Name: Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer de cultuur van embryonale muizen cochleaire explantaten en genoverdracht via elektroporatie. Deze methode maakt gedetailleerde studies van cochleaire ontwikkeling en genexpressie in het binnenoor mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Bradley Schulte bedanken voor zijn opmerkingen over dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie R00 (5R00DC010220). Dit project werd uitgevoerd in een gerenoveerd laboratoriumruimte ondersteund door subsidie C06RR014516.

OPMERKING: Alle protocollen waarbij levende dieren moeten worden beoordeeld en door een Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd en moet volg officieel goedgekeurde methoden voor de verzorging en het gebruik van de proefdieren. Alle secties worden uitgevoerd met steriele techniek op een schone laminaire stroming bank. Handschoenen en een masker desgewenst worden gedragen tijdens deze procedure. 1. Dissectie van de embryonale Mouse Inner Ear <ol><li> Instellen voor orgaan van Corti explantkweken: <ol><li> Steriliseer de laminaire stroming weefselkweek kap instelling door UV licht gedurende ongeveer 30 minuten en desinfecteren van het oppervlak met 70% ethanol voorafgaand aan gebruik. Bovendien steriliseren alle dissectie instrumenten, waaronder fijne dissectie instrumenten en Sylgard beklede schalen voor embryo dissectie via autoclaaf of door onderdompeling in 70% ethanol gedurende ten minste 20 minuten voor gebruik. Giet 70% ethanol en laat de gerechten en instrumenten aan de lucht drogen op een schone laminaire stroming clean bench voor gebruik. </li><li> Bereid steriele Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) / (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) (HEPES) mengsel door toevoeging van 10% van 10x HBSS en 0,5% HEPES en de pH op ongeveer 7,2 en filter steriliseren eindoplossing en bewaar bij 4 ° C. Voeren alle dissecties in gekoeld HBSS / HEPES oplossing voor het weefsel tijdens de gehele procedure beter te bewaren. </li><li> Coat glazen bodem gerechten met basaalmembraan matrix door toevoeging van 5 ml koude (4 ° C) steriele Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) met 300 ul aliquot van basaalmembraan matrix in een steriele 15 ml polypropyleen buis. Meng door vortexen inhoud en voeg 150 ul van de basaalmembraan matrix-DMEM mengsel aan het midden van elke kweekschaal, dat voordien de gehele kweekputje aanwezig in het midden van de schaal. Dek de gerechten en op te slaan in een 37 ° C incubator voor ten minste 45 minuten vóór gebruik. </li><li> Giet 4-5 ml gekoeld HBSS in three steriele polystyreen petrischalen en laat sloot in de kap. </li><li> Bereid kweekmedium in een steriele 15 ml polypropyleen buis door toevoeging van 9 ml DMEM, 100 pl N2 supplementen, 10 g / ml Cipro en 1 ml FBS. </li></ol></li><li> Isolatie van embryo: OPMERKING: In deze procedure voor het kweken van cochleaire explants uit embryonale muizen, oogst innerlijke oren uit embryonale dag (E) 13 rotsbeenderen met de dag na de bevruchting wordt beschouwd als E1 9. Het protocol kan ook gebruikt worden met embryonale muis binnenoren beginnen vanaf E12 tot E18. <ol><li> Euthanaseren een getimede-zwangere muis met CO 2 en offeren van dieren door cervicale dislocatie of passend goedgekeurde protocollen. Voeren euthanization weg van laminaire stroming weefselkweek kap om de steriliteit in de weefselkweek kamer te behouden. </li><li> Plaats geëuthanaseerd muis op papier handdoek met de buik naar boven en desinfecteren buik met 70% ethanol. </li><li> Open de buikholte door grijpen huidmet gebogen tang met één hand en gesneden opperhuid en de spieren langs de middellijn met een schaar met behulp van een andere hand. Maak twee loodrecht snijdt aan beide zijden en trek de baarmoeder voorzichtig door het optillen van bilaterale baarmoederhoorns met een pincet en maak het van onderaf bindweefsel met een schaar. </li><li> Plaats de embryonale ketting in een petrischaaltje met gekoelde dissectie oplossing (HBSS / HEPES mengsel) en transfer naar het laminaire stroming schone werkbank. </li><li> Verwijder embryo voorzichtig uit placenta en plaats ze in een van de steriele platen met dissectie oplossing. Als de oplossing blijkt