Name: Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer menselijke allogeen-specifieke T-cellen genereren uit perifeer bloed met dichtheidsgradiëntcentrifugatie, magnetische separatie en flowcytometrie. Deze methode ondersteunt immunologisch onderzoek naar transplantatiebiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur wil de NIH Tetramer Core Facility bedanken voor de tetrameerproductie. De auteur wil ook E.D. O’Connor en K.E. Marquez in het UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flowcytometrie laboratorium bedanken voor hun hulp bij het sorteren van cellen. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

OPMERKING: Dit protocol vereist het gebruik van perifere bloedmonsters van menselijke vrijwilligers. Al het onderzoek met menselijke proefpersonen moet worden beoordeeld en goedgekeurd door een Human Studies Institutional Review Board goedgekeurd om de naleving van de Verklaring van Helsinki (2013) en het Health Insurance Portability en Accountability Act van 1996 te verzekeren. 1. Isolatie van T-cellen uit volbloed <ol><li> Voorafgaand aan het starten, warm de dichtheidsgradiënt medium tot kamertemperatuur. Aliquot 4 ml dichtheidsgradiënt medium in 2-4 steriele 15 ml conische centrifugebuizen (1 buis gebruikt voor elke 10 ml totaal volume verdund bloed). </li><li> Verkrijgen van 10-20 ml bloed in 1-2 natriumheparine gespraycoat (groen-top) veneuze bloedafname buizen. Verzamel menselijke specimens onder toezicht van opgeleide individuen en volgens een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. </li><li> Veeg de buitenkant van de buizen met 70% ethanol. Verwijder voorzichtig de toppen van de figevuld verzamelbuizen en decanteer het bloed in een steriele 50 ml centrifugebuis. </li><li> Voeg 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan elke bloedafname. Verzamel de PBS, toe te voegen aan de afgegoten volbloed, en meng voorzichtig. </li><li> Voeg 25 ul Human T Cell Verrijking Cocktail / 2 ml totaal volume. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. </li><li> Pipetteer 10 ml, laag tot 10 ml van de 1: 1 verdund bloed voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiënt medium. Let op het oppervlak van de dichtheidsgradiënt medium niet verstoren. </li><li> Centrifuge gelaagde bloed en dichtheidsgradiënt medium bij 1200 xg gedurende 20 min bij 20 ° C </li><li> Haal de buizen uit de centrifuge, zorg om de interface tussen de dichtheidsgradiënt medium en de laag van leukocyten aan het grensvlak tussen de dichtheidsgradiënt medium en verdund plasma niet verstoren. Met behulp van een pipet 5 ml, zorgvuldig verzamelen van de leukocyten laag en over te dragen aan een nieuwe steriele 50 ml conische tube. </li><li> Voeg PBS om het volume van de verzamelde PBL om 50 ml te brengen en meng voorzichtig. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Decanteren. </li><li> Resuspendeer celpellets in 10 ml steriele flowcytometrie sorteren buffer (steriel gefiltreerd PBS bevattende 1% BSA). Steekproef 10 pi celsuspensie, verdunnen 1:10 (toe te voegen aan 90 pi) trypanblauw om cellen met behulp van een hemocytometer tellen (verwachte opbrengst 1-4 x 10 6 cellen / buis van volbloed). <ol><li> Verwijder 1 ml aliquot, over te brengen naar 5 ml tube, en blijf op ijs voor de analyse van T-cellen niet gelabeld door tetrameer. Houd celsuspensie op ijs. </li></ol></li></ol> 2. Magnetische Verrijking van allogeen-specifieke T-cellen <ol><li> Verdun allogeen pMHC tetrameer tot 1: 100 in steriele soort buffer. </li><li> Centrifugeer celsuspensie (9 ml van stap 1.11) bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Decanteren. </li><li> Voeg 50 pl verdund allogeen pMHC tetrameer te gepelleteerdecellen (tot 10 7 cellen). Meng door zachtjes te pipetteren. Transfer naar een steriele 5 ml tube. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2 ml soort buffer. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Decanteren. