Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Het doel van deze procedure is om muis-embryonale, cochleaire exvivo-cellen te kweken en elektro te bedienen. Om verschillende aspecten van cochleaire ontwikkeling te bestuderen, inclusief morfogenese, differentiatie en groei-evenementen, wordt dit bereikt door eerst de kop te verkrijgen van een embryonale muis op dag 13. Vervolgens worden de binnenoren blootgesteld door de hersenen te verwijderen en deze geïsoleerd van het zich ontwikkelende temporale bot door ze los te maken van de basis van de schedel.

Verwijder vervolgens het overliggende kraakbeen en open de cochleaire ductus om het sensorische epitheel van de cochlea te verkrijgen. De laatste stap is om de gedissekteerde cochlea te kweken met of zonder elektroporatie gedurende maximaal één week. Uiteindelijk kunnen de implantaten worden geanalyseerd voor levende celbeeldvorming of gefixeerd immunokleuring en geanalyseerd door confocale beeldvorming, De cultivering van muis-embryonaal.

Cochleaire uitleg biedt een uitstekend systeem om verschillende aspecten van organogenese te bestuderen, zoals proliferatie, sulfaatspecificatie en polariteit in de zich ontwikkelende cochlea en hoe deze gebeurtenissen bijdragen aan groei en differentiatie. Dus deze techniek maakt het mogelijk om farmacologische manipulaties uit te voeren en genfuncties ex vivo te monitoren. En dus deze techniek gekoppeld aan de genoverdracht via elektroporatie, zou men de expressie van het gen van belang kunnen veranderen en de functie ervan op een enkele celniveau kunnen monitoren.

Om deze procedure te beginnen, plaats een E 13 muis-embryo-kop in een steriele sogar-schaal met koud dissectief oplossing. Onder een dissectief microscoop, immobiliseer de embryo-kop door minutie-pennen rond het ooggebied te plaatsen. Gebruik vervolgens twee paar steriele pincetten om voorzichtig de huid te verwijderen en open de schedel aan de dorsale kant langs de middenlijn.

Verwijder daarna de hersenen uit de craniumholte. De binnenoren die zich in de temporale botten bevinden, kunnen worden geïdentificeerd door de bekleding van het bloedvat eromheen. Vervolgens dissecteren de binnenoren van de temporale botten door de pincetten onder het weefsel te plaatsen en de binnenoor van de basis van de schedel te isoleren.

Breng vervolgens de gedissekteerde binnenoren over naar een nieuwe schaal met koud dissectief oplossing. Orienteer nu het binnenoor zodat de ventrale zijde omhoog wijst. Stabiliseer het binnenoor door voorzichtig het scherpe uiteinde van de minuchin-pennen door de vestibulaire portie te steken.

Gebruik ultrafijne pincetten om het overliggende kraakbeen open te snijden door een incisie te maken nabij het ovale venster. Zorg ervoor dat de pincetten niet te diep in het kraakbeen worden ingebracht, omdat overliggend kraakbeen soms is versmolten met de cochleaire ductus. Verwijder vervolgens voorzichtig het kraakbeen van de cochlea.

Stel vervolgens het sensorische epitheel bloot door de pincetten bij de basis of bij de apex van de cochleaire ductus te plaatsen en voorzichtig het dak van de cochlea omhoog te trekken. Als laatste stap, verwijder voorzichtig het onderliggende bindweefsel van het blootgestelde sensorische epitheel zodat de basis van de cochleaire uitleg vlak is. Isoleer vervolgens de gedissekteerde cochlea van de vestibulaire portie van het binnenoor.

Breng het gedissekteerde sensorische epitheel van de cochlea over in de basement-membraanmatrix Gecoate cultuurput met behulp van een steriele lepel van 1,5 millimeter als verdere reiniging nodig is om extra weefsel te verwijderen, dit kan in dit stadium worden uitgevoerd. Orienteer vervolgens de cochleaire uitleg met het luminale oppervlak van het epitheel naar boven. Aspireer de basement-membraanmatrix DMEM-oplossing om het weefsel voorzichtig te vlakken en voeg voorzichtig 150 microliters vers cultuurmedium toe aan de schaal.

Zorg ervoor dat elke x uitleg goed hecht aan de gecoate glazen dekplaat en niet drijft in het cultuurmedium. Breng vervolgens de micro-dissekteerde cochlea voorzichtig over in een steriele 150 millimeter-cultuurschaal en plaats deze in een weefselkweekincubator. Een 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende drie tot zes DIV.

Na 1D IV. Onderzoek de cultuur onder een dissectief microscoop om er zeker van te zijn dat de cochleaire uitleg goed hecht aan de kweekschaal. Ga dan door met het incuberen van de cultuur in vivo voor de gewenste tijdsperiode voordat deze wordt verwerkt voor immunohistochemie om op te zetten voor elektroporatie. Steriliseer eerst een 100 millimeter cigar gecoate glazen schaal door autoclaving of weken in 70% ethanol gedurende ongeveer 20 minuten.

Laat het vervolgens drogen op een schone werkbank voor gebruik. Bereid nu DNA voor vanuit een expressievector naar keuze met behulp van een geschikte maxi- of MIDI-prepkit. De expressievectoren die in dit protocol worden gebruikt, zijn een H een expressieconstruct en een neuro D een expressieconstruct.

En de uiteindelijke concentratie van DNA moet minimaal één microgram per microliter zijn in steriele DNA RNA's vrije water om DNA elektro te bedienen in de enische cochleaire uitleg. Voeg 10 microliters plasma-DNA-oplossing toe aan een verse 100 millimeter cigar gecoate schaal. Breng vervolgens een volledig gedissekteerde cochleaire uitleg over in de DNA-oplossing met het luminale oppervlak van het epitheel naar boven.

Kanteel de cochlea lichtjes zodat deze loodrecht staat op het vlak van de schaal. Plaats vervolgens de negatieve elektrode-paddle richting het sensorische epitheel en de positieve elektrode-paddle naast de basis van de cochlea met behulp van de elektro-ator. Lever negen tot tien pulsen van 24 millivolt met een duur van 30 milliseconden.

Voeg vervolgens 100 microliters warm cultuurmedium toe aan de geëlektrorateerde cochlea. Herhaal de procedures voor alle cochleaire uitleg en voor het DNA van alle genen van belang voordat de geëlektrorateerde cochlea wordt overgebracht naar de met basement-membraanmatrix gecoate schaal voor platering. Kweek vervolgens alle geëlektrorateerde cochlea's in een gehumidificeerde incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedur