Nutrient verordening door continue toevoer voor grootschalige uitbreiding van zoogdiercellen in sferoïden

Het algemene doel van dit proces is om een groot aantal cellen onder gecontroleerde voedingsomstandigheden te kweken. Gebruik conventioneel apparatuur die in een celkweeklaboratorium te vinden is. De bijbehorende algoritmen maken het mogelijk om voedingsstoffen binnen experimentele bereiken te beheersen en te manipuleren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen voor grootschalige celkweektoepassingen. Zoals humane cellulaire therapieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de kweek van cellen op grote schaal met een uniforme verdeling van voedingsstoffen en gassen mogelijk maakt.

Dit maakt hogere celdichtheden mogelijk dan statische of bulk gevoede celculturen, verhoogt de opbrengst en vermindert celverlies. Dit kan worden gedaan met apparatuur die gebruikelijk is in de meeste celkweeklaboratoria. Visuele demonstratie van deze methode kan nuttig zijn voor nieuwe onderzoekers, aangezien deze technieken moeilijk te beheersen zijn, vanwege het grote aantal stappen dat in een specifieke volgorde onder steriele omstandigheden moet worden uitgevoerd.

Verzamel de vijf primaire componenten die nodig zijn voor het voedingssysteem. Een mediumreservoir, peristaltische pomp, geroerde bioreactor, afvalreservoir en op maat ontworpen slangenmonsterset. Maak het mediumreservoir aan met behulp van een glazen fles van één liter.

Het afvalreservoir met een glazen fles van twee liter. De geroerde bioreactor met een glazen reactor van 250 ml volume. Gebruik een digitale peristaltische pomp, of een vergelijkbare pomp met een achtkanaals pompkop om de mediumuitwisseling te regelen.

Monteer de reservoirs en gemodificeerde bioreactordeksels van hard en autoclaveerbaar plastic. Met doorlaatpoorten van roestvrij staal om ventilatie te bieden door steriele filters en om mediumoverdracht tussen reservoirs en bioreactoren mogelijk te maken. Bevestig een uitlaatbuis gemaakt van poreuze glazen beluchtingsbuizen aan het gemodificeerde geroerde suspensiebioreactordeksel.

Monteer autoclaveerbare perfusieslangensets uit polyvinylideenfluoride slangverbindingen en duurzame peristaltische pompslangen. De lengte van het sectie is afhankelijk van de afstand tussen de verschillende componenten. Monteer de voedingslijn met behulp van twee slangdiameters.

Gebruik L/S 14 voor de primaire slang die de afstand van de bioreactor tot het mediumreservoir zal overbruggen. Voeg een korte lengte L/S 13 slang in het midden van de slanglengte toe voor de pompsectie, met behulp van de juiste PVDF-adapters. Gebruik standaard PVDF slangklemadapters om twee stukken L/S 14 slang aan beide zijden van de kortere pompsectieslang te verbinden.

Monteer de sectieslangsectie voor afvalverwijdering met behulp van een grotere diameter L/S 16 slang, en voeg een korte sectie L/S 14 slang in het midden in voor de pompsectie. Dit gebeurt op dezelfde manier als de montage van de voedingslijn met behulp van PVDF slangklemadapters. Monteer het laatste onderdeel van de slangenset door de set te construeren uit drie korte L/S 14 slanglengten.

Verbind deze met een T-type HVDF-connector en twee kleine slangklemmen op twee van de slanglengten. Verbind de monsterassemblage met de roestvrijstalen monsterstekker die op het deksel van de bioreactor is bevestigd. Na sterilisatie wordt een steriele gasfilter aan een van de geklemde lengten bevestigd voor gasafvoer.

De andere wordt gebruikt voor aansluiting op een steriele monsterspuit. Autoclaveer de monstersassemblage terwijl deze is aangesloten op de bioreactor, voorafgaand aan het begin van het experiment zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik deze assemblage om steriele monsters uit de bioreactor te verzamelen zoals nodig is, zonder het continue voedingsproces te verstoren.

Bevestig steriele ventilatie aan de juiste locaties op de deksels van de spinnerfles, het mediumvat, afvalvaten en monstersteekpunten. Kweek en oogst de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Laat de cellen twee tot drie minuten in trypsine bij kamertemperatuur incuberen in een bioveiligheidskast en verzamel ze vervolgens in een conische buis.

Een kleine celmonster wordt vervolgens verzameld en gekleurd met trypanblauw. Tel de celdichtheid met behulp van een microscoop en standaard hemocytometer met trypanblauwkleuring zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg het gewenste aantal totale cellen toe aan steriele geroerde suspensiebioreactoren voor elke conditie.

Voeg het medium toe aan de geroerde suspensiebioreactor met behulp van een pipet om het gewenste totale kweekvolume te bereiken. Verplaats de geroerde suspensiebioreactor met cellen naar een roerplaat in een celkweekincubator. Kweek cellen in de bioreactoren zonder voeding gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius, met 5% koolstofdioxide, 100% relatieve vochtigheid en een roersnelheid van 70 rpm om sferoïden te laten vormen.

Na de vorming van sferoïden verwijdert u de geroerde suspensiebioreactor uit de incubator. Monteer de componenten voor het continue voedingssysteem in een biologische veiligheidskast. Vul eerst een vers mediumreservoir met het gewenste kweekmedium en verbind dit vervolgens aan een zijde van de voedingslijn.

Zorg er ook voor dat het verse mediumreservoir goed is geventileerd met een steriele filter. Een steriele filter moet worden vervangen op de inlaatpoort van de bioreactor om het medium te filteren voordat het de bioreactor binnenkomt. Verbind de afvoerlijn met het mediumafvalreservoir en zorg ervoor dat het afvalreservoir goed is geventileerd met een steriele filter.

Plaats de geroerde suspensiebioreactor op de roerplaat in de incubator met behulp van dezelfde kweekparameters als voor sferoïdevorming. Plaats het verse mediumreservoir in een nabijgelegen mini-koelkast. Zorg ervoor dat de voedingslijnen de koelkast kunnen verlaten zonder dat de deuren niet kunnen worden gesloten.

Het is ook van cruciaal belang dat de voedingslijnen niet worden dichtgeklemd door de deuren van de koelkast of de incubator. Het afvalmediumreservoir kan buiten de incubator op het laboratoriumblad worden geplaatst op een geschikte locatie. Leidt de resterende slanguiteinden naar de incubator en verbind de voedingslijn met de filter op de inlaatpoor