Name: Flowcytometrie Protocollen voor Surface en intracellulaire Antigen Analyses van Neural Cell Types (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Leer flowcytometrie voor oppervlakte- en intracellulaire antigeenanalyse van neurale celtypen. Dit protocol toont hoe je neurale cellen uit weefselkweek of primair weefsel prepareert voor multikleurenflowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ons onderzoeksprogramma wordt gefinancierd door het Emmy Noether-programma van de Duitse Onderzoeksstichting (DFG), subsidie PR1132/3-1. Verdere ondersteuning door de Müller-Fahnenberg Stichting van de Universiteit van Freiburg wordt met dank erkend. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Excellence Initiative van de Duitse Onderzoeksstichting (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Neurale Cell Oogsten <ol><li> Beoordeling door microscoop: <ol><li> Voorafgaand aan de start van een experiment, controleer dan de status van de cultuur met heldere-veld of fasecontrastmicroscopie. OPMERKING: Terwijl de primaire neuraal weefsel verkregen van dissecties is, in beginsel, ook vatbaar voor cytometrieanalyse 14,28 stromen, let op dat de focus van het protocol is op cellen verkregen uit in vitro neurale cel systemen. </li></ol></li><li> Oogsten cellen 7: <ol><li> Voorzichtig wassen de schotel / kolf van hechtende cellen met Mg2 + / Ca2 + vrij met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld 5 ml voor T75 kolf, 3 ml per putje 6-well plaat, of 10 ml van 10 cm schotel). OPMERKING: De PBS gebruikt in het protocol is Mg 2+ / Ca 2+ gratis. <ol><li> Voor de video Gebruik bijvoorbeeld een T75 fles van SH-SY5Y neuroblastomacellen op 80% confluentie. Breng additionele wasstappen wanneeraanzienlijke afval is aanwezig in de schotel. </li><li> Overweeg wast met serum-albumine met PBS 48, Percoll, of Ficoll- 49 centrifugeren gradiënten en / of in de handel verkrijgbare kralen 50,51. Verwijdering van myeline en andere lipide of andere verontreinigingen kritisch, vooral wanneer volwassen primaire weefselbronnen worden gebruikt. </li></ol></li><li> Voeg voorverwarmde (37 ° C) trypsine vervanging door een geschikt volume dat het gehele oppervlak van het weefselkweekvat omvat. OPMERKING: U kunt ook overwegen Accutase of andere enzymatische vertering opties. Deze cruciale stap kunnen een negatieve invloed hebben op het oppervlak epitoop expressie (zie 7). </li><li> Incubeer de schotel / kolf bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten (afhankelijk van het celtype) om cellen los. Tik voorzichtig de weefselkweek schip of spoelen met een serologische pipet om de cellen te verwijderen. Voorkomen dat over de spijsvertering (want dit kan de cel verlies en stolling in latere stappen veroorzaken). </li><li> Quench de trypsine vervangen door toevoeging tweemaal de volumestroom buffer (2% FBS in PBS) en verzamelen van de cellen in een 15 ml conische buis. </li><li> Voorzichtig vermaal de celsuspensie met een microliter pipet (100 - 1.000 III) of 5 ml serologische pipet om een ​​celsuspensie te bereiden. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 220 g gedurende 5 min bij 25 ° C. Zuig voorzichtig het supernatant het verlaten van de pellet achter. </li><li> Resuspendeer de pellet in een geschikt volume flow buffer, afhankelijk van de grootte van de pellet (bijvoorbeeld voor een confluente T75 fles van SH-SY5Y cellen typisch rendement ten minste 10 x 10 6 cellen, waarbij de cellen zijn geresuspendeerd in 5 ml buffer stroming). OPMERKING: Als grotere brokken of stolling worden waargenomen, filtreer door een 30-100 micrometer mesh. </li></ol></li><li> Celtelling 52: <ol><li> Breng een kleine hoeveelheid van de celsuspensie aan een microcentrifugebuis en verdund in een gedefinieerde verhouding in een volume van trypan blauw of een alternatief levensvatbaarheid kleurstof vóór de overdracht naar een hemocytometer of geautomatiseerde cel telsysteem. </li><li> Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 1 x 10 6 levensvatbare cellen / ml door toevoeging van de juiste hoeveelheid stroom of PBS met 0,1% BSA (als verdergaat met CFSE labeling). OPMERKING: Propidiumjodide, 7-amino-actinomycine D, annexine V en commercieel verkrijgbaar bevestigbaar levensvatbaarheid assay kits vertegenwoordigen alternatieve mogelijkheden om de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen. Ook apoptose assays met caspase-3 fluorescentie zoals eerder beschreven 53 worden gebruikt. TL-kanalen zal worden &quot;bezet&quot; door deze reagentia die de mogelijkheden voor verdere stappen kunnen beperken indien opgenomen in alle monsters. </li></ol></li></ol> 2. Intracellular Dye Labeling Met behulp van CFSE (figuur 3) <ol><li> Verdun de CFSE een gewenste voorraad concentratie die gemakkelijk kan worden gebruikt. LET OP: Voor deze experimenten een voorraad concentratie van0,01 mM werd gebruikt. Bepaal de optimale werkende concentratie van CFSE empirisch. </li><li> Voeg 10 ul van 0,01 mM CFSE oplossing per ml cellen (paragraaf 1.3.2, concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml in PBS + 0,1% BSA) voor een uiteindelijke concentratie van 0,1 uM. Kort vortex goed te mengen. OPMERKING: CFSE concentraties die hier gebruikt zijn ongeveer tien maal lager dan de algemeen toegepaste proliferatie assays derhalve cel toxiciteit van de kleurstof is minimaal. We hebben geen negatieve effecten op de levensvatbaarheid van de cellen te observeren. