Name: Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Leer een protocol voor het detecteren van echte IgE-producerende muizen B-cellen met behulp van trypsinebehandeling en intracellulaire flowcytometrie. Deze methode maakt nauwkeurige analyse van klasse-switch recombinatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DRW wordt ondersteund door NIH subsidies AI089972 en AI113217, en door de Mucosal Immunologie Studies Team, en heeft een Career Award voor Medische Wetenschappers van de Burroughs Wellcome Fonds.

OPMERKING: Alle experimenten hier beschreven waren in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen en door Animal Research Children&#39;s Hospital (BOOG), Boston, Mass goedgekeurd. 1. Bereiding van reagentia <ol><li> 1000x IL-4 Stock: Verdun IL-4 cytokine tot 20 ug / ml in H2O en 0,1% runderserumalbumine (BSA). Verdeel in 200 ul aliquots van 1,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -20 ° C. </li><li> 1000x anti-CD40: verkrijgen van de fabrikant bij 1,0 mg / ml, bewaar bij 4 ° C. </li><li> B-cel stimulatie media: Aan 425 ml van RPMI-1640 medium, voeg 75 ml vers ontdooide foetaal kalfsserum (FCS), 10 ml 1,0 M HEPES-buffer, 5 ml L-glutamine stock, 5 ml penicilline: streptomycine stock, 5 ml Minimum Essential Medium Niet-essentiële aminozuren (MEM-NEAA), en 3,5 pl 2-mercaptoethanol. Blijf media bij 4 ° C gedurende maximaal een week. Voeg IL-4 (20 ng / ml) en anti-CD40 (1,0 ug / ml) onmiddellijk voor gebruikalleen de hoeveelheid dragers die. </li><li> 2% FCS-FACS buffer: Voeg 10 ml FCS tot 490 ml 1x PBS. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> 2x trypsine-EDTA-oplossing Verdun 5 ml van 10x trypsine-EDTA voorraadoplossing (5,0 g trypsine, 2,0 g EDTA per liter) in 20 ml 1X PBS. WINKEL trypsine-EDTA in 2x werken porties bij 4 ° C. Laat opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik. </li><li> Foetaal kalf serum: Bewaar ontdooide FCS bij 4 ° C voor maximaal twee weken. Plaats op ijs 15 min voordat de cytoplasmakleuring procedure. </li><li> Neutraal gebufferde formaline: Bereid een 10% formaline-oplossing (3,7% paraformaldehyde). Formaline is giftig en dus omgaan onder een laboratorium zuurkast tijdens het dragen van de juiste PBM. WINKEL formaline bij kamertemperatuur in een chemisch opslagkast. </li><li> Methanol: Store absolute methanol (100%) bij -20 ° C tot de cellen zijn klaar om te worden gepermeabiliseerde. Merk op dat methanol is brandbaar en moet worden bewaard in een geschikte vriezer. </li></ol> 2.Zuivering en activering van B-cellen <ol><li> Vanuit vers geoogste muis milt, bereiden een celsuspensie door het orgaan druk voorzichtig door een 70 um cel zeef met de plunjer van een injectiespuit 3 ml. In een 15 ml conische centrifugebuis verzamelen cellen in 10 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Decanteer het supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcel lysisbuffer gedurende 5 min. Neutraliseer met 13.5 ml 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. </li><li> (Optioneel) magnetisch gescheiden van de B-cellen met anti-CD45R (B220) -gemerkt korrels, na het MACS zuiveringsprotocol volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Stimuleer gezuiverde B-cellen bij 1,0 x 10 6 cellen / ml in B-cel stimulatie verwarmd medium dat IL-4 (20 ng / ml) en anti-CD40 (1,0 ug / ml) gedurende 5 dagen bij 37 ° C. Begin met 8 ml van de cultuur verdeeld in 2 putjes van een 6-well cultuur plaat (4 per ml). </li><li> Controleer cultuopnieuw dagelijks bij 1,0 x 10 6 cellen / ml te handhaven. Stel de concentratie splitsen in andere putten en verdunnen van de kweek met B-cel stimulatie medium dat