Name: Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer de evaluatie van stamcelkenmerken in humane ovariumcarcinoomcellen met behulp van single- en multi-cell gebaseerde sphere-assays. Deze methode helpt onderzoekers kankerstamcellen nauwkeurig te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) toegekend aan C.L. We danken Dr. Martina Konantz voor kritische input en het herzien van het manuscript. We danken Emmanuel Traunecker en Toni Krebs van de DBM FACS Facility (University Hospital Basel) voor hun hulp bij FACS-sortering.

1. Generatie van OVCAR-3 Human ovariumcarcinoom cellen die stabiel Getransduceerde met Lentivirussen Bevat de SOX2 Regulatory Gewest Reporter Construct <ol><li> Genereren lentivirale deeltjes door transfectie van de HEK 293T-inpakcellijn met een reporterconstruct herkennen van een SOX2 regulerende regio zoals beschreven 10,21. OPMERKING: De verslaggever construct bevat verder een destabilisatie domein van de ProteoTuner Shield System voorsprong op de tdTomato fluorescentie eiwit. Shield1 bindt aan de destabilisatie domein aldus het proteasoom de fluorescentie-eiwit 22 degraderen voorkomen. </li><li> Transduceren OVCAR-3 cellen met lentivirale deeltjes gedurende een periode van 24 uur. Daarna verwijdert de virale supernatant en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gekweekt in compleet medium (RPMI aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine). </li><li> 48 uur later, 10 ug / ml puromycin toegevoegd aan de kweken en gedurende 5 dagen selectie van goed getransduceerde cellen mogelijk. </li></ol> 2. Voorbereiding van Cell Sorting en Plating <ol><li> Voeg Shield1 bij 1: 1000 verdunning 24 uur voorafgaand aan het sorteren van cellen. Gebruik stabiel getransduceerde OVCAR-3 cellen zonder Shield1 behandeling negatieve controles (figuur 1). Zuig media van kolf, wassen cellen met 1x PBS en trypsinize cellen met 0,05% trypsine-EDTA gedurende 3 min. </li><li> Stop trypsine met compleet medium (zie hierboven), telling celaantallen Centrifugeer cellen bij 300 g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) gedurende 5 min. </li><li> Giet supernatant en resuspendeer cellen zorgvuldig in 0,5-1 ml steriele PBS. </li><li> Gebruik 40 micrometer cel zeefdop filter om eencellige suspensie te verkrijgen. </li><li> Pas celgetal tot 5 miljoen cellen per ml. </li><li> Bereid ultra low-attachment 96-well platen met 100 ul bollen medium (MEGM aangevuld met groeifactoren, cytokines, en supplementen,B-27, heparine-natrium; of DMEM / F12 aangevuld met groeifactoren, cytokines, en supplementen, B-27, heparine-natrium met of zonder toevoeging van 1% methylcellulose, zie ook tabel 1). Eventueel antibiotica aan het medium bij een concentratie van 100 E / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine om het risico van mogelijke besmetting te minimaliseren. </li><li> Sorteer RFP + en RFP- cellen in bereid 96 putjes van boven, 1 cel per putje (eencellige gebaseerde sferen assay) en 100 cellen per putje (meerdere cellen gebaseerde assay bollen), respectievelijk. Uit te voeren soort op commercieel beschikbare celsorteerder (zie Materials) met behulp van enkele cel modus Sorteren setup: 100 μ mondstuk, schede druk 20 psi, en de opbrengst masker 0, zuiverheid masker 32, fase masker 16. </li><li> Beoordeel plating efficiëntie door microscopisch maken van putjes die cellen (voor de enkele cellen gebaseerde assay) en celaantallen telling in afzonderlijke putjes (voor meerdere cellen gebaseerde assay Figuur 2 </stronG&gt;). </li><li> Incubeer cellen onder standaardomstandigheden in sferen medium (voor