Methode voor de evaluatie van de effecten van een golflengtebereik en intensiteiten van Rood / nabij-infrarood Lichttherapie op oxidatieve stress In Vitro

Het algemene doel van de volgende procedure is om de effecten van een reeks golflengten en intensiteiten van rood nabij infrarood lichttherapie op oxidatieve stress in vitro te beoordelen. Om dit te doen, hebben we een nieuwe methode ontwikkeld om het licht te leveren waarbij we de golflengte en geleverde intensiteit kunnen manipuleren. We monteren een xenon- of breedbandlichtbron in een behuizing op een metalen basis en plaatsen vervolgens een coatinglens, waterfilter en toegangsopening voor de lichtbron.

De volgende stap van de procedure is om het licht dat wordt gegenereerd door de breedbandlichtbron door de toegang, opening en vloeibare lichtgeleider te leiden en door een tweede coatinglens. Vervolgens worden bandbreedte- en neutrale dichtheidsfilters geplaatst om de gewenste golflengte en intensiteit van het licht te verkrijgen. Merk op dat de filters doorgang toestaan van een smal bereik van golflengten, ook wel een golfband genoemd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor de levering van rood nabij infrarood lichttherapie, zoals LED's of lasers, is dat het nauwkeurige en gekalibreerde manipulatie van golflengte- en intensiteitsparameters mogelijk maakt. Dit stelt ons in staat om de levering van het licht te optimaliseren voor de beste biologische resultaten. De huidige studie past dit toe op gedissocieerde cellen. Bovendien kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals organotypische modellen van neurotrauma.

Wanneer u met een Bright breedbandlichtbron werkt, zorg er dan voor dat u niet direct in de lichtbron kijkt, omdat dit permanente visuele schade kan veroorzaken. Om het lichtleveringsapparaat voor te bereiden, sluit u een breedbandlichtbron zoals een xenon- of gloeilamp aan op een geschikte voeding. Plaats een collimatorlens voor de lichtbron om een gecollimeerde lichtbundel te produceren.

Laat het licht door een vloeibare hittefilter gaan om het grootste deel van de hitte uit de lichtbundel te verwijderen. Plaats een collimatorlens voor de lichtbron om een gecollimeerde lichtbundel te produceren. Laat het licht door een vloeibare hittefilter gaan om het grootste deel van de hitte uit de lichtbundel te verwijderen.

Afhankelijk van de toepassing, focus de gecollimeerde straal op de toegangsopening van een vloeibare lichtgeleider om een meer flexibele levering van het licht mogelijk te maken. Aan de andere kant van de vloeibare lichtgeleider plaatst u een tweede coatinglens en vervolgens een houder voor de interferentie- en neutrale dichtheidsfilters. Deze opstelling moet een gelijkmatig verlichte lichtvlek van de gewenste golfband en intensiteit produceren.

De afstand tussen het uiteinde van de lichtgeleider en het vlak van het monster kan variëren, afhankelijk van het gebied dat moet worden verlicht. Het is belangrijk om te onthouden dat volgens de inverse kwadratenwet, naarmate de afstand van het uiteinde van de lichtgeleider toeneemt, de lichtintensiteit in de huidige studie zal afnemen. Deze afstand is 14 centimeter, wat resulteert in de productie van een straaldoorsnede die een oppervlakte van drie bij drie putjes op een 96-putjes weefselkweekplaat gelijkmatig verlicht.

Zorg ervoor dat strooilicht van de lamp en bijbehorende optische componenten niet andere monsters kan bereiken, bijvoorbeeld door zwart karton te gebruiken. Zodra het apparaat is geconstrueerd, zet u de waterkoeler voor het vloeibare hittefilter aan en zorg ervoor dat er een wateruitwisseling plaatsvindt door de filtermantel. Zet de lampvoeding aan en wacht minimaal vijf minuten voor de breedbandlichtbron.

Om te stabiliseren, selecteert u een smalbandinterferentiefilter om de gewenste golfband van verlichting te genereren. Meet het licht geproduceerd door de lamp op het vlak waar het monster moet worden geplaatst. Tijdens de behandeling.

Licht wordt gemeten met behulp van een gekalibreerd stralingsintensiteitssonde verbonden met een geschikte spectra.Radiometer. Gebruik neutrale dichtheidsfilters om de lichtintensiteit aan te passen totdat de gewenste output is verkregen. In de huidige studie wordt de intensiteit van het licht dat door elke interferentiefilter wordt doorgelaten aangepast om een gelijke kwaliteit output te geven bij elk van de vier behandelingsgolfbanden.

De beschreven methode voor de levering van rood nabij infrarood lichttherapie kan worden toegepast op elk celtype of in vitro modelsysteem. Hier tonen we onze techniek voor de levering van licht aan cellen met behulp van feochromocytoma of PC 12 cellen. Als voorbeeld, kweek cellen in groeimedium.

In 96 putjes met trays gecoat met polyol lysine tot ze 70 tot 80%confluent zijn. Bereid de gewenste concentratie glutamaat of alternatieve stressor in volledige groeicultuurmedia. Hier gebruiken we 10 millimolair glutamaat.

Verwijder media uit de cellen en was ze voorzichtig drie keer met fosfaatbufferoplossing. Na het wassen, voeg glutamaatbevattend media toe tot een totaal volume van honderd microliter per putje. Onmiddellijk na toevoeging van glutamaat of de gekozen stressor, stelt u cellen bloot aan lichtbehandeling op de gewenste golflengten en intensiteiten door de kweekplaat onder het voorbereide lichtleveringsapparaat te plaatsen.

Zorg ervoor dat u de kwaliteit van de lichtstraal aanpast met behulp van de vastgestelde combinaties van neutrale dichtheidsfilters. Afhankelijk van de golflengte die wordt toegediend. Na voltooiing van de lichtbehandeling, plaats de cellen op een vlak oppervlak en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in door koolstofdioxide gereguleerde omstandigheden.

Aanvullende doses rood nabij infrarood lichttherapie kunnen ook worden toegediend. Voordat u de laatste ronde van lichtbehandeling uitvoert, bereidt u de reagentia voor die zullen worden gebruikt voor de detectie van reactieve zuurstofsoorten als indicator van oxidatieve stress. Hier gebruiken we aangegeven diëten die fluoresceren wanneer ze reageren met een reeks reactieve soorten, inclusief dilu, fluoresceïne D acetaat, breng lichtbehandeling toe aan de cellen zoals beschreven in stap vier, zorg ervoor dat de cellen worden behandeld met de gewenste flus en golflengten van licht.

Onmiddellijk na lichtbehandeling, verwijder het glutamaat bevattende media en was twee keer met PBS. Ga verder met de assays met behulp van indicatorkleur