vers IL-4 en anti-CD40. </li></ol> 3. trypsinisatie, Fixatie en Permeabilisatie <ol><li> Trypsinisatie <ol><li> Verzamel tot 1,0 x 10 7 van gekweekte cellen in een 15 ml conische buis, centrifuge bij 300 xg gedurende 5 minuten en decanteer het supernatant. </li><li> Was met 10 ml PBS om de resterende eiwit uit de cel collectie media te verwijderen. Herhaal het centrifugeren stap en decanteer de bovenstaande vloeistof. </li><li> Resuspendeer de celpellet in het restvolume na decanteren (ongeveer 100 ui). </li><li> Voeg voorzichtig 800 pi kamertemperatuur 0,1% (2x) trypsine-EDTA op de cellen. Verdeel deze vervolgens in een hoek van 45 ° langs de zijkant van de conische buis. </li><li> Sluit de buis en meng voorzichtig door het kantelen van de buis zodat de vloeistof langs de lengte van de buis 6/5 tijds. Een vezelig, witte neerslag kan ontstaan ​​in de oplossing. Beperk de trypsine tijd om onder een min. </li><li> Blus de trypsine reactie met 1 ml koude FCS. Verdun de FCS onmiddellijk door 10 ml koude PBS. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, decanteer de bovenstaande vloeistof en breng de buizen ijs. </li></ol></li><li> Bevestiging <ol><li> Resuspendeer de cellen in het restvolume na decanteren. Eventueel meenemen volume tot 100 ul met koude PBS. </li><li> In een zuurkast, voeg 800 ul van 10% neutraal gebufferde formaline oplossing voor de cellen en pipet op en neer. De buis verwarmen na toevoeging van formaline. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilisatie <ol><li> Het opzetten van een tafelmodel vortex-mixer op een zacht schudden snelheid. </li><li> Trek 9 ml koude (-20 ° C) methanol in 10 ml serologische pipet. </li><li> Houd de buis met de cellen over de vortexmenger en voorzichtig beginnen ShakinG de cellen. </li><li> Voeg koude methanol aan de buis zodanig valt druppelsgewijs op de cellen terwijl de buis nog schudden zodat de methanol continu mengen. Na de eerste 2 ml methanol de afgifte snelheid kan worden verhoogd tot een langzame stroom. </li><li> Laat de buis zitten op ijs gedurende 30 minuten aan de permeabilisatie voltooien. Als alternatief kunnen de cellen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maximaal een maand. </li></ol></li></ol> 4. Fluorescentie kleuring voor IgG1 en IgE Class Switching <ol><li> Centrifuge monster bij 300 xg gedurende 5 minuten en giet de methanol oplossing. Een witte neerslag kan pellet met de cellen. </li><li> Voeg 10 ml kamertemperatuur 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te wassen. Herhaal een keer. Opmerking: Het wassen van de pellet met kamertemperatuur PBS lost extra neerslag die na stap 4.1 kan vormen. </li><li> Voer een aanvullend wassen met 10 ml van 2% FCS-FACS buffer. </li><li> Verdeel monsters naar een 96 putjes ronde bodemplaaten centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Decanteer supernatant en zet de plaat op het ijs. </li><li> Vlekken in 60 pl 2% FCS-FACS buffer per putje met de volgende verdunningen antilichaam: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100 Anti CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Na 5 min kleuring was de plaat met 150 ul van 2% FCS-FACS buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g. </li><li> Resuspendeer in 400 ul van 2% FCS-FACS buffer en pipet door een 40 pm nylon celzeef in een 5 ml FACS buis. </li></ol> 5. Gebruik de volgende Gating Strategie: <ol><li> Isoleer CD45R (B220) positieve cellen van de stralen lymfocyt populatie op de FSC / SSC grafiek (Figuur 1). </li><li> Uit de B220 positieve cellen, gebruik maken van de IgE en IgG1 perceel aan de desbetreffende populaties te onthullen. </li></ol>