de samenstelling zie stap 2.6) bij 37 ° C en 5% CO2. Supplement dagelijks bFGF (20 ng / ml) en EGF (20 ng / ml). </li><li> Na één week, tellen aantal opkomende tumor bolletjes met een standaard microscoop met 4x of 10x vergroting en een fluorescentie microscoop fluorescentiesignaal van het geïntegreerde reporter systeem detecteren. Telling bollen met een diameter groter dan 100 pm als &quot;grote&quot; bollen en bollen met een diameter 50 - 100 urn als &quot;kleine&quot; bolletjes (Figuur 3). Zorg ervoor dat u rekenen echte bollen en clusters niet cel. Opmerking: In single celgebaseerde proeven bol vorming gemakkelijker microscopisch toonde na 10 (versus 7) dagen kweken. </li><li> Bereken het percentage bol vormende cellen RFP + respectievelijk RFP- cellen in één celgebaseerde proeven (een 96-well plaat voor elk experiment) of meerdere cel-based sferen assays (één goed voor elke individuele experiment) zoals gepresenteerd door Shaw et al. 16 OPMERKING: Percentage gebied vormende cellen (%) = (aantal bollen) / (aantal gezaaide cellen) x 100 </li></ol> 3. Seriële passage van de Bollen <ol><li> Breng de inhoud van elk putje in een geschikte steriele buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Voor multi-cel-gebaseerde sferen assays, verzamelen samen de sferen van het ene goed. Was de put 3-5 maal met PBS en centrifugeer 2 minuten langer. Voor single-cell based sferen assays, het verzamelen van individuele bollen. Door de lage aantallen cellen, gebruik 1,5 ml buizen voor centrifugatie en wasstappen. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ul 0.05% trypsine-EDTA. </li><li> Om een ​​optimale celscheiding bereikt, incubeer de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 5 min in een zachte shaker. Optimaliseer trypsinisatie tijd voor uw cellijn tot lagere celdood tarief: als er geen grotebollen zichtbaar vermaal voorzichtig met behulp van een 100 ul pipet tip. Bij grote bollen zijn nog steeds aanwezig, incubeer met trypsine nog eens 3 min en vervolgens overgaan tot de tritureren stap. In het geval van enkelvoudige zorg ervoor om de tijd te optimaliseren voor een optimale cel opbrengst van levende cellen tijdens de behandeling met trypsine stap cel-gebaseerde testen. </li><li> Om het trypsine te inactiveren, voeg 500 ul volledig medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij cel assays, centrifuge extra 2 min. </li><li> Verwijder supernatant en resuspendeer cellen zorgvuldig in sferen medium. </li><li> Gebruik een 40 micrometer cel zeefdop filter om een ​​eencellige suspensie te verkrijgen. </li><li> Bij gebruik RFP + en RFP- cellen in meercellige bassed assays beoordelen het percentage fluorescerende cellen in elk putje na resuspensie via flowcytometer analyse. </li><li> Voor seriële replating testen van enkele cellen, zaden 1 cel per putje in een nieuwe ultra low-attachment 96-well plaat bereid zoals hierboven gedetailleerd. Van het ene individu bol, zaad ongeveer 20 individuele putten. Voor replating testen van meerdere cellen gebaseerde primaire werelden, zaadcellen verkregen uit een bron van primaire werelden in een nieuwe 96-well plaat en tel de celaantallen volgende dag microscopie. </li><li> Beoordelen van het aandeel van de-bol-vormende cellen in het voortgezet sferen testen met behulp van de formule in stap 2.11 beschreven. </li></ol> 4. Resultaat Analyse <ol><li> Resultaten van experimenten uitgevoerd in onafhankelijke triplo geanalyseerd en gebruikt t-Test tweezijdige Student&#39;s normaal verdeelde waarden en anderszins Mann-Whitney-analyse Tests voor statistische analyse. </li></ol>