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul soort buffer. Voeg 10 ul biotine Selectie Cocktail en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 5 ul Magnetische nanodeeltjes en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2,5 ml soort buffer en meng voorzichtig door pipetteren. Verwijder 100 ul aliquot, over te brengen naar 5 ml tube, en blijf op ijs voor de analyse van pre-verrijking cellen. </li><li> Plaats de buis met 5 ml van de celsuspensie in de celscheiding magneet. De dop moet losjes zijn boven op de buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig de dop van de buis. Houd de tube en magneet bij elkaar, giet de inhoud buis in een verse 5 ml tube. Tik niet op of schud de inhoud buisverwijder de laatste druppels van de vloeistof. </li><li> Haal de buis uit het magneet. Voeg 2 ml koud soort buffer en meng voorzichtig door pipetteren. Monster 10 ui celsuspensie, verdund 1: 2 (aan 10 ul) trypan blauw om cellen te tellen met een hemocytometer. </li></ol> 3. Voorbereiding van de T-cellen voor Single-cell flowcytometrie Cell Sorting <ol><li> Voeg koud soort buffer om alle buizen van cellen (tetramer ongelabelde, tetrameervrij gelabeld un-verrijkt, en tetrameervrij gelabeld verrijkte) om het volume tot 3 ml te brengen. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en decant buffer cellen herstellen. </li><li> Resuspendeer afgedraaid cellen in 25 ul koude soort buffer. Voeg 5 ul humaan Fc blok. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. </li><li> Bereid antilichamen voor flowcytometrie sorteren. Meng 15 pl soort buffer, 15 pl anti-CD5, 15 pl anti-CD14, en 15 pl anti-CD19. </li><li> Voeg 20 ul van antilichaam mengsel aan elke buis cellen. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 2 ml koude soort buffer aan elke buis. </li><li> Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en decant buffer cellen herstellen. </li><li> Resuspendeer cellen bij een concentratie van 1 -2 x 10 6 cellen / ml in een soort buffer. </li><li> Aliquot 100 pl menselijke T celkweek medium (Iscove&#39;s DMEM aangevuld met 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 ug / ml gentamycine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 10% door warmte geïnactiveerd humaan AB serum, en 2,5 ng / ml recombinant humaan IL-2) aan elk putje van een 96 putjes met ronde bodem celcultuurplaat. Houden op het ijs. </li></ol> 4. Isolatie van Tetrameer gelabelde T-cellen door Single-cell flowcytometrie Sorting <ol><li> Vaststellen flowcytometrie gating parameters allogeen-pMHC tetrameer gelabelde T-cellen (Figuur 2.A) identificeren. Gebruik de pre-verrijking tetramer gelabeld fractie vast te stellen gating strategieën om wambuizen, poort op lymfocyten elimineren, uitsluiten CD19 uitdrukken van B-cellen en CD14expressie monocyten en T-cellen herkennen door CD5 expressie. Gebruik het monster niet gelabeld met tetrameer als fluorescentie min één controle om de gating voor de identificatie van tetrameervrij binding T-cellen te vestigen (met 0% van CD5 + CD14 - CD19 - cellen uit het monster niet gelabeld door tetramer binnen deze poort zou moeten vallen) . OPMERKING: Gating strategieën die niet voldoende streng resulteert in isolatie van niet-T-cellen of T-cellen die niet specifiek zijn antigeen, terwijl te beperkte gating strategieën het aantal T-cellen geïsoleerd reduceert. </li><li> Programmeer de plaat parameters voor de enkele cel soort. Richt de sorter aan 1 CD5 + CD14 plaatsen - CD19 - tetramer + cel in elk putje. Richt de set-up te bevatten 1 negatieve controle goed (geen cellen gesorteerd in de put) en 1 positieve controle goed (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - cellen) plaat in elke rij (Figuur 2 B </strong&gt;). </li><li> Het reeds flowcytometrie gating strategie en plaat configuratie, isoleren individuele tetrameer binding T-cellen direct in de 96-well plaat met een flowcytometrische cell sorter. </li></ol> 5. Cultuur en uitbreiding van allogeen-specifieke T-cel klonen <ol><li> Na voltooiing van celsortering, centrifuge plaat bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Plaats cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator. </li><li> Vortex stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microbolletjes gedurende 30 seconden om de korrels te hersuspenderen. </li><li> Bereken hoeveelheid activator parels vereist voor het stimuleren van T-cellen verzameld (0,5 pl activator microkorrels / putje). Overdracht berekende hoeveelheid stimulator kralen een steriele 5 ml buis. Voeg 1 ml humaan T-cel kweekmedium en vortex. </li><li> Plaats buis met microbead suspensie in magneet. De dop moet losjes zijn boven op de buis. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtighet dopje van de tube. Houd de tube en magneet samen, decanteren buisinhoud in een frisse 5 ml tube. Tik niet op of schud de inhoud buis. </li><li> Haal de buis uit het magneet. Voeg humane T-cel kweekmedium (100 ul medium / 0,5 pi van microbolletjes in eerste instantie toegevoegd). </li><li> Aliquot 100 pl activator kralensuspensie aan elk putje van de 96-well plaat. Incubeer cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator. </li><li> Monitor celgroei dagelijks door microscopisch onderzoek. Kleine clusters van prolifererende cellen kunnen microscopisch worden waargenomen na 5-7 dagen van de cultuur (Figuur 3.A). OPMERKING: Visualisatie van T-cel kweken op dit punt kan moeilijk zijn, en de afwezigheid van waarneembare celgroepen in dit stadium niet wijzen op een gebrek aan groeiende T cellen. </li><li> 14 dagen na celisolatie, voer kweken door zorgvuldig verwijderen van 100 pl media van de bovenkant van de cultuur en vervangen door 100 μ; L verse humane T-cel kweekmedium. Doorgaan incuberen cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator. </li><li> Monitor celgroei dagelijks door microscopisch onderzoek en evaluatie van de kleur van het kweekmedium. Grote cel clusters zichtbaar microscopisch 2-3 dagen na de mediumverversing. Macroscopisch, moet cel pellets zichtbaar tijdens de 14 dagen volgend op de medium verandering geworden. </li><li> Op 28 dagen na celisolatie, identificeren groeiende klonen door microscopisch onderzoek. Breng 200 pi volume van de groei-positieve 96-well plaat kweken individuele putjes van een 48-well weefselkweek plaat met 200 gl humane T cel kweekmedium. </li><li> Voeg 100 ul bevattende 12,5 ul stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microparels (bereid zoals beschreven in paragrafen 5,2-5,6). Incubeer cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator. </li><li> Monitor cultuur groei dagelijks door microscopische examinering en evaluatie van de kleur van het kweekmedium. Bij T-cel cultuur bereikt&gt; 2x10 6 / ml (meestal 3-5 dagen na de re-stimulatie, kan worden geschat door de dag dat de media begint te draaien stro-geel), de overdracht van cultuur om een putje van een 24-well weefselkweek plaat en voeg 500 ul humane T-celmedium. </li><li> Op 10-14 dagen te volgen re-stimulatie, verzamel 200 ul van T-cel-cultuur tot alloantigeen specificiteit beoordelen door flowcytometrieanalyse van pMHC tetramer binding (met behulp van de etikettering en gating strategie in de hoofdstukken 3 en 4.1 beschreven). </li></ol> 6. Langdurig opnieuw stimuleren en cultuur van T cel klonen <ol><li> Voortdurend opnieuw stimuleren en vergroten klonale T cel kweken met de gewenste specificiteit kan elke 14 dagen. Verzamel T celculturen in een steriele 5 ml tube op dag 14 na de laatste anti-CD3 / CD28 microbead stimulatie. Combineer meerdere putjes van dezelfde T-cel kloon in een enkele buis, tot een volume van 2,5 ml. </li&gt; <li> Voeg medium naar het uiteindelijke volume op 2,5 ml te brengen en meng voorzichtig door pipetteren. </li><li> Plaats de 5 ml buis met de T-cel-cultuur in de cel scheiding magneet naar oud microbolletjes uit de cultuur te verwijderen. De dop moet losjes zijn boven op de buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig de dop van de buis. Houd de tube en magneet bij elkaar, giet de celsuspensie in een verse 5 ml tube. Tik niet op of schud de inhoud buis om de laatste druppels van de vloeistof te verwijderen. </li><li> Voeg medium naar het uiteindelijke volume op 4 ml te brengen. Monster 10 pi cellen met een hemocytometer tellen. </li><li> Herstel T cellen door centrifugatie bij 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteren supernatant. Hersuspenderen T-cellen bij 10 6 cellen / ml humane T cel kweekmedium. Breng 1 ml porties aan elk putje van een 24-well weefselkweek platen. </li><li> Opnieuw stimuleren T-cellen door het toevoegen van 100 ul medium dat 12,5 pl stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microbolletjes (zoals beschreven in secties 5,2-5,6). Incubeer bij 37 ° C in een 6% CO2 incubator. </li></ol>

