Name: Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer de IMIT-methode voor niet-invasieve intratracheale toediening van bacteriën in muizenlongen. Deze techniek biedt nauwkeurige, reproduceerbare levering voor respiratoir onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn dankbaar voor de steun van de Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller en Jennifer Kraenzle) en de Microbiology (Daniel Cramer en Julie Sotsky) Kernfaciliteiten. Dit werk werd ondersteund door financiering van de NIH (HHSN272201000033I naar M.B.L en J.M.W.).

OPMERKING: Alle van de hier beschreven procedures werden beoordeeld en door de Universiteit van Louisville Institutional Biosafety Comité (protocol # 13-056) en Institutional Animal Care en gebruik Comite (protocol # 13-064) goedgekeurd. 1. Bereiding van Dye <ol><li> Verdund 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS en filter steriliseren met een 0,45 uM spuitfilter. </li></ol> 2. Voorbereiding van Pseudomonas aeruginosa Cultuur <ol><li> 15 uur voor de instillatie, te enten 3 ml bouillon cultuur met een enkele bacteriële kolonie. </li><li> Groeien de cultuur 15 uur bij 37 ° C op een schudapparaat (200 rpm). </li><li> Centrifuge 1 ml van de cultuur in een 1,5 ml microfugebuis 12.000 xg gedurende 30 sec. </li><li> Verwijder het medium en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS. </li><li> Verdun een hoeveelheid van de bacteriële voorraad suspensie 1:10 in PBS en meet de OD 600 van de verdunde bacteriële suspensie aan het bepalenbacteriële concentratie. </li><li> Verdun de bacteriële stock suspensie in PBS om de gewenste concentratie van bacterieel inoculum, met een slagvolume van 50 pi voor IMIT inoculatie. </li></ol> 3. IMIT Blaasinstillatie <ol><li> Plaats een groep muizen in isofluraananesthesie inductie kamer en verdoven met behulp van een 2 - 3% isofluraan / zuurstof mengsel. </li><li> Op het eerste begin van de sedatie, scruff de muis, die de muis rechtop en beheren 10 pl van een 2% lidocaïne-oplossing via een maagsonde naald naar de achterkant van de keel en laat de oplossing tot de epiglottis afvoer. Zet de muis aan de anesthesie kamer. <ol><li> Laat minimaal 5 min tot de lidocaïne steeds alle effect als lokaal anestheticum nemen. </li></ol></li><li> Wanneer muizen gewenste niveau van sedatie hebben bereikt (ademhaling van ~ 60 bpm), vermindering van de isofluraan 2% tot sedatie te handhaven. </li><li> Preload kleurstof of bacteriële inoculum in een 250 ul gasdichteprecisie spuit fit met een 22 G lange stompe naald. <ol><li> Eerste tekenen van 150 gl lucht, gemeten door de Teflon zuiger van de spuit. Vervolgens stellen 50 pi inoculum door het bevorderen van de Teflon zuiger van de 150 pi markering op de 200 ul markering op de spuit lichaam. OPMERKING: Wanneer het monster wordt uitgestoten in een geïntubeerde muis, de 50 ul schorsing wordt eerst door een 150 ul luchtkussen waarop de entstof in de hele long zal verdelen afgeleverd, gevolgd. </li></ol></li><li> Verwijder een muis uit de inductie kamer en leg rugligging op een intubatie platform. Zet de muis op het platform door het inhaken van de snijtanden met een O-ring bevestigd aan klittenband, en het veiligstellen van het klittenband aan het platform. Breng de muis naar een hoek van 45 °. </li><li> Met behulp van een micro katoen applicator, trek de tong met een rollende beweging, met behulp van de dominante hand. </li><li> Met de nondominant de hand, gebruik dan een operationele otoscoop fit met een intubatie specula zowel maintain tong terugtrekken en visualiseren van de glottis. </li><li> Met de dominante hand, gebruik dan een voerdraad schroefdraad door een 20 G katheter om de muis te intuberen, het plaatsen van de katheter naar een 10 mm diep in de muis luchtpijp (catheter is fit met een siliconen huls met 10 mm van de blootgestelde katheter). Verwijder de otoscoop / specula. </li><li> Controleer of de muis correct is geïntubeerd door het veiligstellen van de katheter met de nondominant hand terwijl kort aanbrengen van een Luer aangesloten lengte van 1/16 &quot;, doorzichtige slang met een gekleurde kleurstof. OPMERKING: De kleurstof migreren snel heen en weer in reactie op de ademhaling. </li><li> Ga niet verder met de volgende stappen als bevestiging van intubatie is niet vastgesteld op dit punt. Als de poging tot intubatie mislukt, reset de katheter en voerdraad voor een extra poging tot intubatie. LET OP: Het is niet aan te raden om meer dan twee intubations van een muis in een sessie proberen zonder dat trauma aan de muis. </li><li> Blijvenzet de katheter met de nondominant hand, terwijl het plaatsen van de precisie spuit / stompe naald met de vloeibare suspensie / luchtkussen. </li><li> Verdeel de vloeistof / lucht direct in de longen in één vloeiende beweging en onmiddellijk te verwijderen van de naald / katheter uit