<ol><li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li>
<li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+allergy+and+asthma+today%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li>
<li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li>
<li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li>
<li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li>
<li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+%28Fc+epsilon+RII%2FCD23%29%3A+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li>
<li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li>
<li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li>
<li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li>
<li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S%C2%B5+to+S%CE%B5+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li>
<li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li>
<li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li>
<li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).</li>
<li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+MD.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li>
<li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li>
<li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li>
<li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE%28%2B%29+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li>
<li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE%28%2B%29+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li>
<li>He, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE%2B+B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li>
<li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen gedaan.

Stimulatie van de muis milt B-cellen in cultuur met anti-CD40 en IL-4 zal simuleren T helper type 2 (T H 2) interacties, bemoedigende klasse omschakeling naar IgG1 en IgE 5. B-cellen kunnen worden geactiveerd voor CSR in met de totale splenocyten 12 of gezuiverde milt B-cellen 11. Zoals in het protocol (stap 2.3), B-cel verrijking is optioneel en is ter beoordeling van de onderzoeker als het zou gunstig bepalen. Positieve magnetische scheiding van B-cellen met CD45R (B220) -ge...

Tijdens de zware keten van immunoglobuline (IgH-) klasse switch recombinatie (MVO) in muizen en mensen, de IgH- μ constant gebied exons (Cp) worden geschrapt en vervangen door een van de verschillende sets van downstream constant gebied exons (C H s) (bijv Cv, Ce en Ca), resulterend in een omschakeling van de productie van IgM tot de productie van andere Ig klassen (bijvoorbeeld IgG, IgE of IgA). MVO plaatsvindt binnen schakelaar (S) regio&#39;s, die 1-10 kb sequenties 5 &#39;om elke set van C H s 1 zijn. De Activation-Induced cytidinedeaminase (AID) enzym initieert MVO via cytidine deaminering activiteit. IgE is een belangrijke mediator van allergische aandoeningen 2 en een beter begrip van hoe IgE wordt geproduceerd en gereguleerd kan deuren openen naar nieuwe therapeutische benaderingen van atopische aandoeningen. Bij muizen en mensen, IgE is het meest strak gereguleerd Ig isotype. IgE wordt normaal gedetecteerd in gehalten duizenden times minder dan andere IgH isotypen 3, maar kan sterk worden verhoogd bij ziektetoestanden 4. Echter, CSR IgE is onvolledig begrepen. In vitro activatie van B-cellen met IL-4 in combinatie met ofwel anti-CD40 of LPS induceert CSR zowel IgG1 en IgE 5. Geactiveerde B-cellen brengen de lage affiniteit IgE-receptor FceRII / CD23 2,6, die bindt oplosbaar IgE uitgescheiden in de cultuur na MVO. Dus bij de analyse met flowcytometrie, B cellen met receptor gebonden IgE vlek dezelfde cellen endogeen tot expressie IgE 7b. Hoewel bekend is dat de muis B-cellen brengen lage affiniteit IgG FcγRIIB1 receptor (CD32) 8, in onze ervaring blijkt niet te interfereren met de meting van klasse omschakeling naar IgG1. Echter, bij het meten van IgE omschakelen bij B-celactivering in kweek, niet-specifieke oppervlakte-IgE kan de analyse belemmeren. Gemeenschappelijke kleuringen, niet-IgE tot expressie brengende cellen te kleuren positief voor IgE. Hier geschetst is een strategie die is gebruikt voor CSR assays true-IgE tot expressie B-cellen voeren en sporen van muizen 9-11. Behandeling van geactiveerde B-cellen met trypsine, een gemeenschappelijk laboratorium reagens om eiwitten te verteren, verwijdert zowel cytophylic en membraangebonden oppervlak IgE. Na permeabilisatie en kleuring voor cytoplasmatische IgE onthult dus de ware IgE-producerende cellen.