<ol><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li>
<li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li>
<li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+estimation+of+the+human+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li>
<li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+%CE%B2-chain+diversity+in+%CE%B1%CE%B2+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+T-cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li>
<li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li>
<li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+APCs%2C+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%2B+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li>
<li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li>
<li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection%2C+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li>
<li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li>
<li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

T-cel alloreactiviteit is een lang bestudeerd en klinisch relevant fenomeen. De robuuste proliferatieve en effectieve reacties van T-cellen op allogene stimulatie hebben uitgebreide analyses van humane T-celreacties in vitro mogelijk gemaakt door relatief eenvoudige gemengde lymfocytreacties van perifere bloed T-cellen tegen geïnactiveerde allogene cellen. Deze primaire alloreactieve T-celreacties zijn echter oligoklonale, bestaande uit een groot aantal individuele T-cellen die reageren op specifieke alloantigen...

T-lymfocyten zijn kritische componenten van het adaptieve immuunsysteem. T-cellen zijn verantwoordelijk voor niet alleen direct bemiddelen beschermende immuunresponsen tegen pathogenen via verschillende effector mechanismen, maar ook actief handhaven immunologische zelftolerantie en richten van de reacties van andere cellen in het immuunsysteem. Deze functies worden doorheen een aantal geïntegreerde signalen, waaronder T-cel receptor (TCR) ligatie, cytokines en chemokines en metabolieten 1. Van deze signalen, het TCR is van bijzonder belang, omdat de kenmerkende specificiteit die rol van de T cel definieert adaptieve immuniteit. Een TCR interactie met lineaire peptide antigenen door MHC (HLA humane ortholoog) moleculen (pMHC complexen) dat in een zeer specifieke en gevoelige wijze de signalen die T cel effectorfunctie initiëren. De biochemische parameters van TCR interactie met pMHC liganden niet alleen de specificiteit voor Tcel activatie, maar ook een kwalitatieve invloed op daaropvolgende T-celfunctie 2. Aldus bestuderen T-celfunctie vereist vaak behandeling de reacties van klonale T-cellen met gedefinieerde antigene specificiteit. De humane T-cel compartiment, die ongeveer 10 12 αβ T-cellen bevat naar schatting 10 juli - 10 augustus afzonderlijke αβTCRs 3-4. Dit divers repertoire biedt gelegenheid voor de erkenning van de enorme serie van peptiden uit potentiële ziekteverwekkers die een T-cel respons voor beschermende immuniteit zouden vereisen. Geschat wordt dat de frequentie van T-cellen reageren op een bepaald vreemd antigeen door zelf-MHC in de orde van 10 -4 - 10 -7 bij ontstentenis van voorafgaande immuunrespons tegen dat antigeen 5. De naïeve T-cel repertoire wordt gevormd door thymus selectie die zichzelf herkennen MHC-peptide-antigenen presenteren en beperken reageren verzekerentiviteit tegen zelf-peptide-antigenen, het maximaliseren van het potentieel nut voor het bemiddelen van beschermende immuniteit 2. In strijd met deze ontworpen reactiviteit, een relatief grote frequentie, 10 -3 - 10 -4, van T-cellen uit immunologisch naïeve individuen reageren op stimulatie met allogene cellen, en zowel het vreemde MHC-moleculen en de endogene peptiden zij opleveren 6. De erkenning van allogene pMHC liganden is structureel vergelijkbaar met de erkenning van buitenlandse antigenen gepresenteerd door zelf-MHC; de TCR maakt kritische biochemische interacties met zowel allogene MHC-molecuul en het gepresenteerde peptide 7. De robuuste karakter van de respons van T-cellen allogene stimulatie gevolg van de diversiteit van pMHC complexen aanwezig op het oppervlak van allogene cellen 8. Geschat wordt dat elk MHC geeft ongeveer 2 x 10 4 verschillende endogene peptide antigenen 9. Deze breadth respons op allogene stimulatie is een belangrijk aspect van de klinisch relevante pathologie, zoals transplantaatafstoting of graft versus host disease (GVHD) als gevolg van T cel alloreactiviteit. Studie van humane T cel responsen alloreactieve traditioneel vertrouwd op behandeling polyklonale responsen van naïeve T-cellen na stimulatie met allogene cellen. Herhaalde stimulatie met dezelfde allogene cellijn gecombineerd met beperkende verdunning analyses kan genereren klonale T-cellen met gedefinieerde erkenning van allogene HLA 10. Deze benadering is problematisch voor de behandeling reacties op individuele allogene pMHC liganden, zoals de grote en diverse repertoire van endogene pMHC complexen voor een bepaalde allogene HLA onderhavige stimuleert een breed repertoire van T-cellen. Deze massapopulatie stimulatie en beperkende verdunning aanpak screening van grote aantallen klonen vereisen om T-cellen te isoleren met de gewenste Reactivity tegen een enkele pMHC ligand. Bovendien is de frequentie van T-cellen reageren op een individuele allogene pMHC ligand relatief laag bij naïeve T-cel populaties die een belemmering voor efficiënte productie van humane T cel klonen die reageren op een bepaald antigeen presenteert. Identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen van polyklonale populaties zijn ingeschakeld door de ontwikkeling van fluorofoor gelabeld pMHC multimeren 11. Deze benadering maakt gebruik van specifiek peptide antigenen in recombinante oplosbare gebiotinyleerde MHC moleculen die gelabeld door binding aan een met streptavidine gemerkt fluorofoor geladen. Multimerizatie van pMHC verhoogt de gretigheid, het compenseren van de intrinsiek lage (uM) affiniteit van TCR voor oplosbare pMHC liganden. Gelabelde cellen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd door flowcytometrie. Echter, deze benadering nog steeds beperkt door de lage frequentie van antigeen-specifieke T-cellen bij naïeve T-celpopulaties, die typischordes van grootte kleiner dan de limiet van nauwkeurige identificatie en kwantificatie van de meeste flowcytometers. Om deze beperking te pakken, is een werkwijze pMHC tetrameer labeling en daaropvolgende magnetische bead verrijking voor tetrameer gelabelde cellen 12 ontwikkeld. Deze methode betrouwbare detectie, telling en isolatie van laagfrequente antigeen-specifieke T-cellen aangetoond. Dit protocol beschrijft een effectief protocol voor het genereren van humane T cel klonen die specifiek reageren op afzonderlijke allogene pMHC liganden. Het protocol geldt pMHC (HLA) multimeer etikettering en verrijking voor de isolatie van allogeen-specifieke menselijke T-cellen met flowcytometrie celsortering en een robuuste werkwijze voor in vitro kweek van humane T-cellen om de productie van T-celklonen uit één gesorteerde cellen (inschakelen overzicht in figuur 1).