de muis. </li><li> Zet de muis om een ​​kooi en laat het herstel van de anesthesie. </li></ol> 4. Karakterisering van IMT Delivery <ol><li> Na IMIT instillatie, euthanaseren de muis door CO 2 verstikking op een passend tijdstip na de inenting. </li><li> Zet het inslapen muis op een dissectie boord en genieten van de borst en de buik met 70% EtOH met behulp van een spuitfles. </li><li> Als evalueren uitkering van een beeldvormend middel door de longen, de longen verwijderd uit het dier met behulp van steriele techniek en toont de longen als geschikt voor beeldvorming. OPMERKING:. De longen kunnen worden voorbereid op extra histologische kleuringen door passende fixatie of cryopreservatie &lt;/ Li&gt; <li> Als de evaluatie van de bacteriële last van geïnfecteerde longweefsel, verwijder de longen van het dier met behulp van steriele techniek. Plaats longen in een steriele, vooraf gewogen 1 oz sample zakje. Weeg en noteer het gewicht van het monster zak + longen. <ol><li> Voeg 1 ml steriel 1x PBS aan elk monster zak + weefsels. Verzegelt sample bag. </li><li> Homogeniseren weefsels door zacht glooiende een 25 ml serologische pipet over het monster zak + weefsel. </li><li> Genereer seriële verdunningen van de longweefselhomogenaat in steriele PBS en plaat op agar plaat (LB, of in voorkomend geval aan de bacteriesoorten wordt bestudeerd): <ol><li> Voer een zesvoudige seriële verdunning in een U-bodem 96 wells plaat met multichannel pipet Plaat uit drievoudige monsters van multichannel op de agarplaat. </li></ol></li><li> Incubeer agarplaten gedurende de nacht bij 37 ° C en opsommen kolonievormende eenheden de volgende dag. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reznik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+function+of+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and function of the upper respiratory tract.</a> Environ Health Perspect. 85, 171-176 (1990).</li>
<li>Hoyt, R. F. J., Hawkins, J. V., St. Clair, M. B., Kennet, M. B., et al. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoyt%2C+RFJ+%22The+Mouse+in+Biomedical+Research%2C+Volume+2%2C+Second+Edition%3A+Diseases+%28American+College+of+Laboratory+Animal+Medicine%29%22">The Mouse in Biomedical Research, Volume 2, Second Edition: Diseases (American College of Laboratory Animal Medicine)</a>. Fox, J. G. 2, Academic Press. 23-90 (2007).</li>
<li>Visweswaraiah, A., Novotny, L. A., Hjemdahl-Monsen, E. J., Bakaletz, L. O., Thanavala, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+tissue+distribution+of+marker+dye+following+intranasal+delivery+in+mice+and+chinchillas%3A+a+multifactorial+analysis+of+parameters+affecting+nasal+retention%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Tracking the tissue distribution of marker dye following intranasal delivery in mice and chinchillas: a multifactorial analysis of parameters affecting nasal retention.</a> Vaccine. 20, 3209-3220 (2002).</li>
<li>Eyles, J. E., Spiers, I. D., Williamson, E. D., Alpar, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+radioactivity+following+intranasal+administration+of+radioactive+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of radioactivity following intranasal administration of radioactive microspheres.</a> J Pharm Pharmacol. 53, 601-607 (2001).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 282, 833-839 (2002).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Lathem, W. W., Crosby, S. D., Miller, V. L., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+primary+pneumonic+plague%3A+a+mouse+model+of+infection%2C+pathology%2C+and+bacterial+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17786-17791 (2005).</li>
<li>Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+diagnostic+imaging+to+characterize+altered+respiratory+tract+colonization+by+the+Burkholderia+pseudomallei+capsule+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent diagnostic imaging to characterize altered respiratory tract colonization by the Burkholderia pseudomallei capsule mutant.</a> Front Microbiol. 2, 133(2011).</li>
<li>Gutierrez, M., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+Secretion+System+cluster+3+is+a+critical+virulence+determinant+for+lung-specific+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Submitted%22%5BJournal%5D)">Type 3 Secretion System cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis.</a> Submitted. , (2014).</li>
<li>Fodah, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS ONE. In revision, (2014).</li>
<li>Soto-Montenegro, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+airway+distribution+of+transnasal+solutions+in+mice+by+PET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of airway distribution of transnasal solutions in mice by PET/CT imaging.</a> Mol Imaging Biol. 11, 263-268 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