bloedige, verhuizen ze naar een nieuwe petrischaal. LET OP: Op dit punt, kan embryo&#39;s worden opgevoerd met behulp van een Theiler enscenering gids. </li><li> Onthoofden embryo door knijpen in de nek met een paar schone tang of schaar en plaats de kop in een verse petrischaal met gekoelde dissectie oplossing. </li></ol></li><li> Dissectie van de innerlijke oren: <ol><li> Plaats one embryo hoofd in een steriele Sylgard schotel met koud dissectie </li><li> oplossing. Werken onder een dissectie microscoop bij een vergroting van ~ 1,6X, immobiliseren het embryo hoofd door het plaatsen Minutien kunnen rond of dichterbij oog (Figuur 1A). </li><li> Met behulp van twee paren van een steriel pincet voorzichtig de huid te verwijderen en het openstellen van de schedel op de dorsale zijde over de middellijn (Figuur 1B). Verwijder hersenen uit schedelholte en innerlijke oren zich binnen rotsbeenderen kunnen worden geïdentificeerd in dit stadium (figuur 1C, D). De voering van het bloedvat, dat gewoonlijk aanwezig rond het binnenoor kan worden gebruikt als een landmark voor het identificeren van het binnenoor in dit stadium (figuur 1D). </li><li> Prepareer het binnenoor van de temporale bot door het plaatsen van de tang onder het weefsel en isoleren van het binnenoor van de basis van de schedel en overbrengen in een nieuw schaaltje met koud ontleden oplossing (Figuur 1E, F). </li></ol></li></ol> 2. Generatie van het Orgaan van Corti explantkweken Opmerking: In dit stadium van ontwikkeling, het weefsel kraakbeen en kan gemakkelijk worden ontleed met behulp van een tang. <ol><li> Orient het binnenoor, zodat ventrale zijde naar boven is gericht (Figuur 2A) en het stabiliseren van het binnenoor door voorzichtig het plaatsen van de scherpe einde van Minutien pinnen via het evenwichtsorgaan gedeelte van het binnenoor (Figuur 2B). </li><li> Met behulp van ultrafijne tang opengesneden de bovenliggende kraakbeen door het maken van een incisie met behulp van het ene uiteinde van een tang in de buurt van het ovale venster en verwijder voorzichtig het kraakbeen van het slakkenhuis (figuur 2C). Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat forceps niet te diep worden ingebracht in het kraakbeen bovenliggende kraakbeen soms versmolten met de cochleaire kanaal waarbij het nuttig gesloten tang om kraakbeen los van de onderliggende cochleaire kanaal door schrapen onder de sppervlakte van het kraakbeen. In dit stadium van ontwikkeling, de cochleaire spiraal slechts driekwart omwenteling lengte. </li><li> Vervolgens blootstellen het sensorische epitheel door het plaatsen van de tang op het gewenste gebied van de cochleaire kanaal, ofwel de base of op zijn apex en zachtjes te trekken uit het dak van de cochlea (figuur 2D). OPMERKING: Het dak van het slakkenhuis moet volledig worden geschrapt omdat zij de zintuiglijke epitheel de analyse belemmeren kan maskeren. Opmerking: Deze procedure moet voorzichtig worden uitgevoerd zoals het is gemakkelijk om de sensorische epitheel scheuren. </li><li> Als laatste stap, verwijder voorzichtig het onderliggende bindweefsel van de blootgestelde sensorische epitheel, zodat de basis van de cochleaire explant is over het algemeen vlak. </li><li> Isoleer de ontleed slakkenhuis van het vestibulair gedeelte van het binnenoor behulp van een tang. Dit kan worden uitgevoerd voor of na stap 2.4 (figuur 2E). </li><li> Breng de ontleed cochleair zintuiglijke epitheel in een kelder membrane-matrix gecoate cultuur goed met behulp van een 1,5 mm steriele scooper (figuur 2F). </li><li> Plaats de cochleaire explantatie de luminale oppervlak van het epitheel naar boven en zuig de basaalmembraan matrix-DMEM oplossing zorgvuldig plat het weefsel en vervangen door 150 ul vers kweekmedium door voorzichtig toevoegen van de schotel. Men dient ervoor te zorgen dat elk explantaat goed hecht aan de beklede glazen dekglaasje en niet drijvend in het kweekmedium. Zorg ervoor dat de punt van de tang wordt gewezen terwijl aandient door op het glas goed te voorkomen dat schade aan het cochleair explant. </li><li> Zacht overdracht de kweekschaal in een steriele 150 mm kweekschaal en in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende de gewenste tijdsperiode, gewoonlijk 3-6 dagen in vitro (DIV). Na 1 DIV, onderzoekt de culturen onder een dissectiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het cochleair explant goed heeft gehandeld op grond van de cultuur schotel. </li><li> Na incubation in vitro gewenste tijdsduur worden de kweken verwerkt voor immunohistochemie. OPMERKING: De explantkweken meestal geïncubeerd 6 DIV dat gelijkwaardig is aan ontwikkelingsfase, P0. Na incubatie in vitro kweken kunnen worden verwerkt voor toepassingen later als immunohistochemie (Figuur 3B), RT-PCR, in situ hybridisatie en / of Western blot. </li></ol> 3. elektroporatie gemedieerde genoverdracht <ol><li> Instellen voor elektroporatie: <ol><li> Steriliseren een 100 mm Sylgard gecoate glazen schaal autoclaaf of onderdompelen in 70% ethanol gedurende 20 minuten en laat aan de lucht drogen op een schone werkbank voor gebruik. </li><li> Bereid DNA van een expressievector keuze met behulp van geschikte maxi- of midi-prep kits. De expressie vectoren die in dit protocol zijn pIRES2-Atoh1.EGFP en pCLIG-NeuroD1.EGFP. De eindconcentratie van DNA moet ten minste 1 ug / ul in steriele DNA /RNase-vrij water. </li></ol></li><li> Electroporating DNA in embryonale cochleaire explants: <ol><li> Voeg 10 ul van plasmide-DNA-oplossing een nieuwe 100 mm Sylgard gecoate schaal en breng een volledig ontleed cochleair explantaat (verkregen uit stap 2.5) in de DNA-oplossing. </li><li> Met luminale oppervlak van het epitheel naar boven kantelen van de cochlea licht zodat het loodrecht op het vlak van de schaal. </li><li> Elektrode schoepen aan beide zijden van de cochlea met negatieve peddel (kathode) naar de sensorische epitheel en de positieve peddel (anode) aangrenzend aan de basis van de cochlea. OPMERKING: Aangezien DNA negatief geladen, migreert van negatief naar positief elektrode en door het plaatsen van de kathode uiteinde van de sonde naast het sensorische epitheel; het DNA zal vooral gaan door het oppervlak van het sensorische epitheel. </li><li> Met behulp van electroporator, leveren 9 tot 10 pulsen van 24 mV, 30 msec pulsduur met het voetpedaal schakelaar op tHij electroporator en voeg 100 pl warm kweekmedium de geëlektroporeerd slakkenhuis. </li><li> Herhaal de stappen 3.2.1-4 voor alle cochleair explants en voor DNA van alle genen van belang en de overdracht van de geëlectroporeerd cochleae in het basaal membraan-matrix gecoate schotel voor plating (stap 2.7). Cultuur alle geëlektroporeerd cochleae in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator voor de gewenste tijdsduur die vervolgens worden verwerkt voor immunocytochemie. OPMERKING: Het slakkenhuis van een hele nest van CD1 muis (ongeveer 8-12 pups) kunnen worden geïsoleerd, gemicrodissecteerde, geëlectroporeerd en vergulde in &lt;4 uur. </li></ol></li></ol> 4. Analyse van Cochlear explantkweken OPMERKING: De kweken worden gewoonlijk gedurende 6 DIV dat gelijkwaardig is aan ontwikkelingsfase, P0. Na incubatie in vitro, worden de kweken gefixeerd en verwerkt voor immunocytochemie. <ol><li> Na de gewenste lengte van incubation verwijderen kweekmedium en snel spoel de cochleaire explantaat in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd in 4% paraformaldehyde (bereid in PBS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur. </li><li> Was het fixeermiddel door toevoeging van PBS en spoelen met PBS driemaal gedurende 15 min. </li><li> Permeabilize met PBS-T (PBS + 0,5% Tween) gedurende 30 minuten voor het blokkeren met PBS-T met 10% geit serum. </li><li> Incubeer in primaire antilichaam oplossing die primair antilichaam in PBS-T met 1% geit serum overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de cochlea driemaal bij kamertemperatuur met PBS-T 15 minuten elk voor het toevoegen van geschikte Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen. </li><li> Sinds het cochleair explant is gekweekt op glazen dekglaasje kan individueel worden behandeld door het isoleren van het dekglaasje van de schotel en montage op een dia. Dit kan worden bereikt door het weken de kweekschaal in OS30 oplosmiddel gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Met behulp van de steriele scheermesje, los het dekglaasje van het dish en monteren op een glijbaan en visualiseren onder een tl-microscoop. </li></ol>