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder constant schudden (200 rpm). Beschermen tegen licht. </li><li> Doof de kleurstof met 5 volumestromen buffer toe te voegen aan de buizen. Centrifugeer bij 94 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant laat de pellet achteren. Resuspendeer de cellen met 5 volumes stroom buffer. </li><li> Centrifugeer bij 94 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in flow buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen /<html> ml. </li><li> Voeg een gelijk aantal ongekleurde cellen van belang om de gekleurde celsuspensie. Ga verder met antigen kleuringsprotocol (hoofdstuk 3) de oppervlakte. </li></ol><img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> Figuur 3. Detectie van differentiële CD oppervlakte-antigeen-expressie van twee cellijnen via kleurstof CFSE labeling. SH-SY5Y neuroblastoma cellen vooraf gelabeld met CFSE vervolgens te identificeren in vergelijking met ongelabelde BJ fibroblasten. Co-kleuring van het mengmonster (rechts panelen) met oppervlakte markers CD24 of CD54 (zowel geconjugeerd aan APC) toont aan dat cellijnen zijn gemakkelijk te onderscheiden vanwege de CFSE kleuring (pijlen = SH-SY5Y; pijlpunten = BJ fibroblasten). De meerderheid van SH-SY5Y-cellen brengen CD24, maar niet CD54 (ICAM-1). In tegenstelling, BJ fibroblasten (CFSE-negatief) zijn positief voor CD54 maar grotendeels negatief voor CD24.&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 3. celoppervlak kleuring <ol><li> Etiket buizen met inbegrip van monsters en kritische controles (zie tabel 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Buis niet. </td><td> Monster naam </td><td> Antigeen-fluorofoor </td><td> Verdunning </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ongekleurde cellen </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Single-lood </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Single-lood </td><td> TUJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Dubbel glas in lood </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> TUJ1-Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Single-lood</td><td> Secundaire alleen: Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. L ist buizen worden in een typisch stroomcytometrie experiment. De tabel geeft een minimale set monsterbuizen nodig voor co-kleuring experiment in dit artikel beschreven video. Een ideale experiment moet alle noodzakelijke controles (negatief, evenals de positieve compensatie controles) voor een nauwkeurige interpretatie van de verkregen resultaten omvatten. <ol start="2"><li> Voeg 100 ul celsuspensie (uit paragraaf 2.7 en 1.3.2) aan elke 1,5 ml microcentrifugebuis. OPMERKING: Zorg ervoor dat er een minimum van 0,1 x 10 6 cellen aanwezig per 100 ul celsuspensie zijn. </li><li> Voeg fluorofoor geconjugeerd antilichaam aan het monster bij een geschikte verdunning. OPMERKING: Bepaal werkverdunning voor elk antilichaam voorafgaand aan het experiment. Zie tabel 2 voor een lijst of neurale oppervlakteantigenen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antigeen </td><td> Cell Type </td><td> Verwijzing </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Neurale stamcellen </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Neuronale cellen </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Neurale stamcellen </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Gliacellen </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Neurale stamcellen </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Neuronale cellen </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Neurale stamcellen </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Neurale stamcellen en gliacellen </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Neuronale cellen </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Neurale stamcellen </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Gliacellen </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Dopaminerge voorlopers </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Neurale stamcellen (NSC) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Gliacellen </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Gliacellen </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Selectie van neurale oppervlakte-antigenen. Deze tabel geeft een overzicht van de oppervlakte epitopen gevonden door verschillende neurale celtypes worden uitgedrukt aan de toenemende panel van oppervlakte-antigenen gebruikt om de neurale lineage karakteriseren illustreren. Deze opties verre van volledig en dat de meeste van deze merkers wordt ook uitgedrukt door een reeks andere neurale en niet-neurale cellen. Bijgevolg zullen combinaties van verschillende merkers nodig zijn om beter te definiëren en te isoleren aangegeven neurale subsets. <ol start = &quot;4&quot;&gt; <li> Incubeer gedurende 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) in het donker. </li><li> Flow buffer wassen <ol><li> Voeg 1 ml buffer stroom aan de buizen. Centrifugeer bij 380 g gedurende 4 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant laat de pellet achteren. </li></ol></li><li> Herhaal de wasstap opnieuw. </li><li> Na de tweede wasbeurt, decanteer het supernatant en resuspendeer de cellen in flow buffer tot een eindvolume van 100 pl. </li><li> Gebruik monster voor flowcytometrische analyse. Als alternatief, ga verder met hoofdstuk 4 en 5. OPMERKING: Als de cellen moeten worden gesorteerd en zet terug in de cultuur post-FACS (dwz levensvatbare celsuspensie zonder fixatie of permeabilisatie), toepassing van aseptische technieken tijdens de oogst, vlekken en analytische stappen. </li></ol> 4. Fixatie en Permeabilisatie 38 <ol><li> Fixatie met paraformaldehyde (PFA): <ol><li> Bereid fixatie buffer bevattende 2% PFA in PBS. <br/&gt; OPMERKING: PFA is schadelijk voor mens en milieu. