Generatie van plasmide vectoren die-FLAG tagged eiwitten onder de verordening van de Mens elongatiefactor-1α Promoter Met behulp van Gibson Vergadering
9 februari 2015
De synthese van aangepaste plasmiden is arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson-assemblage-klonering om de werk en duur van de procedure voor aangepaste DNA-klonering te verminderen. Het beschreven protocol produceert ook betrouwbare getagde eiwitconstructies voor zoogdierexpressie tegen vergelijkbare kosten als de traditionele cut-and-paste DNA-klonering.
Het algemene doel van deze procedure is om de Gibson-assemblagebenadering te gebruiken om grote, complexe DNA-constructen te creëren die korte en lange segmenten uit verschillende DNA-bronnen combineren. Eerst wordt computationeel de volledige nucleotidesequentie van de plasmiden ontworpen en vervolgens worden overlappende primersets ontworpen. Vervolgens worden DNA-sjablonen voor de assemblagereactie versterkt door PCR.
Vervolgens wordt een zuivering van de PCR-producten uitgevoerd. De laatste stap is de transformatie van de resulterende plasmiden en plasmide-klonering en verificatie in de assemblagereactie. Uiteindelijk wordt de Gibson-assemblagereactie gebruikt om parallel plasmiden te ontwikkelen die flag-gelabelde versies van de wilde type en mutante CSTF 64-eiwitten bevatten onder de transcriptionele regulatie van de humane verlengingsfactor een alfa-promotor.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals traditionele DNA Corning, is dat het parallel kan creëren, vergelijkbaar in ontwerp, wilde type en mutante plasmiden zonder sequentiële Corning-stappen. Ontwerp een continue nucleotidesequentie om het uiteindelijke plasmide te vertegenwoordigen. Vermeld nu de werkelijke plasmiden en DNA-fragmenten die als sjablonen in PCR-bestel-DNA-fragmenten zullen worden gebruikt die niet gemakkelijk beschikbaar zijn, zoals verschillende combinaties van tags en promotors als enkele of meerdere synthetische dubbelstrengs DNA-fragmenten.
Deel vervolgens de continue nucleotidesequentie van de uiteindelijke constructie op in DNA-fragmenten die geschikt zijn voor PCR. Bevestig dat de fragmenten overeenkomen met beschikbare plasmiden en synthetische DNA-fragmenten. Vermijd DNA-fragmenten kleiner dan 200 nucleotiden.
Ga vervolgens naar de primergeneratietool, selecteer het setvoorkeurenmenu in het pop-upvenster Gibson-assemblage-instellingen wijzigen. Selecteer het tabblad pres wijzigen, selecteer vervolgens het menu constructie bouwen om de gesplitste DNA-fragmenten in de primergeneratietool sequentieel vanaf het vijf prime tot het drie prime-uiteinde in te voegen. Open het venster vector invoeren of fragment invoegen, plak het eerste DNA-fragment dat het vijf prime-uiteinde van het vector-DNA in fast A-indeling vertegenwoordigt en noem dit DNA-fragment.
Kies de juiste manier om het DNA-fragment te verkrijgen. Klik vervolgens op het tabblad doorgaan. Als er extra nucleotiden of restrictieplaatsen moeten worden toegevoegd op de kruising van de uiteindelijke constructie, open dan het fragment toevoegen en invoegen in de assemblagevenster in de vooruit- of achteruitprimerruimte.
Voer de extra nucleotiden of restrictieplaatsen in slechts één van de DNA-fragmenten in. Klik vervolgens op het tabblad klaar. Herhaal dit voor alle fragmenten totdat de constructie compleet is.
Selecteer het menu primers bekijken en bekijk de primersequenties. Herhaal dit ook voor alle constructies, vectoren, backbones en inserts of voor DNA-fragmenten die anders zijn. Verdun de PCR-primers tot 10 micromolar in water of te-buffer.
Verdun vervolgens alle DNA-sjablonen en enkele streng synthetische DNA's voor de PCR's tot één nanogram per microliter in water. Stel de PCR-reacties samen bij kamertemperatuur door 2,5 microliter van 10 micromolar van elke primer te combineren. Eén microliter van het een nanogram per microliter sjabloon-DNA-fragment 25 microliters heet.