<table><tbody><tr><td>Sodium heparin veneuze bloedopvangbuis 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, 1x zonder Ca of Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rund serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-gelabeld pMHC tetrameer</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Biotin Selection Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Selection magneet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Human Fc blokkeringsoplossing</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM, zonder b-ME of L-glutamine</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinesulfaat (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum, mannelijke donor</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel sortering buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human T Cell Cultuur Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM</td><td>351.6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactiveerd human AB serum</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine (50 mg/ml)</td><td>0.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol (14.3 M)</td><td>1.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant humaan IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genereren van menselijke allogeen-specifieke t-cellen uit perifeer bloed

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

De studie van de biologie van menselijke T-lymfocyten omvat vaak onderzoek naar reacties op activerende liganden. T-cellen herkennen en reageren op verwerkte peptidantigenen die door MHC-moleculen (de humane orthologe HLA) worden gepresenteerd via de T-celreceptor (TCR) op een zeer gevoelige en specifieke manier. Hoewel de primaire functie van T-cellen is om beschermende immuunreacties te mediëren op vreemde antigenen die door zelf-MHC worden gepresenteerd, reageren T-cellen krachtig op antigene verschillen in allogene weefsels. T-celreacties op alloantigenen kunnen worden beschreven als directe of indirecte alloreactiviteit. Bij alloreactiviteit reageert de T-cel door zeer specifieke herkenning van zowel het gepresenteerde peptide als het MHC-molecuul. De robuuste oligoklonale reactie van T-cellen op allogene stimulatie weerspiegelt het grote aantal potentieel stimulerende alloantigenen die aanwezig zijn in allogene weefsels. Hoewel de breedte van alloreactieve T-celreacties een belangrijke factor is bij het initiëren en mediëren van de pathologie geassocieerd met biologisch relevante alloreactieve reacties zoals graft versus host disease en allograft-afstoting, kan dit de analyse van T-celreacties op allogene liganden belemmeren. Daarom beschrijft dit protocol een methode voor het genereren van alloreactieve T-cellen uit naïeve humane perifere bloedleukocyten (PBL) die reageren op bekende peptide-MHC (pMHC) alloantigenen. Het protocol past pMHC multimeerlabeling, magnetische kralenverrijking en flowcytometrie toe op enkele cel in vitro kweekmethoden voor de generatie van alloantigene-specifieke T-celklonen. Dit maakt studies mogelijk naar de biochemie en functie van T-cellen die reageren op allogene stimulatie.