<ol><li>Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+the+principles+of+stem-cell+biology+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applying the principles of stem-cell biology to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+Molecular+concepts+and+relevance+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets.</a> Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).</li>
<li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).</li>
<li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).</li>
<li>Stewart, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+and+instability+of+human+ovarian+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Cannistra, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+variant+expression+is+a+common+feature+of+epithelial+ovarian+cancer%3A+lack+of+association+with+standard+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors.</a> J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).</li>
<li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+associates+with+stem+cell+state+in+human+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma.</a> Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).</li>
<li>Pham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+and+prognostic+significance+in+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Pathol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma.</a> Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).</li>
<li>Lengerke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+embryonic+stem+cell+marker+SOX2+in+early-stage+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 11, 42(2011).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li>
<li>Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-forming+assays+for+assessment+of+benign+and+malignant+pancreatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).</li>
<li>Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+identification+of+colon+cancer+stem+cell-derived+spheres+from+the+Colo205+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line.</a> Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+phenotypically+distinct+breast+cancer+cell+subsets+based+on+Sox2+transcription+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity.</a> Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+reversible%2C+and+tunable+method+to+regulate+protein+function+in+living+cells+using+synthetic+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+skin%3A+transforming+growth+factor-beta+%28TGF-beta%29+facilitates+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth.</a> Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).</li>
<li>Walia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+breast+epithelial+marker+hCLCA2+promotes+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+indicates+higher+risk+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis.</a> Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).</li>
<li>Leung, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-small+cell+lung+cancer+cells+expressing+CD44+are+enriched+for+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties.</a> PLoS One. 5 (11), e14062(2010).</li>
<li>Bertolini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+tumorigenic+lung+cancer+CD133%2B+cells+display+stem-like+features+and+are+spared+by+cisplatin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).</li>
<li>Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem-like+cells+can+be+isolated+with+drug+selection+in+human+ovarian+cancer+cell+line+SKOV3%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+and+breast+cancer+spheres+are+similar+in+transcriptomic+features+and+sensitive+to+fenretinide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide).</a> Biomed Res Int. 2013, 510905(2013).</li>
<li>Du, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+mechanisms+of+anti-CD44+monoclonal+antibody+A3D8+on+proliferation+and+apoptosis+of+sphere-forming+cells+with+stemness+from+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynecol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer.</a> Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).</li>
<li>Xiang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17+produced+by+tumor+microenvironment+promotes+self-renewal+of+CD133+cancer+stem-like+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer.</a> Oncogene. , (2013).</li>
<li>Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+ovarian+cancer+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems.</a> Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).</li>
<li>Soritau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chemoresistance+and+tumor+sphere+formation+as+a+laboratory+model+for+peritoneal+micrometastasis+in+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Rom+J+Morphol+Embryol%22%5BJournal%5D)">Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer.</a> Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).</li>
<li>Shi, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cancer+stem+cell-like+cells+from+human+epithelial+ovarian+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic+microenvironment+upgrades+stem-like+properties+of+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 201(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sferen culturen zijn een gebruikte methode om kanker stamcellen potentieel te testen en te verrijken voor stamcellen-achtige cellen in een breed spectrum van menselijke tumorcellen 15,25,26. Onder deze kweekomstandigheden worden kankercellen die zelfvernieuwing vermogen missen verwacht differentiëren en uiteindelijk celdood. Hoewel ze aanvankelijk celgroepen of tumor bollen name primaire assays kunnen vormen, zijn ze niet in staat bol vormende vermogen van seriële replating stand door gebrek aan zelf-vernieuw...