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en gooi afval in overeenstemming met de plaatselijke regelgeving. </li><li> Voeg 500 ul van fixatie buffer 100 pl celsuspensie. </li><li> Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudapparaat (100 rpm) in het donker. </li></ol></li><li> PBS wassen: <ol><li> Voeg 1 ml PBS aan de buis. Centrifugeer bij 380 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Gooi / Schenk de bovenstaande vloeistof laat ongeveer 100 pi in de buis. </li></ol></li><li> Permeabilisatie met Tween-20: <ol><li> Bereid permeabilisatie buffer dat 0,7% Tween-20 in PBS. </li><li> Voeg 500 ul van permeabilisatie buffer 100 pl celsuspensie. </li><li> Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten op een schudapparaat (100 rpm) in het donker. </li></ol></li><li> Was de cellen eenmaal met PBS (zoals beschreven in paragraaf 4.2) en de bovenstaande vloeistof uit de buizen completely, waardoor alleen de pellet achter. </li></ol> 5. De intracellulaire Antigen kleuring 38 (figuur 4) <ol><li> Vervaardiging van primaire antilichaam oplossingen: <ol><li> Verdun het primaire antilichamen in verdunning buffer met 1% runderserumalbumine, 10% serum (bijvoorbeeld normale ezel of geit serum) en 0,5% Tween-20 in PBS. OPMERKING: Kies het serum worden gebruikt afhankelijk van de soort de secundaire antilichamen zijn gerezen in. </li><li> Of gebruik Zenon fluoresceïne kenmerken van het primaire antilichaam volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Bereid 1 ug van primair antilichaam in PBS bij een geschikte verdunning (totaal volume ≤ 20 pi). </li><li> Voeg 5 gl Zenon fluoresceïne IgG labeling reagens (Component A) aan het antilichaam oplossing. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 5 ul van Zenon blokkerende reagens (Component B) aan het reactiemengsel. </li><li> Broedenhet mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het antilichaam aan het monster binnen 30 minuten. </li></ol></li></ol></li><li> Primaire antilichaamkleuring: <ol><li> Voeg 100 ul van de primaire antilichaamoplossing de celpellet en voorzichtig vermaal te mengen. </li><li> Alternatief voeg Zenon fluoresceïne gelabeld antilichaam aan de celsuspensie in de geschikte verdunning. </li><li> Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm), beschermd tegen licht. Was de cellen eenmaal met PBS (zoals beschreven in paragraaf 4.2) en de bovenstaande vloeistof uit de buizen volledig, waardoor alleen de pellet achter. </li></ol></li><li> Secundair antilichaam kleuring (niet vereist voor de Zenon fluoresceïne gemerkte antilichamen): <ol><li> Verdun het secundaire antilichamen in PBS bij een geschikte concentratie. </li><li> Voeg 100 ul van het secundaire antilichaam oplossing voor de celpellet en voorzichtig vermaal te mengen. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een schudapparaat (200 rpm) in het donker. </li></ol></li><li> Was de monsters twee keer met PBS (zoals beschreven in paragraaf 4.2). </li><li> Een keer wassen met stroom buffer (zie paragraaf 3.5). </li><li> Resuspendeer de cellen in ongeveer 150 pl stroming buffer en geanalyseerd op de flowcytometer. </li></ol><img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Figuur 4. Co-kleuring van het oppervlak en intracellulaire eiwitten. Flowcytometrie data illustreert een vergelijking tussen eerste + tweede antilichaam-gebaseerde versus Zenon fluoresceïne gebaseerde intracellulaire kleuring in combinatie met oppervlakte kleuring. Exclusief positiviteit op de y-as (kwadrant linksboven) en de x-as (kwadrant rechtsonder) toont cellen gekleurd voor MAP2 en CD24 resp. Na co-kleuring worden gedeeld MAP2 en CD24 expressie te zien in het kwadrant rechtsboven (rechts panelen). Vergelijking van het gebruikAlexa Fluor 488. (Top; AF488) versus Zenon fluoresceïne (onderaan) voor MAP2-labelingsopbrengsten soortgelijke resultaten <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 6. Flowcytometrische Analyse <ol><li> Voer flowcytometrische analyse onmiddellijk na de voltooiing van de kleuring protocol met een flow cytometer met geschikte filters voor signaaldetectie. Gebruik 488 nm blauwe en 640 nm rode laser met FL-1 (533/30), FL-2 (585/40) en FL-4 (675/25) banddoorlaatfilters. </li><li> Het opzetten van primaire poorten op basis van de voorwaartse en zijwaartse verstrooiing exclusief puin en dode cellen. </li><li> Stel fluorescentie poorten voor oppervlakte en intracellulaire antigeen aan ≤0.5% op basis van de niet-gekleurde monsters en compensatie voor spectrale overlap met behulp van enkele gebrandschilderde controles. </li></ol>