Dit protocol beschrijft de productie van klonale menselijke T celculturen met gedefinieerde specificiteit allogeen via een magnetische kraal verrijking en eencellige flowcytometrie sortering strategie. Figuur 1 geeft een overzicht van het proces. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Figuur 1: Protocol overzicht Het protocol beschreven hier biedt een betrouwbare methode voor het g...

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane T-cellen met een gedefinieerde allo-antigeenspecificiteit te identificeren, isoleren en klonen. Dit wordt bereikt door eerst T-lymfocyten uit het gehele perifere bloed te isoleren door middel van dichtheidsgradientcentrifugering. In de tweede stap worden de allo-antigeenspecifieke T-cellen gelabeld met Fluor vier-geconjugeerd peptide, HLA-tetrameren en verrijkt door magnetische scheiding.Vervolgens worden de gelabelde T-cellen geïsoleerd door middel van celsortering met enkelcel-flowcytometrie. Ten slotte worden de enkelcelculturen gestimuleerd met anti CD drie en anti CD 25-antilichamen. Uiteindelijk kan de allo-reactiviteit van de antigeenspecifieke T-cellen worden geëvalueerd door flowcytometrische analyse.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere technieken zoals bulklymfocytstimulering en beperkte verdunning is dat deze techniek de generatie van T-celklonen met specifieke reactiviteit op goed gedefinieerde allo-antigenen mogelijk maakt. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in deze methode moeite hebben met het kweken en uitbreiden van de T-celklonen. Dit vereist zorgvuldige dagelijkse monitoring van de culturen voordat de procedure wordt begonnen.Deel vier milliliters van kamertemperatuur dichtheidsgradient in twee tot vier steriele 15 milliliter conische centrifugeerbuizen. Gebruik 70% ethanol om de buitenkant van een tot twee gevulde groene top bloedafnamebuizen te vegen die bloed bevatten van een gezonde vrijwilliger en verwijder vervolgens voorzichtig de toppen, giet het bloed in een steriele 50 milliliter centrifugeerbuis en vul vervolgens elke afnamebuis met 10 milliliter PBS. Combineer de wassingen met het uitgegoten volbloed en meng vervolgens voorzichtig een oplossing en incubeer de cellen met 25 microliters humaan T-celverrijkingscocktail per twee milliliter totaal volume van het verdunde bloed. Gebruik na 20 minuten een 10 milliliter pipet om maximaal 10 milliliter bloed voorzichtig bovenop het dichtheidsgradientmedium te leggen, zorg ervoor dat het oppervlak van de gradient niet wordt verstoord.Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten en gebruik vervolgens een vijf milliliter pipet om voorzichtig de leukocytenlaag van het grensvlak van het dichtheidsgradient en het verdunde plasma over te brengen in een steriele 50 milliliter conische buis. Breng het volume van de verzamelde perifere bloedlymfocyten op 50 milliliter aan met PBS en meng de celsuspensie voorzichtig. Tel vervolgens de cellen en verwijder een 1 milliliter aliquot voor analyse.Vervolgens, na het afcentrifugeren van de cellen, suspendeer de pellets in één milliliter flowcytometriebuffer en meng 50 microliters van de verdunde allo-antigeenpeptide MHC-tetrameer in de celsuspensie. Breng de cellen over in een steriele vijf milliliter buis en was de cellen na 30 minuten in twee milliliter sorteerbuffer. Suspendeer het palet in 100 microliters sorteerbuffer en incubeer vervolgens de cellen in 10 microliters biotin-selectiecocktail gedurende 15 minuten.Incubeer vervolgens de cellen in vijf microliters magnetische deeltjes gedurende 10 minuten en meng vervolgens de celsuspensie voorzichtig met 2,5 milliliter sorteerbuffer. Verwijder een 100 microliter aliquot van de analyse van de verrijkte cellen en plaats vervolgens de buis in de celscheidingsmagneet. Na vijf minuten houd de buis en magneet samen vast en giet de inhoud in een nieuwe vijf milliliter buis.Vervolgens verwijdert u de buis uit de magneet en was de cellen in twee milliliter sorteerbuffer, suspendeert het pellet in koude sorteerbuffer en verdeelt de cellen in twee milliliter koude sorteerbuffer per monstertype. Na het opnieuw centrifugeren van de monsters, suspendeert u de pellets in 25 microliters koude sorteerbuffer en incubeert u de cellen in vijf microliters humaan FC-blok op ijs gedurende 20 minuten. Incubeer vervolgens de buizen met 20 microliters van de juiste antilichaamcocktail.Na 20 minuten wast u de cellen in nog eens twee milliliter koude sorteerbuffer en suspendeert u de pellets bij een tot twee miljoen cellen per milliliter. In meer buffer verdeelt u 100 microliters humaan T-celcultuurmedium in elke put van een 96-puts ronde bodemcelcultuurplaat en bewaart u de plaat op ijs tot het sorteren is voltooid. Na het sorteren centrifugeert u de plaat en plaatst u de cellen vervolgens op 37 graden Celsius in een 6% CO2-incubator.Vervolgens mengt u het juiste volume activatorbeads door te vortexen en brengt u het juiste volume beads over in een steriele vijf milliliter buis. Na het wassen van de beads op de magneet, giet u de wasoplossing af en voegt u 100 microliters humaan T-celcultuurmedium toe per 0,5 microliters microbeads in de buis. Verdeel vervolgens 100 microliters van de activatorbead-suspensie in elke put van de 96-puts plaat en plaats de cellen terug in de incubator.Kleine clusters van proliferatieve cellen kunnen microscopisch worden waargenomen na vijf tot zeven dagen van cultuur, 14 dagen na celisolatie. Vervang voorzichtig 100 microliters medium vanaf de bovenkant van de culturen met 100 microliters vers humaan T-celcultuurmedium. Grote celclusters zouden microscopisch zichtbaar moeten zijn twee tot drie dagen na de voeding en macroscopisch zouden celpellets zichtbaar moeten worden gedurende de 14 dagen na de mediumverandering.Na 28 dagen na celisolatie, brengt u het gehele volume van 200 microliters van de groeipositiefve culturen over in individuele putten van een 48-puts weefselcultuurplaat die 200 microliters humaan T-celcultuurmedium bevat. Voeg vervolgens 12,5 microliters van de stimulerende anti CD drie, anti CD 28 microbeads toe in 100 microliters humaan T-celcultuurmedium en plaats de plaat terug in de incubator drie tot vijf dagen na de herstimulering. Het medium zou strogeel beginnen te worden.Op dit punt brengt u de culturen over in individuele putten van een 24-puts weefselcultuurplaat en voegt u 500 microliters humaan T-celmedium toe aan elke cultuur. Ten slotte, op 10 tot 14 dagen na herstimulering, verzamelt