Er is toenemend bewijs dat ovariële carcinomen bestaan uit heterogene mengsels van cellen en zogenaamde “kankerstamcellen” (CSCs) bevatten die verantwoordelijk zijn voor het initiëren, onderhouden en terugvallen van de ziekte na conventionele cytotoxische therapieën1-3. Daarom is de ontwikkeling van moleculaire strategieën die zich richten op ovariële CSCs een belangrijk doel en belooft de therapie van patiënten met ovariumkanker te verbeteren.
Een voorwaarde voor het begrijpen van de moleculaire kenmerken van CSCs is hun betrouwbare isolatie van de niet-CSCs. Echter, de identificatie van ovariële CSCs lijkt uitdagend. Terwijl CD133-expressie en aldehyde dehydrogenase (ALDH)-activiteit4,5 zijn gerapporteerd als markering voor ovariële CSCs, geven sommige gegevens aan dat deze markers onstabiel zijn6. Consistent, in ovariële kanker, anders dan bijvoorbeeld in borstcarcinoom7, associeert expressie van ALDH1 met een gunstig resultaat8 en expressie van de voorgestelde stamcelmarker CD44-variant heeft geen prognostische waarde9. Meer recentelijk hebben we aangetoond dat expressie van het embryonale stamcel-eiwit SOX2 stamceeldheid verleent aan ovariële carcinoomcellen10 en hoge SOX2-expressie associeert met klinisch agressieve ovariële en borstcarcinomen11,12. Daarom gebruiken we in dit rapport een lentivirale reporterconstruct die een rood fluorescent eiwit (RFP) bevat waarvan de expressie wordt gecontroleerd door een SOX2-regulerende regio, als een methode om veronderstelde ovariële CSCs te isoleren.
Per definitie kunnen CSCs zichzelf zowel vernieuwen als differentiëren, waardoor ze alle tumorceltypen voortbrengen. Veronderstelde CSC-populaties moeten worden geanalyseerd in functionele assays die in vivo worden uitgevoerd. Om duidelijke redenen zijn dergelijke functionele tests bij menselijke cellen beperkt tot xenograft-assays, meestal bestaande uit transplantatie van menselijke tumorcellen in immuungecompromitteerde muizen10,13.
Een alternatieve in vitro-methode werd aangeboden door Brent Reynolds en Sam Weiss die voor het eerst het zogenaamde neurosfeer-assay rapporteerden als een surrogaat-assay voor het evalueren van stampotentieel in neurale cellen14. Dontu en collega's bevestigden later het gebruik van deze assay voor evaluatie van stamcelpotentieel in borstcellen15,16. Hier werden humane mammaire cellen in verschillende aantallen in serumvrij medium geplaatst, aangevuld met epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblast groeifactor (bFGF), B-27 en heparine en gecultiveerd onder niet-adherente omstandigheden gedurende zeven tot tien dagen voordat sfeersvorming werd beoordeeld door microscopie. Door dit protocol te volgen met enkele aanpassingen in celaantal, groeimedium en supplementen, hebben verschillende groepen in vitro stamcelpotentieel van verschillende kankertypen onderzocht, zoals borst17, hersenen18, pancreas19 en colon20 tumoren. In ovariële carcinoom hebben we recent de haalbaarheid van de sfeers-assay gerapporteerd en de resultaten ervan vergeleken met de resultaten die werden verzameld in in vivo murine xenograft-modellen10. We ontdekten dat overexpressie van het stamcel-eiwit SOX2 zowel in vitro sfeersvorming als in vivo tumorigeniteit van humane ovariële carcinoomcellen versterkte10. Echter, de frequentie van sfeers-initiërende cellen was hoger dan de frequentie van tumor-initiërende cellen gemeten in vivo10, wat suggereert dat ofwel de sfeers-assay kan leiden tot valse positieve resultaten vanwege technische redenen of, alternatief, dat de in vivo-assay inefficiënt kan zijn en resulteren in valse negatieve resultaten.
In dit rapport analyseren we multi-celgebaseerde ovariële sfeers-assays in meer detail, beoordelen we de verschillende protocollen die beschikbaar zijn in de literatuur en vergelijken we deze met een enkel-celgebaseerde assay. We tonen aan dat de enkel-celgebaseerde assay nauwkeuriger en reproduceerbaardere resultaten levert dan multi-celgebaseerde assays, die sterk kunnen worden beïnvloed door de dichtheid van de geplateerde cellen, tenzij methylcellulose wordt toegevoegd aan de culturen om cellen te immobiliseren. Echter, zelfs in enkel-celgebaseerde assays, wordt in vitro sfeers-initiërend potentieel waargenomen met een hogere frequentie dan in vivo tumor-initiërend potentieel.