De auteurs verklaren geen mogelijke belangenconflicten.

De hier gepresenteerde protocol is goed vastgesteld voor neurale celculturen afkomstig van menselijke stamcellen, maar ook kan worden toegepast op andere neurale cel bronnen primaire weefsel of neurale cellijnen. Naast embryonale bronnen, kunnen neurale stamcellen of voorlopercellen worden gewonnen uit de neurogene gebieden van volwassen hersenen 27. Bovendien flowcytometrie en FACS kan worden benut om te kwantificeren, te analyseren en te isoleren diverse celpopulaties waaronder volwassen neuronen 54,</...

Flowcytometrie is uitgebreid in de immunologie, hematologie en oncologie benut om celpopulaties te definiëren via intrinsieke scatter eigenschappen, celoppervlakantigeen expressie en andere fluorescentie parameters 1-3. Het inzicht in bloedlijn ontwikkeling en ziekte resultaat in belangrijke mate van de continue verfijning van deze methode na de eerste uitvoering 4,5. Toegenomen bewustzijn van de kwantitatieve en de algemene analytische mogelijkheden van flowcytometrie heeft onlangs haar meer wijdverspreid gebruik in stamcelonderzoek aangemoedigd en kan op dezelfde diepe vooruitgang in een korter tijdsbestek 6 mogelijk te maken. De toepassing van flowcytometrie specifiek analyseren en te isoleren neurale populaties is lang beschouwd als een uitdaging. In tegenstelling tot hematopoëtische cellen die van nature voorkomen in suspensie worden neurale celtypes typisch geoogst uit te ingewikkelde bronnen kunnen glia en diverse oTher omringende cellen en een ingewikkeld netwerk van proces dragende neuronen. Bijgevolg neurobiologie heeft nog tot uitvoering van de veelzijdigheid van flowcytometrie om zijn volledige potentieel in de dagelijkse routines onderzoek. Zolang echter als een levensvatbare enkele celsuspensie kan worden gegenereerd (en protocollen ontwikkeld en geoptimaliseerd daartoe 7), flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan worden beschouwd als een waardevol bestanddeel van de analytische repertoire neurobiologie 8-11. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Figuur 1. Principe van flowcytometrische analyse en componenten van een stromingscytometer flowcytometers bestaan ​​uit drie belangrijke systemen: fluïdica, optica en elektronica. Een gestroomlijnde stroming van cellen in suspensie (bereid uit primair weefsel of in vitro kweek) wordt bewerkstelligd door de huls fluid via hydrodynamische focussen, het beperken van het monster naar het centrum kern. De optische onderdelen zijn samengesteld uit lasers die de stroom van cellen en optische filters die het signaal naar de geschikte detectoren direct verlichten. De lichtsignalen gedetecteerd worden omgezet naar elektronische signalen, vervolgens verwerkt door een computer en gevisualiseerd op een monitor voor data-analyse en gating. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Gebruikers van stromingscytometrische methoden winst van ten minste een basiskennis van de onderliggende fundamentals waaronder bouwstenen van een cytometer&#39;s (zie voor een overzicht 12,13; zie ook figuur 1). Een laserstraal snijdt een hydrodynamisch gerichte vloeibare stroom die de cellen in suspensie, waardoor pass laserstraal &#39;bestand&#39; achter elkaar bevat. De interceptiop een cel (of een ander deeltje, wat dat betreft) met de laser resulteert in de verstrooiing van licht van deze ondervragingspunt. Strooilicht kan worden gedetecteerd in het verlengde van de laser richting (voorwaartse verstrooiing, die bij de omvang van het deeltje), alsmede loodrecht op de richting (zijwaartse verstrooiing, die de granulosity van de deeltjes / cel). Deze voornoemde scatter eigenschappen geen specifieke etikettering, dat is de reden waarom een ongemerkt monster (of ook cellulaire puin, luchtbellen, enz.) Een signaal (event) op de bivariate voorwaartse verstrooiing versus kant scatterplot vaak gebruikt voor de initiële venstertijd zal genereren vereisen. Door de geschikte lasers en filters specifiek voor de overeenkomstige excitatie en emissie spectra kan een cel worden geanalyseerd op positiviteit, intensiteit of afwezigheid van fluorescente merkers. De meeste flowcytometrische toepassingen gericht op de karakterisering via celoppervlakte antigenen. In tegenstelling tot de hematopoietische lineage is de neurale stam bleef minder uitgebreid gedefinieerd volgens oppervlak epitoop expressiepatronen 5. Een voordeel exploiteren oppervlakteantigenen is dat levende cellen kunnen worden gesorteerd paradigma zoals FACS cel. In tegenstelling, intracellulaire antigeen kleuring vereist fixatie en permeabilisatie stappen om de epitoop-antilichaam interactie bemiddelen, zich verzet tegen downstream toepassingen die levensvatbare cellen nodig. Van de nota, dergelijke benaderingen nog steeds de mogelijkheid voor tal van kwantitatieve assays 14 als downstream analyses voor RNA en eiwit expressie 15. Hematologie, immunologie en oncologie zijn vaak meer dan een dozijn markers in samenhang met bepaalde subpopulaties 16 definiëren. Daarnaast kan de massa cytometrie of CyTOF nu worden gebruikt voor het analyseren tot 30 parameters tegelijkertijd 17,18. Voor neurale stamcellen aanvragen evenals primaire culturen 14,19,20 de heterogeniteit van cellen invitro is een veel voorkomend verschijnsel 21-23. De cellen die geen deel uitmaken van de doelgroep van belang belichamen een potentieel verstorende factor voor experimentele uitlezing 24,25. Op geschikte wijze de verschillende cellulaire subsets aanwezig in een heterogene celsuspensie aangebracht onderscheiden (bekend of nog te ontcijferd) antigeen expressie profielen die kunnen worden gebruikt om deze verschillende populaties te definiëren. Flowcytometrie kan dus een cruciale rol spelen bij het ​​oplossen van de cellulaire heterogeniteit en, daardoor, biomedische toepassingen te vergemakkelijken (in vitro testen, celtherapie) en optimaliseren van kwantitatieve uitlezing door te focussen op de meest relevante subset 24,26. Diverse oppervlakte-antigeen combinaties zijn geïdentificeerd in de afgelopen jaren aan de kwantificering en isolatie van specifieke neurale celtypes mogelijk te maken. Dit omvat CD133 voor de verrijking van neurale stamcellen 27, een combinatie van de CD15 / CD24 / CD29 oppervlakte-antigenen voor de isolatie van NSC, differentiated neuron en de neurale lijst cellen 28 of CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 om neurale en gliale subsets 25, onder andere handtekeningen 29,30 isoleren. Beyond neuronen, gliale merkers omvatten A2B5 31, CD44 25, NG2 32 en