Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Het algemene doel van deze procedure is om de stamceleigenschappen van humane ovariële carcinoomcellen te evalueren met behulp van multi- en eencellig sferen-assays. Dit wordt bereikt door eerst SOX twee reporter RFP lentivirus Getransduceerde cellen te selecteren door Pur Mycin behandeling in de tweede stap, worden de RFP positieve en RFP negatieve cellen geïsoleerd en geplaatst per put als enkele of meerdere celkolonies. Vervolgens wordt de primaire sfeervorming onder de microscoop geanalyseerd en daarna worden de primaire sfeerculturen gedissocieerd en opnieuw geplaatst voor analyse van de secundaire sfeervorming.

Uiteindelijk worden deze sfeer-assays gebruikt om de verhouding van vermeende ovariële kankerstamcellen die sfeervormingscapaciteit vertonen te berekenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van kankerstamcellen, zoals wat zijn enkele mogelijke kankerstamcelpopulaties en wat is de frequentie in de hele tumorzaak. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de identificatie van ovariële kankerstamcellen, kan deze ook worden toegepast voor het isoleren van kankerstamcellen van andere solide tumorentiteiten zoals borstcarcinoom.

24 uur na het transduceren van humane ovariële carcinoomcellen met lentivirale deeltjes, verwijder de virale supernatant en was de cellen in PBS-cultuur. De cellen in compleet medium gedurende 48 uur. Verander vervolgens het medium en voeg na vijf dagen 10 microgram per milliliter piro mycine toe.

Behandel de culturen met schild een met een verdunning van één op 1000 de volgende dag. Was de cellen in PBS en los ze vervolgens op met 0,05% tripsin EDTA. Na drie minuten, stop de reactie met compleet medium.

Tel de cellen en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 300 keer G en kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen voorzichtig in 0,5 tot één milliliter steriele PBS en zeef vervolgens de resulterende celsuspensie door een 40 micrometer filter. Pas de cellen aan tot een verdunning van vijf maal 10 tot de zesde cel per milliliter en voeg vervolgens 100 microliters sferenmedium toe aan elke put van een ultra lage aanhechting 96-welplate voor een eencellig gebaseerde sfeer assay.

Gebruik de eencellig modus om één cel in elke put van de plaat te sorteren. Beoordeel vervolgens de cellen microscopisch om de aanplantefficiëntie te beoordelen. Incubeer de cellen in vers sferenmedium bij 37 graden Celsius en 5%CO2 met dagelijkse supplementatie van basische fibroblastgroeifactor en epidermale groeifactor.

Na één week, bepaal het aantal opkomende tumorbollen door lichtmicroscopie en de aanwezigheid van het fluorescerende signaal van het geïntegreerde reportersysteem door fluorescentiemicroscopie. Tel de bollen met een diameter groter dan 100 micrometer als grote bollen en de bollen met een diameter van 50 tot 100 micrometer als kleine bollen. Zorg ervoor dat echte bollen worden geteld en niet celclusters.

Bereken vervolgens de verhouding van sfeervormende RFP positieve of RFP negatieve cellen volgens de formule tot passage. De bollen beginnen met het overbrengen van de inhoud van elke put in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Spoel vervolgens elke put drie tot vijf keer met PBS om er zeker van te zijn dat alle bollen worden verzameld en centrifugeer de cellen 10 minuten bij 300 keer G en kamertemperatuur.

Na centrifugatie, verwijder de snat en resuspendeer de pellets in 200 microliter 0,05% tripsin EDTA bij 37 graden Celsius in een zachte shaker gedurende vijf minuten. Als er na vijf minuten geen grote bollen zichtbaar zijn, tritreer de celoplossing voorzichtig met een 100 microliter pipettentip en voeg 500 microliter compleet medium toe om de trypsine te inactiveren. Centrifugeer de cellen, resuspendeer de pellets voorzichtig in sferenmedium en zeeft de resulterende celsuspensie door een 40 micrometer filter zoals net beoordeeld.

Ten slotte, voor serieel herplanten van de enkele cellen, zaai enkele cellen van een primaire bol in 100 microliter sferenmedium per put in een nieuwe ultra lage aanhechting 96-welplate. Gebruik vervolgens dezelfde formule als voor de primaire bollen assay om de verhouding van sfeervormende cellen in de secundaire bollen te beoordelen. Assays in multi-cell gebaseerde bollen assays bijna 40%van de RFP positieve humane ovariële carcinoomcellen vergeleken met slechts 20%van de RFP negatieve cellen gaven aanleiding tot een individuele tumorbol in de primaire bollen assay.

Verrassend genoeg worden hogere aantallen bollen geteld van lagere aantallen geplaatste cellen in zowel MGEM als D-M-E-M-F 12 gebaseerde media, wat aantoont dat de aanplantmodaliteiten de resultaten in deze assay sterk beïnvloeden. In tegenstelling, wanneer cellen worden geïmmobiliseerd door de toevoeging van 1%methylcellulose, is de efficiëntie van de bolvorming meestal onafhankelijk van de celdichtheid in multi-cell gebaseerde bollenculturen. Ongeveer 35%van de cellen van de RFP positieve bollen verliezen hun rode fluorescente signaal na zeven dagen cultivering, wat suggereert dat deze cellen differentiatie hebben ondergaan, terwijl meer dan 65%van de cellen een RFP-signaal behouden, wat een zelfvernieuwende capaciteit suggereert.

In tegenstelling, cellen van bollen gegenereerd uit aanvankelijk RFP negatieve cellen blijven RFP negatief, wat aangeeft dat ze onder deze omstandigheden het stamcelpotentieel niet kunnen herstellen. Fluorescerende microscopie uitgevoerd op bollen gegenereerd uit enkele cellen bevestigt deze gegevens en toont aan dat enkele bollen afkomstig van RFP positieve cellen zowel RFP positieve als RFP negatieve cellen bevatten. Terwijl bollen afkomstig van RFP negatieve cellen hun gebrek aan rood signaal behouden. Volgend op deze procedure.

Andere metingen zoals antilichamen, kleuring of genexpressieanalyse via quantit PCR kunnen worden uitgevoerd om de cellen met bolvormingscapaciteit verder te karakteriseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat in vivo transplantatie-assays in geïmmuniseerde muizen moeten worden uitgevoerd om de tumor stamceleigenschappen van de bol-initiërende cellen te valideren.