<table><tbody><tr><td>Low-attachment plate</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>endconcentratie: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>endconcentratie: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>endconcentratie: 1X</td></tr><tr><td>Heparine-natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>verdunning 1:1.000</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td>632189</td><td>verdunning 1:1.000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (poeder)</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III cell sorter</td></tr><tr><td>FACS analyzator</td><td>BD</td><td></td><td>Accuri c6 flowcytometer</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

evaluatie van stem cell properties in human ovariumcarcinoomcellen met behulp van multi en single-cell gebaseerde spheres testen

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Jaren van onderzoek wijzen uit dat eierstokkankers een heterogene mix van cellen herbergen, inclusief een subpopulatie van zogenaamde “kanker-stamcellen” (CSC's) die verantwoordelijk zijn voor tumorinitiatie, onderhoud en terugval na conventionele chemotherapieën. Identificatie van eierstokkanker-CSC's is daarom een belangrijk doel. Een veel gebruikte methode om CSC-potentieel in vitro te beoordelen is de sferen-assay, waarbij cellen worden geplaatst onder niet-adherente kweekcondities in serumvrij medium aangevuld met groeifactoren en de vorming van sferen wordt geëvalueerd na enkele dagen. Hier beoordelen we de momenteel beschikbare protocollen voor humane eierstokkanker-sferen-assays en voeren een naast elkaar vergelijkende analyse uit tussen veelgebruikte multicellulaire assays en een nauwkeuriger systeem gebaseerd op het plateren van enkele cellen. Onze resultaten geven aan dat zowel multicellulaire als op enkele cellen gebaseerde sferen-assays kunnen worden gebruikt om de vorming van sferen in vitro te onderzoeken. De meer bewerkelijk en duurdere op enkele cellen gebaseerde assays zijn geschikter voor functionele beoordeling van individuele cellen en leiden tot algemeen nauwkeuriger resultaten, terwijl multicellulaire assays sterk kunnen worden beïnvloed door de dichtheid van de geplateerde cellen en vereisen voorafgaande titratie-experimenten. Aanvulling van methylcellulose op multicellulaire assays kan effectief worden gebruikt om mechanische artefacten te verminderen.

In conventionele bollen assays, bijna 40% van RFP + OVCAR-3 cellen versus 20% van RFP- cellen leidde tot een individuele tumor bol in de primaire gebieden assay (figuur 4A). Bovendien bollen gevormd door RFP + cellen groter in omvang dan die gevormd door RFP- cellen. Wanneer plated in single-cell based assays, RFP + cellen vormde ook meer bollen dan RFP- cellen, ter bevestiging van de resultaten hierboven. Er was echter een tendens generatie minder bollen per uitgeplaat in d...