GLAST 33. Een recente publicatie is gebruik gemaakt van de middenhersenen vloerplaat voorloper marker CORIN 34,35 te verrijken voor dopaminerge voorlopers in Parkinson celtransplantatie paradigma 36. CD moleculen niet alleen markers, maar functioneel relevante mediatoren van cel-cel interacties en het vermogen van een cel om te reageren op signalen van extracellulaire matrix moleculen en groeifactoren 37. Een strategie voor verdere verbetering van de arsenaal van combinatorische CD antigenen neurale stam ontwikkeling karakteriseren bekende intracellulaire merkers gebruikt voor het screenen en bepalen CD antigeen combinaties voor een bepaald celtype. We hebben onlangs uitgebuit een dergelijke aanpak en geïdentificeerd CD49f - / CD200 hoge combinatorische expressie patronen als een nieuwe benadering voor het verrijken van neuronale subsets van neuraal gedifferentieerde geïnduceerde pluripotente stamcellen kweeksystemen 38. Hier nemen we bespreken laatstgenoemde protocol (en optioneel variaties daarvan), waarbij het oppervlak kleuring en intracellulaire kleuring gelijktijdig worden gebruikt voor het definiëren neurale celtypes door flowcytometrie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Figuur 2. Stroomdiagram van experimentele protocolopties. De figuur toont een schematische weergave van de belangrijkste stappen van het protocol. Optionele stappen (CFSE kleurstof of intracellulaire antigeen etikettering) zijn aangegeven met licht grijze vakken. Na oogsten, is het essentieel om de levensvatbaarheid en aantal cellen van neurale celsuspensies voor celoppervlak kleuring beoordelen. Positiefen negatieve controles dienen te worden opgenomen naast de interessante monsters. Monsters kunnen worden geanalyseerd door flowcytometrische analyse en / of worden gebruikt in cel sortering paradigma&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> Hoewel we eerder gebruik primair antilichaam in combinatie met secundaire antilichaam voor intracellulaire kleuring 38, is er nu niet covalente labeling van het primaire antilichaam fluorescente Fab fragmenten (Zenon etikettering) als een lichte variatie, waardoor de stappen celmanipulatieniveau 39 verminderen. Bovendien, als een ander voorbeeld van de veelzijdigheid van het protocol, in dienst nemen we een facultatieve etikettering van een experimentele deelverzameling door carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voorafgaand aan het antigeen kleuring oppervlak. Dergelijke CFSE pre-labeling kan de onmiddellijke directe vergelijking van twee cellijnen of experimentele condities (CFSE-gelabelde vs. ongelabelde) binnen een enkel monster buis, het verminderen van variantie of subtiele verschillen in incubatietijd en opslaan antilichaam. CFSE is een gevestigde fluorescerende kleurstof die vaak wordt gebruikt voor het cell tracking 40, in proliferatie 41,42 en barcoding experimenten 43,44. Tot slot, terwijl de werkelijke sorteer- stappen (FACS, immunomagnetische celscheiding of immunopanning) maken geen deel uit van dit protocol, in principe, de oogst en de etikettering procedures hier beschreven doen opbrengst monsters die kunnen worden onderworpen aan antigeen of intracellulaire-etikettering gebaseerd sorteren toepassingen oppervlak 15 25,28. Met dit artikel willen we: samenvatten een levensvatbare oppervlakte-antigeen kleuringsprotocol 25,28, vatten een protocol voor de detectie van intracellulaire targets alsmede gecombineerd oppervlak en intracellulaire antigeen analyse 38, presenteren een intracellulaire CFSE kleurstof etikettering stap 41,45 als een experimentele optie voor comvergelijkende analyses van neurale celpopulaties, en samenvatten benaderingen cytometrieanalyse (passende controles 13,46, gating strategie en presentatie van gegevens 47) stromen.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS zonder Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum, gekwalificeerd, EU-goedgekeurd, Zuid-Amerikaanse oorsprong (FBS)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren (100x)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing, 0,4%</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine (BSA) Fractie V</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 detergent</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluoresceïne-succinimidyl ester (CFSE)</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filters express plus 0,22 &amp;micro;m, 250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Voor celcultuur behandelde flessen (T 25)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Voor celcultuur behandelde flessen (T 75)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Conische buizen (15 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Conische buizen (50 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipet, glas (150 mm)</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten (0,1-10 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten (1-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten, 25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen (0,5 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen (1,5 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen (2,0 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humaan CD24 APC monoklonaal antilichaam</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>Werkverdunning 1:50</td></tr><tr><td>Anti-humaan CD54 PE monoklonaal antilichaam</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>Werkverdunning 1:50</td></tr><tr><td>Neuronaal klasse III &amp;beta;-tubuline (Tuj1) polyklonaal antilichaam</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>Werkverdunning 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>Werkverdunning 1:2.000</td></tr><tr><td>Zenon&amp;reg; Fluoresceïne konijn IgG labelingskit</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>Verbeterde Neubauer-telkamer</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 flowcytometer</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde microcentrifuge, PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>Orbital schudmachine, Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge, Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II biologische veiligheidskabinet Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator, Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Vacuümsysteem, Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop, Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>Pipetcontroller, accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