<table><tbody><tr><td>Anti-Mouse IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>clone R35-72</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Mouse/Rat CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clone HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microbeads&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS purification column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstitueer in water of 0,1% BSA</td></tr><tr><td>Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g Trypsine, 2,0 g EDTA•4 Na per Liter van 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10.000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Red cell lysis buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clone 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Calf Serum</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B cell Stimulation media</td><td></td><td></td><td>B cell stimulatie media bestaat uit RPMI met foetaal kalfsserum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutamine, Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml) en anti-CD40 (1 µg/ml)</td></tr></tbody></table>

detectie van true ige-expressie muis b lineage cellen

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymfocyten immunoglobuline zware keten (IgH) klasse switch recombinatie (CSR) is een werkwijze waarbij aanvankelijk uitgedrukt IgM schakelaars andere IgH isotypen, zoals IgA, IgE en IgG. Meting van IgH CSR in vitro is een belangrijke werkwijze voor de studie van een aantal biologische processen gaande van DNA recombinatie en herstel aspecten van moleculaire en cellulaire immunologie. In vitro CSR bepaling omvat de flowcytometrische meetoppervlak Ig expressie op geactiveerde B-cellen. Hoewel meting van IgA en IgG subklassen is eenvoudig, meting van IgE deze werkwijze problematisch vanwege oplosbaar IgE binding aan FceRII / CD23 op het oppervlak van geactiveerde B-cellen. Hier beschrijven wij een unieke procedure voor nauwkeurige meting van IgE-producerende muizen B-cellen die CSR hebben ondergaan in kweek. De methode is gebaseerd op trypsine gemedieerde klieving van IgE-CD23 complexen aan celoppervlakken, waardoor detectie van IgE-producerende B afkomstcellen door cytoplasmic kleuring. Deze procedure biedt een handige oplossing voor flowcytometrische analyse van MVO aan IgE.

Deze procedure is met succes toegepast om CSR studeren om IgE in muizen B-cellen. Om de efficiëntie te tonen meten CSR, we gestimuleerde muis milt B-cellen met anti-CD40 en IL-4, zoals eerder 11 beschreven. Na vijf dagen stimulering werden de cellen verzameld en verwerkt volgens de hierboven beschreven en gekleurd met fluorescent gelabelde IgM, IgG1, IgE, en B220 (CD45R) antilichamen protocol. Gated op de stralen lymfocyten (figuur 1), een duidelijke populatie van IgE + cellen niet netjes wor...

In vitro analyse van klasse-switch recombinatie bij muizen is uitdagend vanwege cytofiele IgE-moleculen die gebonden zijn aan Fc-receptoren op het oppervlak van B-cellen. We beschrijven een methode voor IgE-detectie door middel van trypsine-gemedieerde splitsing van oppervlakte-gebonden IgE vóór fixatie en permeabilisatie voor cytoplasmatische fluorescentiekleuring.

