Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

Het algemene doel van deze procedure is om een gestroomlijnd protocol te bieden dat snel oogdoorvoer mogelijk maakt, gelijktijdige verwerking van volbloedmonsters. In een niet-klinische omgeving wordt de verwerking van vacutainers op een overlappende manier uitgevoerd om efficiënte isolatie van hoge kwaliteit fracties van D-N-A-R-N-A perifere bloed mononucleaire cellen of PBMC serum en restfracties van plasma en rode bloedcellen mogelijk te maken. De verwerking begint met centrifugatie van de serum vacutainer, verwijdering van een aliquot uit één fial bevattende vacutainer voor DNA-isolatie, centrifugatie van de fialbuisjes.

Vervolgens kan na voltooiing van de DNA-isolatie, na DNA-isolatie leukocytenafgeleide RNA-isolatie uit de K twee EDTA vacutainer plaatsvinden. Het bloed uit elke vacutainer wordt door een respectieve filter gevoerd en gewassen met PBS, vervolgens behandeld met een RNA-stabilisatiemiddel en teruggevoerd naar de fial bevattende vacutainer. Het resterende plasma wordt afgezogen en de mononucleaire laag wordt gewassen met PBS.

Terwijl de buisjes draaien, worden de resterende rode bloedcellen verzameld en wordt het gescheiden serum gealiquoteerd. Ten slotte worden PBMC bewaard in celbevriezingsmedium. Uiteindelijk kunnen hoge kwaliteit fracties van vers bloed binnen twee uur na verzameling worden geproduceerd en kunnen alle voor bemonstering klaar zijnde specimens binnen twee dagen beschikbaar zijn.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat de procedures gelijktijdig in een niet-klinische omgeving kunnen worden uitgevoerd, waardoor uitgangsmateriaal binnen twee dagen wordt geproduceerd voor een veelvoud aan downstream toepassingen, inclusief microarray epigenetische real-time R-T-P-C-R en flowcytometrie analyses. De procedure zal worden gedemonstreerd door Amy Weckl, mijn laboratoriummanager. Om te beginnen met de verwerking van volbloedmonsters. Zorg ervoor dat de buffers, centrifuge en hitteblok allemaal zijn voorbereid.

Documenteer de tijd van de vacutainerlevering op de monstertraceringssheet. Na ontvangst van de monsters, documenteer de serumisolatie. Starttijd op het monsterlogboek en begin onmiddellijk met verwerken door de zeven milliliter serumvacutainer te centrifugeren met de rem en versnelling uit.

Gebruik een zwenkrotor met aërosolcaps gedurende 20 minuten bij 1300 GS vier graden Celsius terwijl de serumvacutainer wordt gecentrifugeerd. Documenteer de starttijd van de DNA-isolatie in een BSL twee cellencultuur kap. Draai de vacucontainers met het fialgel vijf keer om en voeg 200 microliters volbloed toe vanaf de bovenkant van een van de vacutainers in elk van de twee 20 microliter aliquots van protease.

Laat de protease en bloed microcentrifugebuisjes in de kap en ga verder met de centrifugatie van de call bevattende vacucontainers. Documenteer de PBMC-isolatiestarttijd, die binnen twee uur na het afnemen van het bloed moet zijn.

Draai de FI call bevattende vacucontainers die al in de aërosoldichte containers zijn acht tot tien keer om. Centrifugeer vervolgens de vacutainer met de rem en versnelling uit gedurende 30 minuten bij 1600 GS 22 graden Celsius. Keer terug naar de DNA-isolatie monsters in de kap en voeg 200 microliters buffer al toe aan elk van de protease en bloed microcentrifugebuisjes.

Deksel de buisjes af en verwijder ze uit de kap. Vortex ze vervolgens gedurende 15 seconden. Na het vortexen, draai de monsters onmiddellijk snel rond.

Ga door met DNA-isolatie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol totdat de DNA uit de kolom wordt geëlueerd bij Ellucian. Pool de DNA van de twee kolommen per deelnemer voor een totale opbrengst van 800 microliters per deelnemer. Documenteer de starttijd van leukocyte RNA-isolatie.

Doorboor het rubberen septum van de K twee EDTA vacutainer met een overdrachtsspits. Bewaar de mantel en schroefdop voor later gebruik na montage van het K twee EDTA buisjessysteem. Gebruik het uiteinde van een metalen spatel om de naald veilig los te maken en steek de naald in een lege 10 milliliter geëvacueerde bloedopnamebuis.

Draai de K twee EDTA vacutainer filterontvangersbuisassemblage om de installatie te voltooien Na filtratie en een PBS-was, trek drie milliliter van het RNA-stabilisatiemiddel aan met een nieuwe 10 milliliter spuit. Spoel de filter en zorg ervoor dat het RNA-stabilisatiemiddel is bevestigd. Trek vervolgens de spuit van de filter af zonder de plunjer terug te trekken.

Versluit de filterinlaat en -uitlaat met de mantel en schroefdop die van de overdrachtsspits zijn behouden en laat de filter verzadigd met het RNA-stabilisatiemiddel. Bewaar de filter op min 80 graden Celsius gedurende ten minste twee uur totdat de tijd het toelaat om de RA-isolatie te voltooien. Zodra de vacutainer is teruggekeerd naar de BSL twee kap, verwijder de stopper en gebruik een serologische pijp om 1,5 milliliter van de bovenste plasmalaag te trekken zonder dicht bij de mononucleaire laag te komen.

Breng het plasma van de twee vacutainer over naar een vijf milliliter cryo vial. Log vervolgens het verzamelde volume. Breng het resterende plasma en de mononucleaire laag over naar een 15 milliliter conische buis met behulp van een serologische pijp.

Voeg vervolgens genoeg eerder bereid een XPBS toe om het totale volume in de conische buis op te brengen tot 15 milliliter. Deksel de buis af en draai hem vijf keer om. Centrifugeer vervolgens de buis met de rem en versnelling uit gedurende 15 minuten bij 300 GS 22 graden Celsius.

Keer terug naar de fial bevattende vacucontainers in de kap en verzamel de rode bloedcellen of RBC's. Gebruik een vijf en drie kwart inch pastierpijp om rond te draaien en de buitenkant van de fialgellaag los te maken en verwijder hem. Gebruik een serologische pijp om de RBC's te verzamelen en over te brengen naar een vijf milliliter cryo vial.

Log vervolgens het volume. Breng vervolgens de plasma- en RBC-cryo vijlen over naar een container voor bevriezing met gecontroleerde snelheid en bewaar ze op min 80 graden Celsius gedurende ten minste 24 uur. Na 24 uur, breng de monsters over naar een cryo box en plaats ze terug op min 80 graden Celsius voor langdurige opslag.