Start het corrigeren van DNA-polymerase en 19 microliter water. Meng de buis door voorzichtig te klappen en verzamel de vloeistofdruppels door kort te centrifugeren. Amplificeer tegelijkertijd in afzonderlijke buizen de DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte volgens de aanbevelingen voor de gebruikte DNA-polymerase.
Voer 25 tot 28 PCR-cycli uit of bepaal het aantal cycli dat voldoende DNA-opbrengst produceert. Los vijf microliter van de PCR op met behulp van standaard AROS-gelelektroforese. Controleer of een enkele DNA-band die het PCR-product vertegenwoordigt, zichtbaar is.
Bepaal de grootte en relatieve hoeveelheid van de DNA-fragmenten met behulp van de DNA-molecuulgewichtsstandaarden, herhaal indien nodig de PCR om voldoende DNA-fragmenten te verkrijgen. Breng de PCR's over die vooraf zijn bewerkt met DPN een naar 1,5 milliliter buizen en voeg 81 microliter DNA-zuiveringsmagnetische kralen toe aan elke buis. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Plaats de buizen gedurende twee minuten op de magnetische collector. Gooi nu de heldere vloeistof weg. Was tweemaal met 200 microliter 80% ethanol gedurende 30 seconden.
Hierop worden de gedroogde kralen opgehangen in 10 microliter 10 millimolar tris hydrochloride pH 8,0 Na twee minuten kort draaien en de buizen vervolgens twee minuten op de magnetische collector plaatsen. Verwijder 8,5 tot 10 microliter van de heldere oplossing en plaats deze in een nieuw vooraf gelabeld buisje. Bepaal de concentratie van de DNA-fragmenten door UV-spectroscopie.
Gebruik ten minste 100 nanogram DNA-fragment dat de vectorbackbone of het DNA-fragment dat de selectieve marker draagt, vertegenwoordigt. Bereken de drievoud overmaat voor de DNA-fragmenten die als inserts zullen worden gebruikt. Meng de berekende hoeveelheden DNA-fragmenten in een PCR-buis.
Pas vervolgens het volume aan tot 10 microliter. Voeg 10 microliter van de Gibson-assemblage-mastermix toe. Incubeer de reactie gedurende 50 graden Celsius in een PCR-thermocyclus.
Ga verder met transformatie van het assemblageproduct incompetente e coli, of bevries de producten bij min 20 graden Celsius totdat ze nodig zijn. Volg de transformatieprocedure die bij de chemische of elektrocompetente cellen wordt geleverd. Gebruik meestal twee microliter van de assemblagereactie per transformatiereactie.
Bevestig tenslotte het succes van de DNA-klonering door DNA-sequencing met specifieke of standaard primers. Analyseer de sequencinggegevens op nauwkeurigheid. Dit experiment was ontworpen om het kleefstimulatiefactor-eiwit 64 en ook mutant CSTF 64 te klonen.
Eiwitten gefuseerd met een drie x flag-tag onder de expressionele regulatie van de HE F1 alfa-promotor. Een plasmide met HE F1 alfa gevolgd door een drie x flag-tag was niet beschikbaar voor ons. Er waren echter de volgende plasmiden beschikbaar.
PC DNA 3,1 M hiss HF een alfa bevattend plasmide en muis CSTF 64-plasmiden. De
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van Gibson assembly cloning om de synthese van aangepaste plasmiden te stroomlijnen, waardoor de tijd en arbeid die gepaard gaan met DNA-klonering aanzienlijk worden verminderd. Het maakt de creatie van betrouwbare getagde proteïneconstructen voor expressie in zoogdieren mogelijk tegen kosten die vergelijkbaar zijn met traditionele methoden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Moleculaire biologie
- Genetische modificatie
- Proteïne-expressie
Achtergrond
- De synthese van aangepaste plasmiden is traditioneel arbeidsintensief.
- Gibson assembly maakt de parallelle creatie van plasmiden mogelijk.
- Getagde eiwitten zijn essentieel voor het bestuderen van eiwitfuncties.
- Efficiënte kloningstechnieken zijn cruciaal voor genetisch onderzoek.
