Name: Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryos met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer eiwitstabiliteit meten in levende zebravisembryo's met fluorescentieverval na fotoconversie. Deze methode bepaalt intracellulaire en extracellulaire halfwaardetijden van fusie-eiwitten in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Jeffrey Farrell, James Gagnon, en Jennifer Bergmann bedanken voor commentaar op het manuscript. KWR werd gesteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program tijdens de ontwikkeling van de FDAP test. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH aan AFS en door subsidies van de Duitse Stichting voor Onderzoek (Emmy Noether Program), het Max Planck Instituut en het Human Frontier Science Program (Career Development Award) naar PM.

1. Het genereren van een photoconvertible Fusion Construct en het injecteren van dechorionated zebravis embryo&#39;s <ol><li> Genereer een functionele construct dat het eiwit van interesse gefuseerd aan een groen naar rood photoconvertible eiwit (zie bespreking), vervolgens in vitro transcriptie capped mRNA genereren coderend voor het fusie-eiwit volgens Muller et al., 2012 19. </li><li> Gebruik pronase de chorions ongeveer 30 zebravis embryo verwijderen aan het ene-cellig stadium. Als alternatief handmatig dechorionate embryo&#39;s met behulp van een tang 28. Opmerking: Embryo&#39;s moeten worden dechorionated voor latere beeldvorming. Desgewenst kan embryo later worden geïnjecteerd door het chorion en dechorionated, vlak voor beeldvorming. <ol><li> Voeg een 5 mg / ml voorraadoplossing van pronase van Streptomyces griseus in standaard zebravis embryo medium 19. Schommel de oplossing voorzichtig bij kamertemperatuur gedurende 10 min om het protease te lossen. Aliquot 2 ml in microcentrifugebuizen en bevriezen bij -20 ° C. </li><li> Overdracht één-cel embryo&#39;s van een glas 5 cm diameter of agarose gecoate plastic petrischaal met ~ 8 ml embryo medium. Voeg 2 ml ontdooide pronase voorraadoplossing om de schotel en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 10 min. </li><li> Vermijd blootstelling van embryo&#39;s aan lucht of plastic, zoals contact met ofwel zal veroorzaken dechorionated embryo&#39;s te scheuren. Vul een 200 ml bekerglas met embryo medium. Breng het embryo aan de beker door het kantelen van de petrischaal terwijl het onder te dompelen in het medium. </li><li> Nadat de embryo&#39;s zich hebben gevestigd op de bodem van de beker, giet het grootste deel van het embryo medium, en giet dan verse embryo medium in de beker. De milde wervelende van het medium gieten in de beker zorgt ervoor dat de embryo&#39;s om hun verzwakte chorions verliezen. </li><li> Herhaal stap 1.2.4. </li></ol></li><li> Breng de dechorionated embryo tot een agarose gecoate injectie schaal 29 met een glazen Pasteur pipet met een gevlamde tip. Vlammendede pipet tip voorkomt dat de scherpe randen van het verwonden van embryo&#39;s. </li><li> Co-injecteren het mRNA en een 3 kDa Alexa488-dextranconjugaat 29,30 (Figuur 1B; zie bespreking voor suggereerde mRNA en Alexa488-dextran bedragen). Injecteer direct in het midden van de cel (niet de dooier) een gelijkmatige verdeling van mRNA en fluorescente kleurstof waarborgen eenmaal splitsing begint. Opmerking: De Alexa488 signaal wordt gebruikt tijdens gegevensanalyse compartimentele maskers te genereren voor het onderscheid tussen intracellulair en extracellulair fluorescentie. </li><li> Transfer geïnjecteerde embryo tot een 1-2%-agarose gecoate putje van een zes-en kunststof schotel gevuld met embryo medium. Incubeer in het donker bij 28 ° C tot embryo&#39;s laat bol stadium 31 (ongeveer 5 uur na de bevruchting) hebben bereikt. Controleer embryo&#39;s om de een tot 2 uur onder een stereomicroscoop en verwijder eventueel vuil gegenereerd door embryo&#39;s die zijn overleden. </li></ol> 2. Montage zebravis embryo&#39;s voor Photoconversion en Imaging op een omgekeerde confocale microscoop <ol><li> Gebruik een stereomicroscoop om 04:59 gezonde embryo&#39;s te identificeren, en gebruik een glas Pasteur pipet met een gevlamde tip om ze van het gerecht te verwijderen. </li><li> Uitwerpen zachtjes de embryo&#39;s in een microcentrifugebuis met ~ 1 ml gesmolten 1% laag smeltpunt agarose in 1x Danieau&#39;s embryo medium (zie Materials List) (Figuur 2A). Opmerking: Agarose moet een temperatuur hebben tussen 40 en 42 ° C; hogere temperaturen kan het embryo beschadigen. </li><li> Trek de embryo&#39;s terug in de pipet samen met enkele agarose. Uitwerpen zachtjes de agarose en embryo&#39;s op de cover glas van een glazen bodem schaal (figuur 2B). Zorg ervoor dat de dikte van het dekglas verenigbaar is met de doelstelling van de confocale microscoop. <ol><li> Hergebruik de glazen pipet indien gewenst. De resterende agarose schoon van de pipet en verstopping snel pipet embryo medium voorkomen en neer.Plaats een 15 ml buis gevuld met ~ 5 ml embryo medium naast de stereomicroscoop voor dit doel. </li></ol></li><li> Met een metalen sonde naar de embryo positioneren zodat de animale pool (blastoderm) naar het dekglas. Werk