flowcytometrie protocollen voor surface en intracellulaire antigen analyses van neural cell types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flowcytometrie is uitgebreid gebruikt om celpopulaties te definiëren in immunologie, hematologie en oncologie. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van protocollen voor flowcytometrische analyse van het cluster of differentiation (CD) oppervlakte-antigenen en intracellulaire antigenen in neurale celtypen. Onze stapsgewijze beschrijving van de methodologische procedures omvat: het oogsten van neurale in vitro culturen, een optionele carboxyfluoresceine succinimidyl ester (CFSE)-labelingstap, gevolgd door oppervlakte-antigeenkleuring met geconjugeerde CD-antilichamen (bijv., CD24, CD54), en vervolgens intracellulaire antigen detectie via primaire/secundaire antilichamen of fluorescent gelabelde Fab-fragmenten (Zenon-labeling). De video toont de meest kritische stappen. Bovendien worden principes van experimentele planning, de opname van cruciale controles en de fundamenten van flowcytometrische analyse (identificatie van doelpopulatie en uitsluiting van puin; gating-strategie; compensatie voor spectraal overlap) kort uitgelegd om neurobiologen met beperkte voorkennis of specifieke training in flowcytometrie in staat te stellen de nuttigheid ervan te beoordelen en deze krachtige methodologie beter te benutten.