IMIT instillatie biedt belangrijke verbeteringen in bestaande respiratoire ziektemodellen in de mogelijkheid om reproduceerbaar druppelen reagentia direct in de longen. Het is een snelle aanpak heeft een ideale locatie voor een team van twee onderzoekers, waarvan één beheert de logistiek van de anesthesie en het kooien, en de andere die de IMIT techniek uitvoert. Grote studies kunnen worden uitgevoerd met IMIT met een gemiddelde tijd door 2-3 minuten per muis. Omdat de aanpak maakt gebruik van isofluraan als verdovingsmiddel, muizen herstellen zich snel uit de narcose, het reduceren van de houderij tijd bewaken dieren door herstel. De technisch meest uitdagende aspect van de IMIT methode is de eerste stap van intuberen muizen. Individuen leren IMIT voeren zijn in staat om zich te concentreren op deze eerste stap van de katheter en ervoor te zorgen dat intubatie is bereikt door de visuele bevestiging van kleurstof beweging. Het voordeel van de aanpak is dat long-specific instillatie wordt gewaarborgd door het gebruik van de bevestiging van de intubatie, waarbij het vertrouwen van zowel de nieuwe onderzoeker en de expert probeert een moeilijke dier intuberen verhoogt. De belangrijkste elementen van het optimaliseren van de kans op een succesvolle intubatie zijn: i) het bereiken van een diepe sedatie om voldoende werktijd mogelijk maken, ii) de correcte plaatsing van de specula in de mond om een ​​goede visualisatie van de epiglottis toelaten, iii) goede diepte plaatsing van de specula zodat de tong blijft ingetrokken tijdens de gehele procedure, en iv) het gebruik van de kantelende platform om de handen van de onderzoeker te ondersteunen, zodat de procedure ontspannen en met een gestage aanpak wordt uitgevoerd. Een van de beperkingen van de IMIT procedure is gerelateerd aan de frequentie van IMIT instillatie evenementen. Vanwege de mogelijke trauma geassocieerd met een afgebroken intubatie wordt afgeraden meer dan twee intubatie pogingen worden uitgevoerd in een enkele sessie (maximaal twee missers). IMITheeft uitstekende mogelijkheden in zijn vermogen om te worden gebruikt voor therapeutica geven in de longen van muizen kunnen echter therapeutische strategieën die gebruik maken van zeer frequent afgifte van reagens in de longen te niet geschikt voor IMIT. Het kan zijn dat IMIT dagelijks kan worden gebruikt om reagentia in een muizen long leveren zonder significante trauma, maar alleen wanneer deze door een goed geschoolde onderzoeker, aangezien de meeste trauma geassocieerd met intubatie wordt verondersteld geassocieerd te zijn met een gemiste intubatie gebeurtenis . Dergelijke hoogfrequente IMIT moet met de lokale dierenartsen en IACUC worden besproken. Een extra potentiële beperking van IMIT is de grootte van de muis die wordt geïntubeerd. De hierboven beschreven IMIT procedure werd ontwikkeld bij muizen van ongeveer 17-22 g, waarin een 20 G catheter bleek een geschikte grootte voor de trachea van muizen in deze grootte zijn. Grotere katheters zijn met succes gebruikt bij oudere muizen; de initiële ontwikkeling van IMIT made gebruik van een 18 G katheter in BALB / c-muizen die&gt; 20 g. Belangrijk, indien alternatieve kathetergrootten gebruikt, stompe naalden worden geproduceerd die het lumen van de katheter te passen en zijn getrimd tot een lengte die slechts 1 mm uitstrekt voorbij de kathetertip. Intubatie muizen kleiner dan 17 gram zijn mogelijk, maar wordt niet aanbevolen vanwege de vereiste kennis en zou het gebruik van kleinere katheters en specula zijn dan hierboven beschreven, vereisen. Wij hebben IMIT voor de levering van verschillende respiratoire pathogenen naast P. aeruginosa, waaronder B. pseudomallei 9 en Klebsiella pneumoniae 10. De IMIT model heeft belangrijke vorderingen gemaakt om onze studies van B. pseudomallei respiratoire aandoeningen, hebben geïdentificeerd dat intranasale inenting zorgt voor een vroeg, URT-gerelateerde morbiditeit van muizen in plaats van de systemische ziekte eindpunt waargenomen in menselijke ziekte 9. B. pseudomallei is een Tier 1 Select middel van biodefense invloed, en als zodanig, ademhalingsaandoeningen modellen worden ontwikkeld voor aërosol welke modellen een potentiële biodefense gerelateerd route van binnenkomst voor weaponized ziekteverwekkers. Omdat de huidige aerosol modellen leiden tot infectie van zowel de URT en LRT, hetzelfde potentieel vroege morbiditeit fenotypes we hebben geïdentificeerd voor de intranasale model van B. pseudomallei respiratoire ziekte kan van toepassing zijn op de spuitbus model. Een toekomstige aanpassing van de IMIT model zou een intubatie-gemedieerde aerosolafgifte (IMAD), waarin muizen geïntubeerd voor target aerosol levering alleen in de long. Mechanische ventilatoren zijn beschikking isofluraan anesthesie, die kan worden aangepast om een ​​aërosol, in plaats van op vloeistof gebaseerde, pathogeen uitdaging leveren handhaven. IMIT werd oorspronkelijk ontwikkeld als een benadering van de afgifte van bacteriën aan de longen te optimaliseren, maar ook toepassing voor de afgifte van andere reagentia in de muizenlong. Zoals dishierboven besproken, intranasale afgifte van verbindingen in muizen resulteert in een laag rendement, zeer variabele afgifte van reagentia in het doelorgaan van de long. Intranasale afgifte van Positron Emissie Tomografie (PET) beeldvorming reagentia met het muize longen leverde een 40% rendement aflevering 11, terwijl wij hebben aangetoond dat IMIT een uitstekend alternatief voor andere long levering zal met&gt; 98% levering werkzaamheid en multilobar distributie. Deze verbetering van gerichte afgifte aan de long heeft de potentie om de reproduceerbaarheid van therapeutische afgifte verhogen voor de behandeling van longziekte. IMIT kon op dezelfde voordelen bieden aan de studies van: i) de impact van het milieu pulmonale irriterende stoffen, ii) longkanker fenotypische studies, iii) long-specifieke siRNA knock-down.