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Het algemene doel van deze procedure is om de stamceleigenschappen van humane ovariële carcinoomcellen te evalueren met behulp van multi- en eencellig sferen-assays. Dit wordt bereikt door eerst SOX twee reporter RFP lentivirus Getransduceerde cellen te selecteren door Pur Mycin behandeling in de tweede stap, worden de RFP positieve en RFP negatieve cellen geïsoleerd en geplaatst per put als enkele of meerdere celkolonies. Vervolgens wordt de primaire sfeervorming onder de microscoop geanalyseerd en daarna worden de primaire sfeerculturen gedissocieerd en opnieuw geplaatst voor analyse van de secundaire sfeervorming.Uiteindelijk worden deze sfeer-assays gebruikt om de verhouding van vermeende ovariële kankerstamcellen die sfeervormingscapaciteit vertonen te berekenen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van kankerstamcellen, zoals wat zijn enkele mogelijke kankerstamcelpopulaties en wat is de frequentie in de hele tumorzaak. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de identificatie van ovariële kankerstamcellen, kan deze ook worden toegepast voor het isoleren van kankerstamcellen van andere solide tumorentiteiten zoals borstcarcinoom.24 uur na het transduceren van humane ovariële carcinoomcellen met lentivirale deeltjes, verwijder de virale supernatant en was de cellen in PBS-cultuur. De cellen in compleet medium gedurende 48 uur. Verander vervolgens het medium en voeg na vijf dagen 10 microgram per milliliter piro mycine toe.Behandel de culturen met schild een met een verdunning van één op 1000 de volgende dag. Was de cellen in PBS en los ze vervolgens op met 0,05% tripsin EDTA. Na drie minuten, stop de reactie met compleet medium.Tel de cellen en centrifugeer ze gedurende vijf minuten bij 300 keer G en kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen voorzichtig in 0,5 tot één milliliter steriele PBS en zeef vervolgens de resulterende celsuspensie door een 40 micrometer filter. Pas de cellen aan tot een verdunning van vijf maal 10 tot de zesde cel per milliliter en voeg vervolgens 100 microliters sferenmedium toe aan elke put van een ultra lage aanhechting 96-welplate voor een eencellig gebaseerde sfeer assay.Gebruik de eencellig modus om één cel in elke put van de plaat te sorteren. Beoordeel vervolgens de cellen microscopisch om de aanplantefficiëntie te beoordelen. Incubeer de cellen in vers sferenmedium bij 37 graden Celsius en 5%CO2 met dagelijkse supplementatie van basische fibroblastgroeifactor en epidermale groeifactor.Na één week, bepaal het aantal opkomende tumorbollen door lichtmicroscopie en de aanwezigheid van het fluorescerende signaal van het geïntegreerde reportersysteem door fluorescentiemicroscopie. Tel de bollen met een diameter groter dan 100 micrometer als grote bollen en de bollen met een diameter van 50 tot 100 micrometer als kleine bollen. Zorg ervoor dat echte bollen worden geteld en niet celclusters.Bereken vervolgens de verhouding van sfeervormende RFP positieve of RFP negatieve cellen volgens de formule tot passage. De bollen beginnen met het overbrengen van de inhoud van elke put in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Spoel vervolgens elke put drie tot vijf keer met PBS om er zeker van te zijn dat alle bollen worden verzameld en centrifugeer de cellen 10 minuten bij 300 keer G en kamertemperatuur.Na centrifugatie, verwijder de snat en resuspendeer de pellets in 200 microliter 0,05% tripsin EDTA bij 37 graden Celsius in een zachte shaker gedurende vijf minuten. Als er na vijf minuten geen grote bollen zichtbaar zijn, tritreer de celoplossing voorzichtig met een 100 microliter pipettentip en voeg 500 microliter compleet medium toe om de trypsine te inactiveren. Centrifugeer de cellen, resuspendeer de pellets voorzichtig in sferenmedium en zeeft de resulterende celsuspensie door een 40 micrometer filter zoals net beoordeeld.Ten slotte, voor serieel herplanten van de enkele cellen, zaai enkele cellen van een primaire bol in 100 microliter sferenmedium per put in een nieuwe ultra lage aanhechting 96-welplate. Gebruik vervolgens dezelfde formule als voor de primaire bollen assay om de verhouding van sfeervormende cellen in de secundaire bollen te beoordelen. Assays in multi-cell gebaseerde bollen assays bijna 40%van de RFP positieve humane ovariële carcinoomcellen vergeleken met slechts 20%van de RFP negatieve cellen gaven aanleiding tot een individuele tumorbol in de primaire bollen assay.Verrassend genoeg worden hogere aantallen bollen geteld van lagere aantallen geplaatste cellen in zowel MGEM als D-M-E-M-F 12 gebaseerde media, wat aantoont dat de aanplantmodaliteiten de resultaten in deze assay sterk beïnvloeden. In tegenstelling, wanneer cellen worden geïmmobiliseerd door de toevoeging van 1%methylcellulose, is de efficiëntie van de bolvorming meestal onafhankelijk van de celdichtheid in multi-cell gebaseerde bollenculturen. Ongeveer 35%van de cellen van de RFP positieve bollen verliezen hun rode fluorescente signaal na zeven dagen cultivering, wat suggereert dat deze cellen differentiatie hebben ondergaan, terwijl meer dan 65%van de cellen een RFP-signaal behouden, wat een zelfvernieuwende capaciteit suggereert.In tegenstelling, cellen van bollen gegenereerd uit aanvankelijk RFP negatieve cellen blijven RFP negatief, wat aangeeft dat ze onder deze omstandigheden het stamcelpotentieel niet kunnen herstellen. Fluorescerende microscopie uitgevoerd op bollen gegenereerd uit enkele cellen bevestigt deze gegevens en toont aan dat enkele bollen afkomstig van RFP positieve cellen zowel RFP positieve als RFP negatieve cellen bevatten. Terwijl bollen afkomstig van RFP negatieve cellen hun gebrek aan rood signaal behouden. Volgend op deze procedure.Andere metingen zoals antilichamen, kleuring of genexpressieanalyse via quantit PCR kunnen worden uitgevoerd om de cellen met bolvormingscapaciteit verder te karakteriseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat in vivo transplantatie-assays in geïmmuniseerde muizen moeten worden uitgevoerd om de tumor stamceleigenschappen van de bol-initiërende cellen te valideren.