De hier gepresenteerde protocol maakt veelzijdig experimentele benaderingen (figuur 2). In de kortste versie (stappen 1, 3 en 6), kan worden beschouwd als een gids voor eenvoudige kleuring van oppervlakte-antigenen. In een meer complexe vorm kan een aantal co-labeling paradigma met een reeks intracellulaire antigenen worden nagestreefd (optionele stappen 2 en / of 4 tot 5). Bovendien is de CFSE-etikettering stap een voo...

We bieden een gedetailleerde beschrijving van een protocol voor flowcytometrische analyse van oppervlakte-antigenen en/of intracellulaire antigenen in neurale celtypen. Kritische aspecten van experimentele planning, stap-voor-stap methodologische procedures en fundamentele principes van flowcytometrie worden uitgelegd om neurobiologen in staat te stellen deze krachtige technologie te benutten.

Flowcytometrie Protocollen voor Surface en intracellulaire Antigen Analyses van Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van oppervlakte- en intracellulaire antigenen op neurale cellen te analyseren met behulp van flowcytometrie. Dit wordt bereikt door eerst neurale cellen te oogsten uit in vitro-culturen of primair zenuwweefsel. Vervolgens wordt een optionele niet-specifieke intracellulaire kleuring toegepast op de cellen.Vervolgens worden de gewenste oppervlakte-antigenen onmiddellijk gelabeld met een primaire antilichaam, terwijl de gewenste intracellulaire antigenen worden gelabeld na cellulaire fixatie en permeabilisatie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen door flowcytometrische analyse te gebruiken voor co-expressie van de oppervlakte-antigenen op specifieke neurale subpopulaties van belang, zoals gedefinieerd door intracellulaire markering. Dit protocol zal aantonen hoe u weefselkweek-afgeleide neurale cellen kunt voorbereiden voor onderzoek naar oppervlakte- en intracellulaire antigenen met meerkleurige flowcytometrie.Om te beginnen, verzamelt u aderente neurale cellen die in T 75-kolven zijn gekweekt, door de cellen eerst voorzichtig één keer te wassen met vijf milliliter magnesium- en calciumvrij PBS op kamertemperatuur. Ontkoppel vervolgens de cellen van de kolf door drie milliliter trypsine-vervanger toe te voegen en in te kuilen bij 37 graden Celsius gedurende twee tot vijf minuten. Quench de enzymatische vertering door zes milliliter flowbuffer toe te voegen nadat de celklonten zijn losgemaakt door de celsuspensie een paar keer op en neer te pipetten, breng de hele celsuspensie over in een nieuwe 15 milliliter buis om de cellen te isoleren.Plaats de buis in een centrifuge, centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en aspireer de snat ter voorbereiding op intracellulaire kleurstoflabeling. Hervat de celpellet met vijf milliliter PBS plus 0,1%BSA. Anders, voeg vijf milliliter flowbuffer toe in combinatie met het standaard trian blauw kleuringsprotocol.Gebruik een hemo cytometer om het effectieve aantal levensvatbare cellen te schatten. Pas de celconcentratie van de bestaande suspensie aan tot 1 miljoen levensvatbare cellen per milliliter met dezelfde buffer die in de vorige stap is gebruikt. Deze cellen zijn nu klaar voor twee kleuringsopties, een oppervlakte-antigeen antilichaamkleuring, of een optionele fluorescerende intracellulaire kleuring met carboxyfluoresceïne gevolgd door de eerder genoemde oppervlakte-antigeenkleuring.Om een intracellulaire kleuringsstap met carboxyfluoresceïne CIN ester kleurstof uit te voeren, voegt u eerst 10 microliter CFSE stockoplossing toe. Voor elke milliliter celsuspensie, plaats de buis op een shaker bij 200 RPM en incubeer het mengsel gedurende vijf minuten. Bij kamertemperatuur, voorkom fotobleking door de buis te beschermen tegen directe lichtblootstelling.Quench alle niet-reactieve kleurstoffen door vijf volumes serumbevattend flowbuffer toe te voegen en pipetteer voorzichtig enkele keren op en neer om te mengen. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten in een centrifuge bij kamertemperatuur en aspireer het supernatant om resterende sporen van niet-reactieve kleurstoffen te verwijderen. Was de celpellet door deze opnieuw op te schorsen met vijf volumes flowbuffer.De cellen worden vervolgens nog een keer gecentrifugeerd in een centrifuge bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten voordat het SUP natant wordt weggegooid. Hervat tenslotte de celpellet met flowbuffer zodat de uiteindelijke celconcentratie 1 miljoen levensvatbare cellen per milliliter is. Voor een multiplex experiment, voeg een gelijk aantal ongeverfde cellen van belang toe van een andere experimentele conditie aan de CFSC-gekleurde celsuspensie.De cellen zijn nu klaar voor oppervlakte-antigeenkleuring met antilichamen om celoppervlaktekleuring te beginnen. Breng 100 microliter van de celsuspensie met of zonder CFSC-labels over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Voeg fluor vier geconjugeerde antilichamen toe aan de celsuspensie in een hoeveelheid die eerder is bepaald door antilichaam titratietests.Plaats de buis op een orbitale shaker bij kamertemperatuur op 100 RPM en incubeer de mengsel gedurende 30 minuten. Bij afwezigheid van licht, verdun het antilichaammengte door een milliliter flowbuffer toe te voegen. Pipetteer voorzichtig enkele keren op en neer om te mengen en centrifugeer de cellen gedurende vier minuten in een voorgekoelde microcentrifuge bij vier graden Celsius.Aspireer het supinate om de ongebonden antilichamen te verwijderen en herhaal deze wascentrifuge en aspiratie. Stap één keer meer. Hervat de celpellet in 100 microliter flowbuffer voor de eerder gekleurde cellen.Voeg 500 microliter van de fixatiebuffer toe aan 100 microliter van de celsuspensie. Plaats de buis op een orbitale shaker bij kamertemperatuur op 100 RPM en incubeer gedurende 15 minuten in het donker. De formaldehyde zal alle eiwit- en DNA-soorten die in nauwe nabijheid met elkaar zijn, cross-linken en niet-levensvatbare celsuspensies opleveren.Verdun het fixatiemengsel door een milliliter PBS toe te voegen en pipetteer voorzichtig enkele keren op en neer om te mengen. Centrifugeer vervolgens de gefixeerde cellen gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge bij vier graden Celsius. Aspireer het supinate zodanig dat 100 microliter vloeistof boven de celpellet blijft om de celmembraan te permeabiliseren voor latere intracellulaire antigeenkleuring.Voeg 500 microliter permeabilisatiebuffer toe aan 100 microliter celsuspensie. Plaats de buis op een orbitale shaker bij kamertemperatuur op 100 RPM en incubeer gedurende 15 minuten in het donker. Verdun het permeabilisatiemengsel door een milliliter PBS toe te voegen, pipetteer voorzichtig enkele keren op en neer om te mengen en centrifugeer de gefixeerde cellen gedurende drie minuten in een voorgekoelde centrifuge bij vier graden Celsius.Aspireer de SUP natant volledig voorafgaand aan incubatie. Bereid een werkend voorraaddie van primaire antilichamen voor door het antilichaam te verdunnen in een PBS plus 0,5% tween 20 buffer. Die verder verrijkt is met ofwel 1%BSA, 10%donkey serum of 10%geitenserum.Hervat vervolgens de membraan