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om echte IgE-expresserende B-cellen te onderscheiden van B-cellen die andere IgE-isotypen secreteren en IgE secreteren. Tijdens in vitro klasse-switching-assays bindt het aan B-celoppervlak-eiwitten, wat de mogelijkheid om klasse-switching naar IgE te meten, belemmert. Het doel wordt bereikt door eerst receptor-gebonden IgE-moleculen te verwijderen voor analyse door gebruik van trypsine, dat niet specifiek celoppervlak-eiwitten afbreekt terwijl endogeen geproduceerde intracellulaire immunoglobuline-moleculen intact blijven.Ten tweede worden intracellulaire eiwitten blootgesteld door de B-cellen te fixeren met formine en de cellen te permeabiliseren met methanol. Vervolgens worden de cellen gekleurd met fluorescerend gelabelde antilichamen om intracellulaire immunoglobulinen zichtbaar te maken. De resultaten tonen een duidelijke IgE-positieve B-celpopulatie.Als trypsine wordt gebruikt op basis van flowcytometrie-analyse, zijn studies naar IgE-biologie beperkt vanwege de moeilijkheid om IgE-producerende cellen te detecteren. Deze methode biedt een toegankelijke oplossing die laboratoria gemakkelijk kunnen toepassen om ons begrip van dit interessante molecuul te versnellen. Deze techniek is voordeliger dan bestaande methoden om het effect van receptor-gebonden IgE te elimineren.Het is bijvoorbeeld minder kostbaar dan het blokkeren van oppervlakte-IgE met anti-IgE-antilichamen en meer genadig dan een zuurwasbehandeling. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het analyseren van muis B-celklasse, kan switching naar IgE-behandeling met trypsine voorafgaand aan fact-kleuring ook worden toegepast op andere protocollen die verwijdering van oppervlakte-eiwitten vereisen van een vers geoogste muizenmilt. Bereid een eencellig suspensie.Druk voorzichtig het orgaan door een 70 micron celstrainer met behulp van de plunjer van een drie milliliter spuit. Verzamel de cellen in een 15 milliliter conische centrifugeerbuis met 10 milliliter van een XPBS. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 300 Gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Decanteer de supernatant en resuspendeer het pellet in een milliliter rode bloedcel-lyseringsbuffer. Laat de lyseereactie vijf minuten doorgaan voordat u het neutraliseert met 13,5 milliliter van een XPBS. Centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw bij 300 Gs gedurende vijf minuten en resuspendeer het pellet in het resterende volume.Voeg nu warm B-cel-stimulatiemedium met IL vier en anti CD 40 toe aan de cellen. Begin met een acht milliliter cultuur verdeeld in twee putjes van een zes-putjescultuurplaat en stimuleer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende vijf dagen. Controleer de cultuur dagelijks om de cellen op 1 miljoen per milliliter te houden.Pas een concentratie aan door de culturen op te splitsen in andere putjes en te verdunnen met B-cel-stimulatie. Medium bevattende verse IL vier en anti CD 40. Begin met het verzamelen van maximaal 10 miljoen gestimuleerde B-cellen in een 15 milliliter conische buis.Centrifugeer ze vervolgens bij 300 Gs gedurende vijf minuten en decanteer het supernatant om de resterende eiwitten uit het celverzamelmedium te verwijderen. Was de B-cellen met 10 milliliter PBS gevolgd door nog een centrifugatie en decantatie van de snat Na decantatie, resuspendeer het cellenpellet in het resterende volume van ongeveer 100 microliter en voeg voorzichtig 800 microliter kamertemperatuur 0,1% tripsine in EDTA toe. Voeg de oplossing langzaam langs de zijwand van de buis toe.Voeg een helling toe, sluit vervolgens de buis en meng het voorzichtig door de vloeistof langs de lengte van de buis te laten lopen. Vijf of zes keer kan zich binnen een minuut een stroperige witte neerslag vormen in de oplossing. Quench de reactie met één milliliter koud FCS.Bewaar de cellen op ijs. Nu zijn ze nog steeds levend en kunnen ze nieuwe oppervlakte-eiwitten tot expressie brengen. Verdun de FCS onmiddellijk door 10 milliliter koud PBS toe te voegen.Verwijder eventueel drijvend puin met een pipet. Draai de cellen bij vier graden Celsius neer. Decanteer onmiddellijk het snat en resuspendeer de cellen in het resterende volume.Als nodig, breng het volume op tot 100 microliter met koud PBS en ga snel verder in een afzuigingskast bij 800 microliter van 10% neutraal gebufferd formine. Pipet het mengsel op en neer de buis zal beginnen op te warmen. Incubeer de cellen in het fixeermiddel gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Gelijktijdig zet een tafelvortexmixer op een zachte schudsnelheid in en bereid methanol koel tot minuus 20 graden Celsius voor gebruik. Wanneer de cellen klaar zijn met incuberen.Zuig negen milliliter methanol op in een serologische pipet. Ontdoe vervolgens voorzichtig de dop en roer de buis voorzichtig terwijl je methanol druppelsgewijs toevoegt. Na het afvoeren van twee milliliter methanol druppelsgewijs, versnel tot een langzame stroom.Laat de buis nu 30 minuten op ijs staan om de cellen te permeabiliseren. Alternatief kunnen de cellen maximaal een maand worden bewaard bij minuus 20 graden Celsius. Begin de kleurprocedure door de gepermeabiliseerde cellen te centrifugeren en het methanol te decanteren.Een witte neerslag kan samen met de cellen bezinken. Was vervolgens de cellen door 10 milliliter kamertemperatuur een XPBS te mengen, te centrifugeren en te decanteren. Voer deze wasstap twee keer uit.Doe vervolgens een extra wassing met 10 milliliter 2%FCS fax, buffer en resuspendeer. De pellet in het resterende volume gaat verder door de monster in een put van een 96-welspatroon met ronde bodem te laden. Veel monsters worden meestal parallel verwerkt.Laad 20 tot 50 microliter met behulp van een platenspinacentrifuge de cellen bij 300 Gs gedurende vijf minuten. Decanteer vervolgens het snat en zet de plaat op ijs. Kleur nu de cellen in elke put door 60 microliter 2%FCS fax buffer met vier verschillende antilichamen toe te voegen.Laat de cellen vijf minuten in de kleurstof incuberen na de kleurstof. Was de cellen door

