Hoge doorvoer analyse van volwassen stamcellen ontwikkeld voor toediening van therapeutische factoren voor Neuroprotective Strategies

Het algemene doel van deze procedure is om genetisch gemodificeerde stamcellen snel te karakteriseren met behulp van een high content screening of HCS-systeem. Dit wordt bereikt door eerst experimenten te ontwerpen en voor te bereiden voor een 96-wellsplaat, en vervolgens de verschillende populaties van gemodificeerde stamcellen aan te brengen. Vervolgens wordt het high content screening-systeem voorbereid voor live celbeeldvorming en wordt de time-lapse beeldvorming gestart voor de gewenste periode.

Na het voltooien van de time-lapse beeldvorming wordt de kweekplaat voorbereid voor celkleuringprocedures zoals propidiumjodide, kleuring voor celdood, of KI 67 immunolabeling om celproliferatie te karakteriseren. Ten slotte wordt de 96-wellsplaat opnieuw geladen in het high content screening-systeem voor fluorescentiebeeldvorming en beeldacquisitie. Uiteindelijk wordt de beeldanalysesoftware gebruikt om gegevensanalyse uit te voeren voor de bepaling van verschillende celgroeiparameters.

Deze methodologie kan helpen bij het aanpakken van sleutelproblemen op het gebied van stamcelbiologie, zoals de identificatie en karakterisering van factoren die stamceldifferentiatie stimuleren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot cel-gebaseerde therapeutische strategieën vanwege het belang van het karakteriseren van celtypen voordat ze in vivo worden gebruikt. Deze methode kan inzicht geven in celgedrag en kan worden toegepast op vrijwel elk ander celtype dat goed groeit in cultuur.

Bovendien kunnen deze benaderingen potentieel worden gebruikt op hele organismen zoals zebravislarven. Om te beginnen, maak een kaart zoals hier getoond van de 96-wellsplaat met de verschillende substraten en celtypen die onder een steriele kweekkap moeten worden onderzocht. Bereid een werkstation voor met verschillende substraten en een 96-wellsplaat.

Voeg 100 microliter substraatoplossing toe aan elke well volgens de kaart. Gebruik vervolgens een strook perfil om de deksel te verzegelen en bewaar deze 's nachts bij vier graden Celsius na het isoleren van muis mesenchymale stamcellen en het infecteren met lentivirale vectoren volgens het tekstprotocol, verwijder de substraatoplossingen uit de 96-wellsplaat en gebruik ongeveer 200 microliter steriele PBS om de wells twee keer te wassen. Zodra de laatste spoeling is verwijderd bij 200 microliter celkweekmedium en breng de plaat in evenwicht in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Ondertussen, onder steriele omstandigheden, oogst de MSC's door eerst het kweekmedium te verzamelen, nu aangeduid als het geconditioneerde medium uit de flacon in een 15 milliliter conische buis. Voeg vervolgens acht milliliter steriele PBS toe aan de flacon en slinger voorzichtig voordat u de buffer afzuigt. Om de cellen los te maken van de flacon, voegt u een milliliter 0,05%trypsine en 0,01%EDTA-oplossing toe. Wanneer de cellen los zijn, voegt u acht milliliter van het geconditioneerde medium toe voordat u de celsuspensie verzamelt en de cellen opnieuw plateert bij ongeveer 300 cellen per well.

Volgens het tekstprotocol, incubeer de plaat gedurende twee uur om de MSC's aan het substraat te laten hechten terwijl de cellen incuberen. Start het HCS-systeem en wacht twee uur tot het in evenwicht is. Stel de omgevingscontroller in op 37 graden Celsius en zet voorzichtig de gemengde gascilinder met 5% koolstofdioxide in lucht aan voor het HCS-systeem, de omgevingskamer die een constante luchthast levert.

Vervolgens, na de twee uur durende incubatieperiode, verwijdert u de 96-wellsplaat uit de incubator en plaatst u deze direct in de omgevingskamer van het HCS-systeem. Laat de plaat 30 minuten in evenwicht brengen en start u de software om de plaatinstellingen te configureren. Zodra de beeldacquisitieparameters zijn ingesteld, gebruik volgens het tekstprotocol laser autofocus om zich te concentreren op de bodem van de well en maak testbeelden van meerdere locaties en meerdere wells om een geoptimaliseerd brandvlak te vinden.

Zodra de focus is vastgesteld, begint u met het vastleggen van beelden om de vijf minuten gedurende 48 uur voor alle 60 wells. Aan het einde van het experiment verwijdert u de 96-wellsplaat uit het HCS-systeem onder steriele omstandigheden, verzamelt u geconditioneerde mediummonsters uit elke well en brengt u deze over naar een nieuwe 96-wellsplaat. Deze monsters kunnen later worden gebruikt voor een ELIZA om een KI 67 celproliferatie-assay uit te voeren.

Gebruik 0,1 molaar fosfaatbuffer om de celculturen gedurende één minuut te spoelen. Na herhaling van de wassing, gebruik 4%para formaldehyde of PFA bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de culturen na fixatie te fixeren. Verwijder de PFA en gebruik PBS om de wells drie keer gedurende zeven minuten te spoelen.

Na het blokkeren van de cellen volgens het tekstprotocol, breng 100 microliter primaire antilichaamoplossing toe op elk. Dek de plaat af en incubeer gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Na het wassen van de cellen drie keer gedurende zeven minuten.

Voor elke wassing, breng secundair antilichaam aan. Plaats de cellen in het donker en incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur na nog eens drie wasbeurten. Dek de plaat af en bewaar deze bij vier graden Celsius tot beeldvorming.

Om geautomatiseerde beeldvorming uit te voeren, laadt u de immunogelabelde plaat in het HCS-systeem en laat de plaat gedurende 20 minuten in evenwicht brengen. Open de beeldacquisitie- en analysesoftware van het HCS-systeem. Kies de acquisitie-instellingen voor het 10 x objectief met camerabuiging op één en een versterkingsinstellng van twee.

Gebruik de automatische belichtingsfunctie om het Z-vlak te vinden waarin de cellen zich bevinden en bereken de offset voor elke golflengte van belang voor de hier gedemonstreerde analyse. Maak beelden voor DAP EGFP en S3. Kies het maximale intensiteitsniveau waarop de negatieve controlewells geen signaal vertonen voor beeldacquisitie. Gebruik dezelfde drempelinstellingen voor positieve wells.

Vang tenslotte beelden en s