Doel van de studie
- Om het proces van het creëren van complexe DNA-constructen te vereenvoudigen.
- Om wild-type en mutante plasmiden gelijktijdig te produceren.
- Om de efficiëntie van plasmidassemblage voor expressie in zoogdieren te verhogen.
Gebruikte methoden
- Ontwerpen van overlappende primer-sets voor DNA-assemblage.
- Amplificeren van DNA-templates via PCR.
- Zuiveren van PCR-producten vóór assemblage.
- Transformeren van competente E. coli met geassembleerde plasmiden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle assemblage van plasmiden die flag-getagde CSTF 64-eiwitten bevatten.
- Verificatie van plasmideconstructen via sequencing.
- Demonstratie van de voordelen van parallelle assemblage ten opzichte van traditionele methoden.
- Productie van constructen onder regulatie van de menselijke elongatiefactor één alfa-promotor.
Conclusies
- De Gibson assembly-methode vermindert de kloningstijd aanzienlijk.
- Het maakt de efficiënte productie van getagde proteïneconstructen mogelijk.
- Deze aanpak kan worden toegepast op diverse genetische modificatieprojecten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
De snelle, parallelle generatie van aangepaste plasmidvectoren met behulp van Gibson assembly maakt de efficiënte productie van getagde proteïneconstructen mogelijk voor functionele studies in mammaliaanse systemen. Deze aanpak pakt de knelpunten rondom de stabiliteit van promoter-gestuurde expressie en de beschikbaarheid van constructen aan, wat workflows voor vroege ontdekking en targetvalidatie ondersteunt. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen en versnelt de portfolio-triage door de kloneringscycli te verkorten en de betrouwbaarheid van constructen te verhogen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt snelle analyse van genfuncties mogelijk via aanpasbare expressieconstructen.
- Faciliteert mechanistische risicovermindering door parallelle studies naar wild-type en mutante eiwitten te ondersteunen.
- Verbetert de voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door stabiele genexpressie in stamcelmodellen te waarborgen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde expressievectoren voor voor downstream fenotypische of biochemische assays.
- Ondersteunt assay-standaardisatie door reproduceerbare constructgeneratie mogelijk te maken met gedefinieerde tags en promotors.
- Versnelt de screeningparaatheid door de tijdlijnen voor de assemblage van constructen te verkorten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Stemt het ontwerp van het construct af op ziekterelevante systemen door expressie in mammalische stamcellen mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door middel van robuuste promoter-gestuurde expressie.
- Vermindert het risico op verlies van expressie, wat translationele biomarkerstudies ondersteunt waar relevant.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode op basis van Gibson assembly wordt geïntegreerd in de vroege fasen van ontdekking en assay-ontwikkeling, waardoor de kloof tussen constructontwerp en functionele validatie in zoogdiersystemen wordt overbrugd.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door snelle generatie van constructen mogelijk te maken voor studies naar genfuncties.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare plasmiden met potentieel voor kwantitatieve output.
- Analytiek: Levert sequentieverifieerde constructen, wat een betrouwbare vergelijking van de effecten van wild-type en mutante eiwitten ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert expressie in ziekterelevante stamcelmodellen, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een schaalbare, herbruikbare workflow voor toekomstige behoeften aan constructen over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar genfuncties.
- Operationele waarde: Standardiseert en versnelt de generatie van constructen met een hoge reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie door het verkorten van kloneringscycli.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van gevalideerde targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in computationele sequentie-ontwikkeling en tools voor primergeneratie.
- Toegang tot PCR-, DNA-zuiverings- en sequencingsinfrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van constructontwerp en verificatiestappen over teams heen.
- Aanpasbaar aan diverse modelsystemen door selectie van geschikte promotoren en tags.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van template-DNA's en de doorlooptijden voor de inkoop van synthetische DNA-fragmenten.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
In Silico Design: Final Plasmid and Overlapping Primers
3:58
Amplification of the DNA Fragments
5:44
DNA Purification Using Magnetic Beads
6:58
Assembly Cloning Reaction and Transformation of the Products in E. coli
8:21
Results: Cloning of CstF-54 and CstF-64 Mutants Under the Transcriptional Regulation of Human Elongation Factor 1α Promoter
9:47
Conclusion