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze procedure beschrijft de detectie en isolatie van de muis Th17 leukocyten die actief IL-17 afscheiden na stimulatie.

Detectie en isolatie van levensvatbare muis IL-17-afscheidende T-cellen

Dermatitis herpetiformis (DH) is een chronische inflammatoire aandoening die wordt gekenmerkt door een auto-immune reactie tussen IgA en epidermale transglutaminase (ETG). DH ontwikkelt zich in een heel klein deel van gluten-gevoelige en / of patiënten met coeliakie. De resultaten van deze studie geven aan dat DH ook kunnen ontwikkelen in een resusaap gastheer met symptomen van idiopatic dermatitis.

Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis

This video demonstrates an imaging method to visualize in situ interferon-gamma (IFN-γ) secretion in the mouse spleen. Following bacterial infection and the induction of IFN-γ accumulation inside T cells and natural killer cells, the spleen is harvested from the mouse. Upon obtaining tissue sections, immunostaining is performed to visualize IFN-γ inside the cells.

Assay for the Identification of Interferon-Gamma Secretion in Murine Lymphoid Organs

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

Hier beschrijven we een eenvoudige confocale beeldvormings methode om de in-situ lokalisatie van cellen die het cytokine interferon gamma in Murine secundaire lymfoïde organen afscheidende te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de visualisatie van andere cytokines in diverse weefsels.

Beeldvorming van in situ interferon gamma productie in de muis milt na Listeria monocytogenes infectie

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's), betrokken bij type 2-ontsteking, nemen voornamelijk deel aan de reactie op worminfectie, allergische aandoeningen, metabole homeostase en weefselherstel. In deze studie wordt een procedure aangetoond om ILC2's te isoleren van murine neusslijmvlies en de expressie van CD226 te detecteren.

Isolatie van groep 2 aangeboren lymfoïde cellen van muis neusslijmvlies om de expressie van CD226 te detecteren

Leer een protocol voor het detecteren van echte IgE-producerende muizen B-cellen met behulp van trypsinebehandeling en intracellulaire flowcytometrie. Deze methode maakt nauwkeurige analyse van klasse-switch recombinatie mogelijk.

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

Meer video's verkennen