Muizen werden gebruikt voor het modelleren talrijke menselijke ziekten manifestaties, waaronder een groot aantal ademhalingsziekten. Surrogaat ziekte modellen zijn vaak niet in staat om alle aspecten van een gemodelleerde ziekte recapituleren, meestal als gevolg van belangrijke fysiologische of immuun verschillen in de twee gastheer modellen. Aldus is een doel van verbetering modelsystemen is benaderingen waarmee surrogaten nader spiegel een ziekteproces of gastheer respons zoals waargenomen in het oorspronkelijke hostsysteem ontwikkelen. Er zijn verschillende belangrijke fysiologische verschillen tussen muizen en mensen in het mechanisme waarmee zij lucht inspiratie. Inbegrepen in deze verschillen zijn significant ratiometrisch verschillen in grootte tussen de URT en LRT. Er wordt geschat dat muizen bezitten&gt; 100 maal de URT oppervlak ten opzichte mens, genormaliseerd tegen de totale longcapaciteit 1,2. Dus de neusschelpen van de muis mogelijk verdergaande filtering van ingeademde lucht een veel grotere snelheid van breathi vergemakkelijkenng, die een significante invloed op studies van longontsteking of infectie van de neusholte speelt een belangrijke rol in de progressie van de ziekte. Verscheidene verschillende benaderingen zijn gebruikt om bacteriën te druppelen in de longen van muizen mensachtige ademhalingsziekte bestuderen. De meest voorkomende van deze benaderingen is intranasale inoculatie, waarbij een vloeibare suspensie wordt aangebracht op één of beide neusgaten van een muis. Terwijl relatief eenvoudige, restricties zoals indruppelen aantal en het soort anesthesie kan de efficiëntie van instillatie invloed in de LRT via intranasale inoculatie 3-5. Specifiek, Miller et al. hebben aangetoond dat intranasale instillatie van Francisella tularensis in volumes van minder dan 50 pl niet tot instillatie van de bacteriën in de LRT 6. Zij merkte verder op betere LRT instillatie bij het gebruik van geïnhaleerde isofluraan in tegenstelling tot geïnjecteerde ketamine / xylazine voor anesthesie. Echter, onze ervarine met Yersinia pestis intranasale inoculatie geeft consistenter inoculatie kan worden bereikt met ketamine / xylazine vergeleken met isofluraan (MBL, ongepubliceerde gegevens). Deze verschillen kunnen worden toegeschreven aan pathogeen gebruikt of om de variatie in het laboratorium procedures, maar belangrijker nog wijzen op de potentiële variabiliteit in deze techniek. Bovendien longen kort na intranasale indruppeling blijkt dat een relatief lage percentage van de oorspronkelijke bacteriële inoculum de longen bereikt geoogst (bij Y. pestis, werden slechts 10% teruggevonden 1 uur na instillatie 7), wat suggereert dat een groot aantal bacteriën kon worden behouden in het URT (of ingeslikt in het maag-darmkanaal). In sommige ziektemodellen kan dit aanzienlijke afzetting van bacteriën op de URT mucosa ons begrip van de ziekteprogressie verwarren indien het organisme kan koloniseren de murine neusholte niet overeenkomstig de menselijke ziekte. Bijvoorbeeld met behulp van in vivo &lt;/ Em&gt; beeldvorming, is waargenomen dat Burkholderia pseudomallei, die de menselijke URT niet koloniseren, veroorzaakt een overweldigend opportunistische infectie van de muizen neusholte bij aflevering via de intranasale instillatie methode 8. Andere werkwijzen voor het indruppelen van bacteriën in de longen van muizen werden ook gebruikt in onderzoek naar infectieuze ziekten. In vergelijking met intranasale instillatie deze methoden vaak meer technische expertise en / of dure apparatuur vereisen zonder het elimineren van de mogelijkheid van infectie inleiding op verschillende plaatsen (bijvoorbeeld aerosol [URT en LRT]; transoral [spijsverteringskanaal en LRT] en chirurgische intratracheale [LRT en bloedstroom]). Gezien de mogelijke complicaties die kunnen worden geassocieerd met secundaire locaties van de infectie, zochten we naar een intratracheaal aanpak die de URT omzeilt en levert ziekteverwekker direct in de longen van verdoofde muizen ontwikkelen, maar beperkt ook onbedoelde inoculation in de bloedstroom of maagdarmkanaal. Om dit te bereiken, werd-intubatie gemedieerde intratracheale (IMIT) instillatie ontwikkeld als een niet-chirurgische procedure die LRT instillatie van inoculum garandeert door het opnemen van een tussenstap om de juiste plaatsing van de katheter te controleren voorafgaand aan de instillatie. Deze werkwijze wordt beschreven met kleurstof instillatie visueel tonen brede spreiding van het inoculum gehele long en P. aeruginosa instillatie de zeer effectieve levering (&gt; 98% van het inoculum) van deze methode om de long te tonen. Belangrijk, terwijl oorspronkelijk ontwikkeld voor bacteriële levering IMIT biedt ook een doeltreffend middel om: i) instillatie van verschillende moleculen voor de studie van andere respiratoire ziektemodellen, ii) long-specifieke therapeutische aflevering, en iii) elementaire longfunctie studies, inclusief gerichte siRNA afgifte aan de long.