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+development+of+the+organ+of+Corti+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Organotypic development of the organ of Corti in culture.</a> J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes1+is+a+negative+regulator+of+inner+ear+hair+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation.</a> Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).</li>
<li>Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+regulates+development+of+the+sensory+epithelium+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea.</a> Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).</li>
<li>Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+differentiation+and+DNA+binding+%28Ids%29+regulate+Math1+and+hair+cell+formation+during+the+development+of+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti.</a> J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).</li>
<li>Dabdoub, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+signaling+in+prosensory+domain+specification+and+subsequent+hair+cell+differentiation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).</li>
<li>Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hey2+regulation+by+FGF+provides+a+Notch-independent+mechanism+of+maintaining+pillar+cell+fate+in+the+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti.</a> Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).</li>
<li>Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+induces+neuronal+formation+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea.</a> J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press. San Diego. (1995).</li>
<li>Sher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+and+postnatal+development+of+the+inner+ear+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).</li>
<li>Torres, M., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+vertebrate+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The development of the vertebrate inner ear.</a> Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).</li>
<li>Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+inner+ear+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of inner ear induction.</a> Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).</li>
<li>Puligilla, C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+world%E2%80%99s+best+hearing+aid%3B+regulation+of+cell+fate+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea.</a> Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).</li>
<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).</li>
<li>Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-mediated+gene+transfer+to+study+the+molecular+physiology+of+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).</li>
<li>Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+hair+cells+and+support+cells+of+the+murine+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea.</a> Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn gedeclareerd.

Alle cellen in het membraneuze labyrint van de muis binnenoor zoals zintuiglijke, nonsensory en de spiraal ganglion neuronen zijn alle afgeleid van placodally afgeleide otocyst gelegen naast de achterhersenen van het ectoderm, rond E8 10-14. Op E11, het ventrale gebied van de otocyst uitstrekt tot de cochleaire ductus en als ontwikkeling gaat, een groep van epitheelcellen in de cochlea, en in andere gebieden van de otocyst, worden gespecificeerd als prosensory pleisters die vervolgens tot geeft verschillende ...

Het orgaan van Corti bij zoogdieren bestaat uit een mozaïek van gespecialiseerde celtypen, waaronder twee soorten mechanosensorische haarcellen, evenals ten minste vier soorten niet-sensorische ondersteunende cellen, waardoor het een ideaal modelsysteem is om normale cellulaire processen zoals proliferatie, lotspecificatie, differentiatie en patterning te bestuderen. Bovendien is de normale ontwikkeling van deze verschillende celtypen essentieel voor een normale gehoorfunctie. Daarom is het van cruciaal belang om de factoren, zowel moleculair als cellulair, die hun ontwikkeling reguleren te begrijpen. Desondanks vormt de kleine omvang van de muizencochlea en zijn ontoegankelijkheid een bijzondere uitdaging voor genexpressiestudies. Bovendien vinden de meeste van de gebeurtenissen met betrekking tot celbestemmingsspecificatie en patterning plaats tijdens embryonale perioden en zijn meestal voor de geboorte voltooid. Daarom is identificatie en karakterisering van signaalgebeurtenissen tijdens embryonale perioden essentieel om inzicht te krijgen in de moleculaire basis van cochleaire morfogenese.
Hier demonstreren we een methode om intacte cochlea in vitro te kweken uit embryonale muizen binnenoren. De redenering achter het gebruik van deze techniek is dat gekweekte cochleae hun moleculaire en morfologische kenmerken behouden, waardoor ze een waardevol model bieden voor het onderzoeken van potentiële kandidaatgenen en het onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij cochleaire morfogenese. Hoewel transgene muizen kunnen worden gebruikt voor genexpressiestudies, is een in vitro systeem vaak nodig voor het monitoren van specifieke genfuncties. Bovendien kunnen cochleaire culturen worden opgezet van transgene muizenembryo's, zodat hun in vitro ontwikkeling en reactie op verschillende oplosbare factoren en antagonisten kunnen worden bestudeerd. Hoewel embryo's op dag 13 (E13) worden gebruikt in dit protocol, kunnen culturen van E12 of E14 tot vroege postnatale binnenoren vergelijkbare resultaten opleveren.
We presenteren ook een genoverdrachttechniek in gekweekte embryonale cochleaire explantaten met behulp van vierkantsgolfelektroporatie. Na de isolatie van de cochleaire explantaten kan elektroporatie worden gebruikt om DNA-plasmiden van gen(en) van belang in individuele cellen binnen de cochleaire ductus te laten uitdrukken. Deze techniek dient als een complementaire aanpak voor studies die gebruikmaken van transgene muizen om inzicht te krijgen in de moleculaire paden die ten grondslag liggen aan het cellulaire fenotype. Door deze methode van genoverdracht wordt een verscheidenheid aan epitheelceltypen binnen de embryonale cochlea getransfecteerd, waardoor verlies- en winst-van-functie-analyses op het niveau van een enkele cel mogelijk worden. Bovendien kunnen elektrofysiologische studies ook worden uitgevoerd in cochleaire explantaatculturen8. Deze methode van in vitro elektroporatie is relatief eenvoudig en rechttoe rechtaan, en gecombineerd met minimale schade aan het weefsel, heeft dit geleid tot een snelle uitbreiding van deze techniek.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin hydrochloride</td><td>Cellgro</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>Glas schaal 60 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23062-6015/23064-6015</td><td></td></tr><tr><td>Glas schaal 100 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10015/23062-10015</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Pulsgenerator</td><td>Protech International Inc</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>Kweekschalen met glazen bodem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Kweekschaal, 60 x 15 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel kweekschalen</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>OS-30</td><td>Dow Corning</td><td>4021768</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Conische buizen, 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Myosine 6</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6791</td><td></td></tr><tr><td>Myosine 7a</td><td>Proteus Biosciences Inc</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>TuJ1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td></td></tr></tbody></table>

cultuur van embryonale mouse cochlear explantaten en gene transfer door elektroporatie