evaluation-stem-cell-properties-human-ovarian-carcinoma-cells-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Deze video protocol toont de isolatie en de uitbreiding van stamcellen als cellen van chirurgisch gereseceerd menselijke glioblastoom mutliforme (GBM) tumor weefsel met behulp van de neurosphere assay kweekmethode.

Isolatie en uitbreiding van de Mens glioblastoma multiforme tumorcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.

Evaluatie van eierstokkanker Sferoïde Hechting en Invasie van mesotheelcellen in Real Time

Kanker stamcellen (CSC) betrokken zijn bij tumor recidief vanwege chemoresistentie. Wij hebben een protocol voor selectie en uitbreiding van CSC van eierstokkanker cellijnen geoptimaliseerd. Door het behandelen van cellen met het chemotherapeutische cisplatine en kweken in een stamcel bevorderen media we verrijken voor niet-hechtende CSC kweken.

Verrijking voor chemoresistent eierstokkanker stamcellen uit menselijke cellijnen

Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Alvleesklierstamcellen (CSC's) kunnen worden uitgebreid in vitro met behulp van de verankeringsonafhankelijke sfeercultuurtechniek, wat een krachtig hulpmiddel is om CSC-biologie te bestuderen en kan dienen als de eerste stap om nieuwe CSC-gerichte therapieën te ontwikkelen. Hier wordt de methodologie voor het uitbreiden, analyseren en targeten van pancreas-CSC's geboden.

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

De aanwezigheid van kanker stamcellen (CSC) in bot sarcomen Onlangs is gekoppeld aan de pathogenese. In dit artikel presenteren we de isolatie van CSCs van primaire celculturen verkregen uit humane biopten van conventionele osteosarcoom (OS) met de mogelijkheid van CSCs groeien onder hechtende omstandigheden.

Oprichting van Cancer Stem Cell Cultures van Human Conventionele Osteosarcoom

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Het doel van deze methodologie is om kankercellen (CSC) te identificeren in kankercellijnen en primaire menselijke tumormonsters met het bolvormende protocol, op een robuuste manier, met behulp van functionele testen en fenotypische karakterisering met stroomcytometrie en westerse Vlek.

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Eierstokkankerstamcellen (OCSC) zijn verantwoordelijk voor kankerinitiatie, recidief, therapeutische resistentie en metastase. De OCSC vasculaire niche wordt beschouwd als het bevorderen van zelfvernieuwing van OCSC's, wat leidt tot chemoresistance. Dit protocol vormt de basis voor het opzetten van een reproduceerbaar OCSC vasculair nichemodel in vitro.

Evaluatie van de angiogenetische eigenschappen van eierstokkankerstamachtige cellen met behulp van het driedimensionale cocultuursysteem, NICO-1

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Leer de evaluatie van stamcelkenmerken in humane ovariumcarcinoomcellen met behulp van single- en multi-cell gebaseerde sphere-assays. Deze methode helpt onderzoekers kankerstamcellen nauwkeurig te identificeren.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen (Video) | JoVE Journal

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Meer video's verkennen