<table><tbody><tr><td>Rodent, Tilting WorkStand</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>Basis dient te worden losgekoppeld bij het werken in een BSC</td></tr><tr><td>Operating Otoscope Head</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoscope 3.5 V Li Battery</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Incisor Loops</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Cotton fine tip applicator</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>Gebruikt voor het terugtrekken van de tong</td></tr><tr><td>I.V. Catheter, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Optioneel: voorzien van een siliconenhuls met 10 mm blootgestelde katheteroppervlakte</td></tr><tr><td>Gas tight syringe, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Gebruikt voor het afleveren van vloeibaar inoculum door IMIT</td></tr><tr><td>Blunt Needle, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Trimmen tot de lengte om 1 mm uit te steken van de 20 G katheter</td></tr><tr><td>Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF.50</td><td>Snijden tot 6" lengte: gebruikt als gidsdraad voor intubatie</td></tr><tr><td>Tuberculin syringe, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Assembleren met fiber optic draad als gidsdraad</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing, 1/16"</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer 1/16" barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer 1/16" barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH van lidocaïne in oplossing op 2%(w/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Sample bag, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plate, sterile</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

intubatie-gemedieerde intratracheaal (imit) blaasinstillatie: een niet-invasieve, lung-specifieke delivery system

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Ademhalingsaandoeningen studies betrekken doorgaans het gebruik van muismodellen als surrogaat-systemen. Er zijn echter significante fysiologische verschillen tussen de muizen en humane luchtwegen, vooral in de bovenste luchtwegen (URT). In sommige modellen kunnen deze verschillen in de muizen neusholte een significante invloed op het ziekteverloop en de presentatie in de onderste luchtwegen (LRT) hebben bij het gebruik van intranasale instillatie technieken, mogelijk beperken van het nut van het muismodel voor deze ziekten te bestuderen. Om deze redenen zou het voordelig zijn om een ​​techniek voor bacteriën direct druppelen in de muis longen om LRT ziekte te bestuderen in de afwezigheid van betrokkenheid van de URT ontwikkelen. We hebben deze long specifieke levering techniek intubatie-gemedieerde intratracheale (IMIT) instillatie genoemd. Deze invasieve techniek minimaliseert het potentieel voor instillatie in de bloedbaan, die kunnen optreden gedurende meer invasieve traditionale chirurgische intratracheale infectie benaderingen, en beperkt de mogelijkheid van incidentele spijsverteringskanaal levering. IMIT Twee stappen waarbij muizen eerst worden geïntubeerd met een tussenstap juiste katheter waarborgen in de luchtpijp, gevolgd door insertie van een stompe naald in de katheter te bemiddelen directe levering van bacteriën in de longen. Deze aanpak vergemakkelijkt een&gt; 98% effectiviteit van de levering in de longen met een uitstekende verdeling van de reagens in de hele long. Aldus IMIT vertegenwoordigt een nieuwe benadering voor LRT ziekte en therapeutische afgifte onderzoek direct in de longen, het verbeteren van het vermogen om muizen als surrogaten menselijke respiratoire ziekte te bestuderen. Bovendien is de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van dit afgiftesysteem maakt het ook vatbaar Good Laboratory Practice Standards (GLP), en levering van uiteenlopende reagentia die hoog rendement afgifte aan de longen vereisen.