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditieve haarcellen in het muizenorgaan van Corti detecteren en verzenden geluidsinformatie naar het centrale zenuwstelsel. De mechanosensorische haarcellen zijn uitgelijnd in één rij binnenste haarcellen en drie rijen buitenste haarcellen die zich uitstrekken langs de basale naar apicale as van de cochlea. De explantaatkweektechniek die hier wordt beschreven, biedt een efficiënte methode om cochleaire explantaten van het embryonale muizenbinnenoor te isoleren en te onderhouden. Bovendien lijken de morfologie en moleculaire kenmerken van sensorische haarcellen en niet-sensorische ondersteunende cellen binnen de cochleaire explantaatkweek op die in vivo waargenomen worden en kunnen worden bestudeerd binnen hun intrinsieke cellulaire omgeving. De cochleaire explantaten kunnen dienen als belangrijke experimentele hulpmiddelen voor de identificatie en karakterisering van moleculaire en genetische paden die betrokken zijn bij cellulaire specificatie en patroonvorming. Hoewel transgene muismodellen een effectieve benadering bieden voor genexpressiestudies, sterft een aanzienlijk aantal muismutanten tijdens de embryonale ontwikkeling, waardoor de analyse en interpretatie van ontwikkelingsfenotypen wordt belemmerd. Het orgaan van Corti van mutante muizen die vóór de geboorte sterven, kan worden gekweekt zodat hun in vitro ontwikkeling en reacties op verschillende factoren kunnen worden geanalyseerd. Bovendien beschrijven we een techniek voor het elektroporeren van embryonale cochleaire explantaten ex vivo die kan worden gebruikt om specifiek gen(en) te onderdrukken of overexpressie te veroorzaken en hun mogelijke endogene functie te analyseren en te testen of een specifiek genproduct noodzakelijk of voldoende is in een bepaalde context om de ontwikkeling van het zoogdiercochleair apparaat te beïnvloeden1-8.

Wij beschrijven een methode om het slakkenhuis te isoleren uit embryonale binnenoren en door middel van microdissectie het sensorische epitheel bloot te leggen. Eenmaal gedisseceerd kan het worden uitgeplaat en gekweekt als een intacte cochleaire duct (Figuur 3) en geanalyseerd worden via immunohistochemie. De gekweekte cochleaire explantaten vormen een nuttige assay om het effect van verschillende oplosbare factoren en farmacologische geneesmiddelen op de cochleaire ontwikkeling te onderzoeken. Na de di...