flow-cytometry-protocols-for-surface-intracellular-antigen-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video protocol geeft blijk van een nieuwe methode voor het genereren en daaropvolgende zuivering van neuronale stamcellen uit een hernieuwbare bron van neurale stamcellen (NSC) op basis van hun fysieke (grootte en interne granulariteit) en fluorescerende eigenschappen met behulp van flowcytometrie-technologie.

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Source: Becker-Kojić, Z. A., et. al., GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates a protocol for preparing neural cells derived from reprogrammed peripheral blood cells for fluorescence microscopy, showcasing distinct cell types and developmental stages through immunofluorescence imaging.

Immunofluorescence Microscopy of Neural Cells Differentiated from Peripheral Blood-Derived Cells 

Source: Hidmark, A. S., et al. Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates the use of flow cytometry to analyze immune cells in mouse sciatic nerves and dorsal root ganglia (DRGs). The process involves labeling immune cells with fluorophore- and biotin-tagged antibodies, stabilizing and permeabilizing the cells, and using fluorescent markers to detect cell-surface and nuclear...

Analysis of Immune Cells in Mouse Nervous Tissues Using Flow Cytometry

In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.

High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum

Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.

Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

We hebben een methode ontwikkeld die menselijke astrocytenpopulaties verrijkt en isoleert van vers ingevroren weefsel voor gebruik in downstream moleculaire analyses.

Isolatie van volwassen menselijke astrocytenpopulaties uit versgevroren cortex met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernensortering

Dit protocol beschrijft strategieën voor het identificeren en verrijken van de celtoestand in neurale stamcelculturen van primaire volwassen muizen door middel van autofluorescentiebeeldvorming met behulp van i) een confocale microscoop, ii) een fluorescerend geactiveerde celsorteerder om intensiteitsbeeldvorming uit te voeren, of iii) een multifotonenmicroscoop om fluorescentiebeeldvorming uit te voeren.

Classificatie van neurale stamcelactiveringstoestand in vitro met behulp van autofluorescentie

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Hier presenteren we twee protocollen om microgliale inslokking van vGLUT1-positieve synapsen en pHRodo Red-gelabelde ruwe synaptosomen te kwantificeren met behulp van flowcytometrie.

Kwantificering van microgliale inslokking van synaptisch materiaal met behulp van flowcytometrie

Leer flowcytometrie voor oppervlakte- en intracellulaire antigeenanalyse van neurale celtypen. Dit protocol toont hoe je neurale cellen uit weefselkweek of primair weefsel prepareert voor multikleurenflowcytometrie.

Flowcytometrie Protocollen voor Surface en intracellulaire Antigen Analyses van Neural Cell Types

Meer video's verkennen