Om de verspreiding van ingeprent materiaal via IMIT methode visualiseren, 50 ui 0,1% Coomassie Brilliant Blue-kleurstof werd gedruppeld in de longen van verdoofde muizen. De muis werd onmiddellijk gedood en de longen werden verwijderd door steriele necropsie. Figuur 1 toont dat de kleurstof werd geleverd aan alle lobben van de longen. Om de hoeveelheid bacteriën geleverd aan de longen via de IMIT methode drie groepen muizen (n = 3) gedruppeld met drie verschillende concentraties P. bepalen aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7 en 1,21 x 10 6 kolonievormende eenheden [CFU] per 50 pi). Onmiddellijk na IMIT instillatie werden de muizen gedood, de longen verwijderd en bacteriële aantallen werden geteld en vergeleken met de inocula (figuur 2). Levering van het inoculum is zeer efficiënt via deze methode, met&gt; 98% van het inoculum gewonnen uit de longen van ingeprentdieren. Bovendien IMIT instillatie was zeer reproduceerbaar ongeacht de concentratie van het inoculum (R2 = 0,9951). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Figuur 1: IMIT instillatie verdeelt inoculum gedurende de longen De longen van muizen ingeprent met 50 ul van 0,1% Coomassie Brilliant Blue tonen blauwe kleurstof verspreid in alle lobben.. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Figuur 2:. IMIT instillatie van bacteriën in de longen van muizen gedruppeld met P. aeruginosa en het aantal bacteriën gedruppeld in de longen (log10 CFU - teruggewonnen) werden vergeleken met de geschatte inoculum (log10 CFU - geleverd). Elke cirkel de CFU / long van individuele muizen (n = 3 voor elkebacteriële dosis).

Intratracheale intubatie-gemedieerde (IMIT) instillatie van reagentia is een uitstekend invasieve methode voor het bestuderen ademhalingsziekte, alsmede een werkwijze voor het indruppelen therapeutische reagentia direct in de longen. Het is een snelle en zeer reproduceerbare werkwijze die geschikt is voor preklinische proeven.

Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Het algemene doel van deze procedure is om op niet-invasieve wijze bacteriën rechtstreeks in de longen van muizen af te geven. Dit wordt bereikt door eerst een 150 microliter luchtkussen in een gasdichte spuit te laden, gevolgd door 50 microliter van de bereide bacteriesuspensie. In de tweede stap wordt een geanestheseerde muis geïntubeerd met een 20 gauge katheter met behulp van een gidsdraad om de plaatsing te vergemakkelijken.Nadat het succes van de intubatie is bevestigd met behulp van een eenvoudige flowmeter, wordt het bacteriële inoculum via de katheter rechtstreeks in de long geïnjecteerd met een 22 gauge lange stompe naald. Uiteindelijk kan intubatie-gemedieerde intratracheale of geïmiteerde inoculatie worden gebruikt om aandoeningen van de lagere luchtwegen bij muizen te bestuderen, waarbij de gelijktijdige betrokkenheid van de bovenste luchtwegen wordt vermeden. Het belangrijkste voordeel van imit ten opzichte van intranasale inoculatiemethoden is dat deze techniek een nauwkeurige en reproduceerbare afgifte van een inoculum rechtstreeks in de longen mogelijk maakt.Omdat IIT een niet-chirurgische techniek is, vermindert het ook het risico op complicaties die gepaard gaan met chirurgische intratracheale procedures. Hoewel deze methode een betrouwbaar mechanisme kan bieden om bacteriën naar de longen te brengen om de pathogenese te bestuderen, kan IMA ook worden toegepast op de afgifte van andere reagentia, zoals omgevingsstoffen om longschade te bestuderen, doelgerichte afgifte van therapeutica voor behandeling en afgifte van beeldvormingssondes of SRNA om de basisbiologie van de long te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de intubatiestap, omdat de stap een zorgvuldige positionering van het dier en de autoscoop voor het inbrengen van de gidsdraad vereist.Visuele demonstratie van deze methode is nuttig, omdat de eerste plaatsing van de gidsdraad in de luchtpijp conceptueel moeilijk te beschrijven is voor nieuwe onderzoekers. 15 uur voorafgaand aan de installatie, inoculeert u drie milliliter broedcultuur met een enkele bacteriekolonie en kweekt u de cultuur bij 37 graden Celsius en een schudder op 200 RPM. Na 15 uur, centrifugeert u één milliliter van de cellen in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en suspendeert u de palat in één milliliter PBS.Vervolgens meet u een een-op-tien-verdunning van de bacteriële voorraadsuspensie op een OD 600 om de bacterieconcentratie te bepalen. Verdun vervolgens de bacteriecellen in PBS tot de gewenste concentratie bacteriën per 50 microliter inoculum. Voor de IIT-installatie worden muizen voorbereid voor IIT door een 2% lidocaine-oplossing toe te dienen aan een licht verdoofde muis via een sondeerbuis.Keer terug naar anesthesie terwijl de lidocaine effect heeft. Trek nu 150 microliter lucht in een 250 microliter gastype resectiespuit, uitgerust met een 22 gauge lange stompe naald. Schuif vervolgens de Teflon-plunger vanaf het 150 microliter-merk tot het 200 microliter-merk op de spuitlichaam om 50 microliter van de bacteriële inoculum op te nemen wanneer de spuit is geladen.LA, een sedatie-muis ligt op een intubatieplatform waarbij het dier wordt vastgezet door de snijtanden aan een ring die is bevestigd aan een Velcro-strip die is verbonden met het platform. Breng de muis op een 45-graden helling en gebruik vervolgens een micro-cotton applicator om de tong met een rollende beweging met de dominante hand terug te trekken. Gebruik vervolgens met de niet-dominante hand een operatie-otoscoop voorzien van een intubatie-spicula om zowel de tongretractie te handhaven als de epiglottis te visualiseren.Houd vervolgens een gidsdraad die door een 20 gauge katheter in de dominante hand is geregen, en intubeer de muis tot een diepte van 10 millimeter in de luchtpijp en verwijder de otoscoop. Bevestig de katheter met de niet-dominante hand. Bevestig vervolgens kort een lokaas verbonden lengte van één zestiende heldere buis met een gekleurde kleurstof aan de katheter.De kleurstof moet snel heen en weer bewegen als reactie op de ademhaling van het dier wanneer het dier met succes is geïntubeerd. Breng de 22 gauge stompe naald in de katheter en breng het inoculum in één vloeibare beweging rechtstreeks in de long. Verwijder vervolgens onmiddellijk de naald en katheter van het dier en plaats de muis terug in zijn kooi met bewaking totdat het dier volledig is hersteld van de anesthesie.Om de bacteriële belasting van het geïnfecteerde longweefsel te evalueren, verwijdert u de longen met behulp van een steriele techniek en plaatst u het weefsel in een steriele vooraf gewogen een ounce monsterzak. Na het wegen van de monsterzak plus de longen, voegt u één milliliter steriele PBS toe aan het weefsel en verkoopt u de monsterzak opnieuw. Rol vervolgens voorzichtig een 25 milliliter serologische pipet over de monsterzak om het weefsel te homogeniseren.Verwijder het verbonden weefsel door een steriele polyester wandcursusfilter en behandel het homogenaat met tritton X 100 tot een eindconcentratie van 1% om de bacteriën te bevrijden. Gebruik vervolgens een multikanaals pipet om een zesvoudige seriële verdunning van het homogenaat uit te voeren in een UBO 96-wellplaat. Gebruik vervolgens een acht-kanaals multikanaals om het homogenaat driemaal 10 microliter aliquots op een LBA-agarplaat te plateren.Ten slotte incubeert u de platen een nacht bij 37 graden Celsius en telt u de kolonievormende eenheden de volgende dag. De afgifte van de bacteriën is zeer efficiënt via deze methode met meer dan 98%van het pseudomonas aerogen-inoculum dat is hersteld uit de longen van de ingebrachte dieren in dit representatieve experiment. Bovendien is de IIT-installatie zeer reproduceerbaar, ongeacht de concentratie van het toegediende inoculum.Om de verdeling van het ingebrachte materiaal via de IIT-methode te visualiseren, kunnen 50 microliter van 0,1% Kumasi briljante blauwe kleurstof in de longen worden gebracht, zoals net voor het inoculum is gedemonstreerd. Let op, de verdeling van de kleurstof naar alle longkwabben. Eenmaal onder de knie

intubation-mediated-intratracheal-imit-instillation-noninvasive-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intratracheale instillaties leveren opgeloste stoffen direct in de longen. Deze procedure richt zich op de levering van de instillate in het distale gebieden van de long, en is daarom vaak opgenomen in studies gericht op het bestuderen van longblaasjes. Wij bieden een uitgebreide survival protocol voor het uitvoeren van intratracheale instillaties bij muizen.