We presenteren een methode die de isolatie en kweek van cochleaire explantaten van het binnenoor van embryonale muizen beschrijft. We demonstreren ook een methode voor genoverdracht naar cochleaire explantaten via vierkantgolfelektroporatie. De in vitro explantaatkweek gekoppeld aan de genoverdrachtstechniek stelt onderzoekers in staat om de effecten van het veranderen van genexpressie tijdens de ontwikkeling te bestuderen.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Het doel van deze procedure is om muis-embryonale, cochleaire exvivo-cellen te kweken en elektro te bedienen. Om verschillende aspecten van cochleaire ontwikkeling te bestuderen, inclusief morfogenese, differentiatie en groei-evenementen, wordt dit bereikt door eerst de kop te verkrijgen van een embryonale muis op dag 13. Vervolgens worden de binnenoren blootgesteld door de hersenen te verwijderen en deze geïsoleerd van het zich ontwikkelende temporale bot door ze los te maken van de basis van de schedel.Verwijder vervolgens het overliggende kraakbeen en open de cochleaire ductus om het sensorische epitheel van de cochlea te verkrijgen. De laatste stap is om de gedissekteerde cochlea te kweken met of zonder elektroporatie gedurende maximaal één week. Uiteindelijk kunnen de implantaten worden geanalyseerd voor levende celbeeldvorming of gefixeerd immunokleuring en geanalyseerd door confocale beeldvorming, De cultivering van muis-embryonaal.Cochleaire uitleg biedt een uitstekend systeem om verschillende aspecten van organogenese te bestuderen, zoals proliferatie, sulfaatspecificatie en polariteit in de zich ontwikkelende cochlea en hoe deze gebeurtenissen bijdragen aan groei en differentiatie. Dus deze techniek maakt het mogelijk om farmacologische manipulaties uit te voeren en genfuncties ex vivo te monitoren. En dus deze techniek gekoppeld aan de genoverdracht via elektroporatie, zou men de expressie van het gen van belang kunnen veranderen en de functie ervan op een enkele celniveau kunnen monitoren.Om deze procedure te beginnen, plaats een E 13 muis-embryo-kop in een steriele sogar-schaal met koud dissectief oplossing. Onder een dissectief microscoop, immobiliseer de embryo-kop door minutie-pennen rond het ooggebied te plaatsen. Gebruik vervolgens twee paar steriele pincetten om voorzichtig de huid te verwijderen en open de schedel aan de dorsale kant langs de middenlijn.Verwijder daarna de hersenen uit de craniumholte. De binnenoren die zich in de temporale botten bevinden, kunnen worden geïdentificeerd door de bekleding van het bloedvat eromheen. Vervolgens dissecteren de binnenoren van de temporale botten door de pincetten onder het weefsel te plaatsen en de binnenoor van de basis van de schedel te isoleren.Breng vervolgens de gedissekteerde binnenoren over naar een nieuwe schaal met koud dissectief oplossing. Orienteer nu het binnenoor zodat de ventrale zijde omhoog wijst. Stabiliseer het binnenoor door voorzichtig het scherpe uiteinde van de minuchin-pennen door de vestibulaire portie te steken.Gebruik ultrafijne pincetten om het overliggende kraakbeen open te snijden door een incisie te maken nabij het ovale venster. Zorg ervoor dat de pincetten niet te diep in het kraakbeen worden ingebracht, omdat overliggend kraakbeen soms is versmolten met de cochleaire ductus. Verwijder vervolgens voorzichtig het kraakbeen van de cochlea.Stel vervolgens het sensorische epitheel bloot door de pincetten bij de basis of bij de apex van de cochleaire ductus te plaatsen en voorzichtig het dak van de cochlea omhoog te trekken. Als laatste stap, verwijder voorzichtig het onderliggende bindweefsel van het blootgestelde sensorische epitheel zodat de basis van de cochleaire uitleg vlak is. Isoleer vervolgens de gedissekteerde cochlea van de vestibulaire portie van het binnenoor.Breng het gedissekteerde sensorische epitheel van de cochlea over in de basement-membraanmatrix Gecoate cultuurput met behulp van een steriele lepel van 1,5 millimeter als verdere reiniging nodig is om extra weefsel te verwijderen, dit kan in dit stadium worden uitgevoerd. Orienteer vervolgens de cochleaire uitleg met het luminale oppervlak van het epitheel naar boven. Aspireer de basement-membraanmatrix DMEM-oplossing om het weefsel voorzichtig te vlakken en voeg voorzichtig 150 microliters vers cultuurmedium toe aan de schaal.Zorg ervoor dat elke x uitleg goed hecht aan de gecoate glazen dekplaat en niet drijft in het cultuurmedium. Breng vervolgens de micro-dissekteerde cochlea voorzichtig over in een steriele 150 millimeter-cultuurschaal en plaats deze in een weefselkweekincubator. Een 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende drie tot zes DIV.Na 1D IV. Onderzoek de cultuur onder een dissectief microscoop om er zeker van te zijn dat de cochleaire uitleg goed hecht aan de kweekschaal. Ga dan door met het incuberen van de cultuur in vivo voor de gewenste tijdsperiode voordat deze wordt verwerkt voor immunohistochemie om op te zetten voor elektroporatie. Steriliseer eerst een 100 millimeter cigar gecoate glazen schaal door autoclaving of weken in 70% ethanol gedurende ongeveer 20 minuten.Laat het vervolgens drogen op een schone werkbank voor gebruik. Bereid nu DNA voor vanuit een expressievector naar keuze met behulp van een geschikte maxi- of MIDI-prepkit. De expressievectoren die in dit protocol worden gebruikt, zijn een H een expressieconstruct en een neuro D een expressieconstruct.En de uiteindelijke concentratie van DNA moet minimaal één microgram per microliter zijn in steriele DNA RNA's vrije water om DNA elektro te bedienen in de enische cochleaire uitleg. Voeg 10 microliters plasma-DNA-oplossing toe aan een verse 100 millimeter cigar gecoate schaal. Breng vervolgens een volledig gedissekteerde cochleaire uitleg over in de DNA-oplossing met het luminale oppervlak van het epitheel naar boven.Kanteel de cochlea lichtjes zodat deze loodrecht staat op het vlak van de schaal. Plaats vervolgens de negatieve elektrode-paddle richting het sensorische epitheel en de positieve elektrode-paddle naast de basis van de cochlea met behulp van de elektro-ator. Lever negen tot tien pulsen van 24 millivolt met een duur van 30 milliseconden.Voeg vervolgens 100 microliters warm cultuurmedium toe aan de geëlektrorateerde cochlea. Herhaal de procedures voor alle cochleaire uitleg en voor het DNA van alle genen van belang voordat de geëlektrorateerde cochlea wordt overgebracht naar de met basement-membraanmatrix gecoate schaal voor platering. Kweek vervolgens alle geëlektrorateerde cochlea's in een gehumidificeerde incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedur