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om allogeen-specifieke anergie induceren in humane perifere bloed mononucleaire cellen. De techniek kan klinisch worden toegepast op niet-alloreactieve donorcellen te genereren. Infusie van deze cellen zou kunnen verbeteren immuun reconstitutie en vermindering van toxiciteit na allogene hematopoietische stamceltransplantatie.

Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

We beschrijven een waardevolle diagnostische test die zouden kunnen worden gebruikt om de terugtrekking van immunosuppressie na transplantatie beslist zo verhoogd risico op afstoting. De test maakt gebruik van de principes van Delayed Type Overgevoeligheid en biedt nauwkeurige beoordeling van zowel donor-specifieke effector en regulerende immuunreacties gemonteerd door de ontvangers.

Trans-vivo Vertraagd Type Overgevoeligheid Assay voor Antigen Specifieke Verordening

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

We presenteren hier een methode om functionele antigeen (Ag)-specifieke regulatoire T-cellen (Tregs) te ontwikkelen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) voor immunotherapie van auto-immuun artritis in een muismodel.

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Dit document beschrijft een werkwijze voor het meten van alloreactiviteit in een gemengde populatie van T-cellen met behulp van beeldvorming flowcytometrie.

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Leer menselijke allogeen-specifieke T-cellen genereren uit perifeer bloed met dichtheidsgradiëntcentrifugatie, magnetische separatie en flowcytometrie. Deze methode ondersteunt immunologisch onderzoek naar transplantatiebiologie.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Meer video's verkennen