gebruik de Image J-colocalisatie-invoegtoepassing, selecteer invoegtoepassing colocalisatie en voer de drempelwaarden in die eerder zijn geregistreerd voor de A CHR- en zenuwkanalen in het respectieve kanaalqueryvakje. Het resultaat is een overlapafbeelding in witte pixels.

Converteer de nieuw gemaakte overlapafbeelding naar een grijstintenformaat en pas een drempel toe op de maximale waarde, die alleen de witte pixels selecteert die overeenkomen met het overlapgebied van de twee vorige kanalen. Noteer in de spreadsheet de resulterende waarde van de colocaliserende gebied, die het overlapgebied in pixels vertegenwoordigt, bereid een spreadsheet van gegevens voor. Steekproefberekeningen en plot standaardafwijkingen en standaardfouten als histogrammen of spreidingsdiagrammen.

Plot en plateer A CHR-gebieden als spreidingsdiagrammen of frequentiehistogrammen om te bepalen of de gegevens normaal verdeeld zijn vóór statistische tests. Na het voorbereiden van immunofluorescente kleuring en beeldacquisitie van transversale spiervezelsecties zoals beschreven in het tekstprotocol, opent u een origineel afbeeldingsbestand en terwijl u de A CHR-kanaal bek