culture-embryonic-mouse-cochlear-explants-gene-transfer

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC)...

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Deze procedure beschrijft een methode voor de isolatie en de cultuur van het muriene orgaan van Corti, met of zonder de spiraal limbus en spiraal ganglion neuronen. We tonen ook aan een methode voor de expressie van een exogeen reportergen in het orgaan van Corti explant door elektroporatie.

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren...

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

Live beeldvorming van de embryonale zoogdieren slakkenhuis is uitdagend omdat de ontwikkelingsprocessen bij de hand werken op een tijdelijke helling van meer dan tien dagen. Hier presenteren we een methode voor het kweken en dan het afbeelden embryonale cochleair explant weefsel afkomstig van een fluorescerende reporter muis over vijf dagen.

Langdurige Time Lapse Imaging van Muis Cochlear Explantaten

We demonstreren een methode voor het enten van gekweekte cellen in specifieke delen van vroege muis-embryo's om hun in vivo potentieel te bepalen. We introduceren ook een geoptimaliseerde elektroporatiemethode die glazen capillairen van bekende diameter gebruikt, waardoor de nauwkeurige levering van exogeen DNA in een paar cellen in de embryo's mogelijk wordt.

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

Het gehoororgaan is betrokken bij het gehoor. Hier presenteren we een aangepaste in ovo micro-elektroporatiemethode, geoptimaliseerd voor het bestuderen van de proliferatie en differentiatie van auditieve stamcellen in het zich ontwikkelende gehoororgaan van de kip.

Gene Transfer naar de kip gehoororgaan door<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elektroporatie

Het doel van dit protocol is om de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten aan te tonen. De techniek kan gebruikt worden als een in vitro screening tool bij het horen onderzoek.

Neonatale Murine Cochlear Explantietechniek als een<em&gt; In Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Het huidige protocol is een update van eerdere protocollen en bevat relatief eenvoudige benaderingen voor het kweken van hoogwaardige cochleaire explantaten. Dit zorgt voor betrouwbare data-acquisitie en beeldvorming met hoge resolutie in levende en vaste cellen. Dit protocol ondersteunt de voortdurende trend om binnenoorcellen te bestuderen.

Volledige neonatale cochleaire explantaten als een in vitro model

Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.

Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen

Leer de cultuur van embryonale muizen cochleaire explantaten en genoverdracht via elektroporatie. Deze methode maakt gedetailleerde studies van cochleaire ontwikkeling en genexpressie in het binnenoor mogelijk.

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Meer video's verkennen