Minimaal-invasieve techniek voor injectie in Rat Optic Nerve

Het algemene doel van deze procedure is om een minimaal invasieve aanpak te bieden voor het injecteren van geneesmiddelen of stamcellen in de oogzenuw van een levende rat. Dit wordt bereikt door de rat eerst te verdoven, hem op de dissectiestand te plaatsen en een hechtdraad in de conjunctiva in te brengen voor manipulatie van het oog. Later, in de tweede stap, wordt de orbitale richel achter het oog gedisseceerd om de oogzenuw bloot te leggen.

Vervolgens wordt de glazen pipet in de oogzenuw ingebracht en wordt het geneesmiddel of de stamcellen geïnjecteerd voordat de chirurgische plaats wordt afgesloten en de rat uit de verdoving wordt gehaald. Uiteindelijk, na een bepaalde periode, wordt de rat gedood, wordt de oogzenuw gedisseceerd en kunnen de effecten van de chirurgische injectie of transplantatie worden gevisualiseerd door middel van microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat deze aanpak minimaal invasief is en dat de rat zo lang als nodig overleeft.

Bestudeer de effecten van chirurgische injectie of transplantatie. De procedure wordt gedemonstreerd door Kate Schwartz, een student-technicus uit mijn laboratorium. Voer alle chirurgische procedures uit onder verdoving met twee tot 3% isoflurine.

Bevestig het juiste niveau van verdoving door de teenkneveltest en de ademhalingssnelheid. Controleer of de rat niet schrikt als er aan een teen wordt geknepen. Bevestig het dier zo nodig om hoofdbeweging tijdens de procedure te voorkomen.

Plaats vervolgens een druppel lidocaïne op het chirurgische oog. Gebruik elke 10 minuten kunstmatige tranen om uitdroging onder verdoving te voorkomen. Geef een preoperatieve injectie van buprenorfine op 0,01 milligram per kilogram subcutaan en daarna elke zes tot acht uur indien nodig.

Houd het dier warm met een verwarmingskussen. Maak het hoofdhaar nat met alcohol. Zorg ervoor dat de ogen niet worden blootgesteld.

Zorg ervoor dat steriele gereedschappen en een steriele techniek worden gebruikt om het risico op postoperatieve infecties te minimaliseren. Plaats vervolgens een vier-oh-hechtdraad in de laterale conjunctiva en knoop deze vast met voldoende hechtdraad om lichte tractie mogelijk te maken. Maak een ongeveer 2,5 centimeter grote incisie in de huid boven de orbitale richel.

Gebruik een scalpel van maat 10. Trek de huid en de onderliggende fascia terug en dissecteer voorzichtig de fascia weg. Plaats een hechtdraad in de getrokken huid om de superieure orbitale zak zichtbaar te maken en overmatig bloeden in de chirurgische plaats te voorkomen.

Vermijd het doorsnijden van bloedvaten tijdens het dissecteren van de fascia. Met lichte tractie op de conjunctiva, waarbij het oog naar beneden en uit de oogkas wordt getrokken, komt de superieure orbitale spier in zicht. Om de oogzenuw bloot te leggen, moet het retroorbitale vet worden verwijderd en deze spier worden doorgesneden.

Het vet kan worden weggegooid en hoeft na de injectie niet te worden teruggeplaatst. Vanaf dit punt moet de oogzenuwfascia zichtbaar zijn als een bundel van de oogzenuw zelf, samen met bloedvaten gewikkeld in dura. Om de diepere dissectie te maken, maakt u een kleine incisie in de DRA met behulp van het scalpel of een 31-gauge schuine naald om het prikken minder traumatisch te maken. Bereid een getrokken glazen micropipet voor met een diameter van 50 tot 100 microns om stabiliteit te bieden.

Monteer de micropipet op een micromanipulator en bevestig deze aan een 20 cc plastic spuit. Trek parels of stamcellen opgelost in 0,5 tot een microliter retrograde in de micropipet, samen met 0,5 microliter methylblauwe oplossing voor en na het laden van de glazen pipet met kleurstof. Gebruik een 1 cc-spuit en een 30-gauge naald om de punt van de micropipet op de oogzenuw net boven de doorgesneden dura te laten zakken.

Een kleine maar snelle beweging van de glazen punt in de oogzenuw resulteert in de minste schade bij het aanbrengen van langzame en constante druk op de zuiger. De Evans blauwe kleurstof zou het gebied van de geïnjecteerde oogzenuw moeten markeren. De kleurstof moet gelokaliseerd blijven binnen de oogzenuw zonder lekkage in de subarachnoïdale ruimte.

Volg de tweede band van Evan's Blue Dye om te bepalen wanneer de stamcelijnspuiting voltooid is. Wanneer het benodigde volume in de oogzenuw is geïnjecteerd, laat u de zuiger los. Houd de micropipet vijf minuten in de oogzenuw om hogedrukuitstoting bij het verwijderen van de micropipet te voorkomen wanneer de injectie voltooid is.

Verwijder de micropipet samen met eventuele katoenen punten die zijn gebruikt om hemostase te bieden. Naai de huid met 3,0 zijden en verwijder de conjunctivale hechtdraad. Houd de ratten warm op een verwarmingskussen totdat ze uit de verdoving ontwaken.

Laat een dier niet onbeheerd achter totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om in sternal liggende positie te blijven. Als het dier tekenen van pijn vertoont, waaronder overmatige lethargie, ataxie of benauwd ademhalen, dient u geschikte pijnstilling toe te dienen met intramusculaire buprenorfine tot drie keer per dag. Na het experiment werden de ratten gedood en geperfundeerd met paraldehyde.

De oogzenuwen werden zorgvuldig gedisseceerd en voorbereid voor cryostat-sectie, hier is een voorbeeld van een rattenoogzenuw bij lagere vergroting waarin Evan's blauwe kleurstof is geïnjecteerd. Om de plaats te visualiseren, identificeert de pijl de precieze locatie van de injectie. Deze dissectie werd binnen een paar dagen na de injectie uitgevoerd, zoals blijkt uit de beperkte diffusie van de kleurstof langs de zenuw na de ontwikkeling.

Deze techniek heeft de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van regeneratieve neurologie om nieuwe manieren te verkennen om de oogzenuw te regenereren en mogelijk verloren zicht te herstellen in dit rattenmodel van demyeliniserende ziekte.