Directe Tracheale Instillatie van opgeloste stoffen in de muis Lung

We illustreren niet-chirurgische levering van testmateriaal in de longen van verdoofde muizen via de luchtpijp. Deze methode laat long blootstelling aan bacteriële en virale pathogenen, cytokines, antistoffen, kralen, chemicaliën of kleurstoffen. We verder beschrijven oogst en verwerking van de longen en longen drainerende lymfeklieren (LDLNs) voor flowcytometrie.

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

This video describes an intrabronchial approach to administer an experimental agent selectively into distal right and left lung. In the featured protocol, we will administer bleomycin intrabronchially into a mouse to obtain a better model for pulmonary fibrosis.

Intrabronchial Delivery: A Technique to Administer an Experimental Agent Selectively Into a Mouse Lung

Het gebruik van een model dat de toestand van longziekten bij mensen nabootst is kritiek voor het bestuderen van de pathofysiologie en / of etiologie van een bepaalde ziekte en ontwikkelen van therapeutische interventie. Hier een niet-invasieve intratracheaal intubatie methode die direct exogene materialen kunnen leveren aan muizenlongen wordt gepresenteerd.

Niet-invasieve Intratracheaal intubatie om te studeren de Pathologie en Fysiologie van Mouse Lung

Dit artikel presenteert een snelle en eenvoudige methode voor het toedienen van bleomycine rechtstreeks in de muis luchtpijp via intubatie. Belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn dat het zeer reproduceerbaar, gemakkelijk onder de knie, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of lange hersteltijden.

Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen

Intratracheal (IT) toediening van experimentele agentia bij muizen resulteert vaak in asymmetrische afgifte aan de distale longen.  In dit rapport beschrijven we een directe intrabronchiale (IB) benadering om elke Long in levende muizen niet-operatief te cannuleren.  Deze aanpak kan worden gebruikt om agenten selectief te beheren tot één Long of kan worden aangepast om de symmetrische agent levering aan beide longen te verbeteren.

Directe Intrabronchiale toediening om de selectieve depositie van de agent binnen de muis Long te verbeteren

Droge poederformuleringen voor inhalatie hebben een groot potentieel bij de behandeling van luchtwegaandoeningen. Voordat men aan menselijke studies begint, is het noodzakelijk om de werkzaamheid van de droge poederformulering in preklinische studies te evalueren. Een eenvoudige en niet-invasieve methode voor de toediening van droog poeder bij muizen via de intratracheale route wordt gepresenteerd.

Intratracheale toediening van droge poederformulering bij muizen

Deze techniek om geneesmiddelen rechtstreeks in de luchtpijp van neonatale knaagdieren in te brengen, is belangrijk bij het bestuderen van de impact van lokaal toegediende geneesmiddelen of biologicals op neonatale longziekten. Bovendien kan deze methode ook worden gebruikt voor het induceren van longletsel in diermodellen.

Een minimaal invasieve methode voor intratracheale instillatie van geneesmiddelen bij neonatale knaagdieren om longziekte te behandelen

Hier stellen we een protocol voor intratracheale lipopolysaccharide (LPS) levering via niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatie. Deze methode minimaliseert het trauma van de chirurgische procedure voor het dier en levert LPS nauwkeurig af aan de luchtpijp en vervolgens aan de longen.

Niet-invasieve intratracheale lipopolysaccharide-instillatie bij muizen

Dit protocol laat zien hoe het optimaal positioneren van een muis en het transoraal inbrengen van een op camera's gebaseerde otoscoop visualisatie van de glottis, snelle intubatie met minimaal weefseltrauma en consistente vloeistofafgifte aan de longen mogelijk maakt.

Verbeterde methodologie voor vloeistofafgifte aan de muizenlong: intubatie met behulp van een consumentenotoscoop

Celtherapie biedt een veelbelovende interventie voor longfibrose door voorlopercellen te gebruiken om beschadigd weefsel te herstellen en de longfunctie te verbeteren. Aangezien beeldvorming een cruciale rol speelt bij het volgen van celintegratie, beschrijven we hierin magnetische beeldvorming-geleide in vivo tracking van celtherapie voor longfibrose in een muismodel.

Beeldgeleide in vivo tracking van getransplanteerde distale longepitheliale voorlopercellen voor longfibrose met behulp van magnetische beeldvorming

Leer de IMIT-methode voor niet-invasieve intratracheale toediening van bacteriën in muizenlongen. Deze techniek biedt nauwkeurige, reproduceerbare levering voor respiratoir onderzoek.

Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System

Meer video's verkennen