snel, omdat de agarose zal stollen in 20-30 sec. Gebruik de stereomicroscoop de standpunten van de embryo&#39;s te monitoren en stel zo nodig tot de agarose verhardt. </li><li> Herhaal stap 2,1-2,4 totdat het gewenste aantal embryo is gemonteerd. Opmerking: In een typisch experiment zullen vier agarose druppels met vier of vijf embryo elke passen gemakkelijk op de cover glas. Ongeveer 16 embryo&#39;s kunnen worden afgebeeld tijdens een ideaal experiment (figuur 2C). </li><li> Wanneer de agar is gestold, vul de glazen bodem schotel met 1x Danieau&#39;s embryo medium. </li></ol> 3. Photoconverting en meten van de Daling van de photoconverted Signal Een 25X of 40X water objectieve is geschikt voor de grootte en de brekingsindex van zebravis embryo. Het beste is om immersie olie te gebruiken met dezelfde brekingsindex als water dan de werkelijke water, omdat water verdampt tijdens de vijf uur durende experiment. Zorg ervoor dat de immersie olie is ontworpen om gebruikt te worden met een water (geen olie) doelstelling. <ol><li> Zet een grote druppel immersie olie op de doelstelling dat de oliefilm tussen de objectieve en dekglas niet zal breken in de fase verplaatst naar verschillende posities embryo tijdens de beeldvorming. Veilig plaats de glazen bodem schotel op het podium, zodat het gerecht niet zal verschuiven wanneer het podium beweegt. Indien mogelijk een verwarmde fase bij 28 ° C, de optimale temperatuur voor ontwikkeling van de zebravis. </li><li> Definieer de positie van elk embryo&#39;s in de confocale microscoop softwarepakket. Stel de z-diepte voor elk embryo, en proberen om ruwweg richten hetzelfde vlak in elk embryo. Opmerking: ongeveer 30 micrometer van het dier paal is een good diepte omdat op deze diepte de omhullende laag van het embryo kan worden vermeden, wordt beeldgebied gemaximaliseerd en lichtverstrooiing minimaal is. Een enkele optische schijfje met een dikte van ~ 3,3 micrometer voldoende gegevens; er is geen noodzaak om een ​​z-stack (zie hoofdstuk 5) verwerven. </li><li> Verzamel twee signalen tijdens het experiment de &quot;green&quot; signaal van de Alexa488-dextran conjugaat die wordt gebruikt tijdens gegevensanalyse extracellulaire en intracellulaire fluorescentie en de &quot;rode&quot; signaal van het fusie-eiwit isolaat na het photoconverted. <ol><li> Excite Alexa488 met behulp van een 488 nm laser, en het verzamelen van uitgezonden fluorescentie tussen ~ 500 en 540 nm. Let op: Na photoconversion, veel groen-op-rood photoconvertible eiwitten (bijvoorbeeld Dendra2) kan enthousiast met een 543 nm laser zijn en uitstralen fluorescentie tussen ~ 550 en 650 nm. Pas als nodig is gebaseerd op de photoconvertible eiwit gebruikt. </li></ol></li><li> Acquire &quot;pre-photoconversion&quot;Beelden, en elk van de eerder gedefinieerde posities (van stap 3.2) met de juiste beeldvorming voorwaarden configureren van software van de confocale microscoop om het elke 10 of 20 minuten voor een vijf uur durende tijdsverloop (zie hoofdstuk 5 en Bespreking). </li><li> Om het fusie-eiwit photoconvert, overschakelen naar een 10x objectief en bloot groepen van embryo&#39;s aan UV-licht van een kwik booglamp met een ~ 300-400 nm excitatie filter bij 100% output voor 2 min. Verschuiven de focus langs de z-as naar uniforme photoconversion (zie hoofdstuk 5) te bevorderen. Zorg ervoor dat de immersie olie druipt niet op de 10x objectief tijdens photoconversion. Opmerking: De verschuiving van de focus tijdens photoconversion kon worden geautomatiseerd om de variatie tussen onderzoekers te vermijden. </li><li> Ga terug naar de 25X of 40X objectief onmiddellijk na photoconversion. Zorg ervoor dat de eerder gedefinieerde posities uit stap 3.2 zijn nog nauwkeurig. Als de schaal verschoven tijdens photoconversie, opnieuw definiëren van de posities van de embryo&#39;s. <ol><li> Start het programma gemaakt in stap 3.4 en laat beeldvorming te blijven gedurende 5 uur. Noteer de tijd tussen fotoconversie en de start van beeldvorming voor elk embryo. </li></ol></li><li> Af en toe controleren op het experiment. Toezicht op het niveau van Danieau&#39;s medium en voeg zo nodig meer. Start de software als het tot stilstand is gekomen. </li><li> Om de achtergrond fluorescentie waarden die zullen worden tijdens data-analyse te schatten asymptoot van een exponentieel afnemende model te bepalen, omvatten enkele embryo&#39;s die zijn geïnjecteerd met Alexa488-dextran maar niet mRNA in het experiment. Om het instrument ruis, die ook zullen worden tijdens gegevensanalyse bepalen verwerven afbeelding in afwezigheid van een monster. </li></ol> 4. Het analyseren van de gegevens met behulp PyFDAP <ol><li> Visueel te inspecteren het tijdsverloop datasets van elk embryo. Gooi datasets uit embryo&#39;s die stierven tijdens IMAGing, die aanzienlijk verschoven, dat zeer lage niveaus van photoconverted signaal hebben, of dat de regio&#39;s van de cellen die ongebruikelijk kijken en zijn gestopt met bewegen en te delen (typisch van gewonde of zieke embryo&#39;s) bevatten. Opmerking: Af en toe, bellen in de immersie olie of andere artefacten zal verschijnen in een of twee afbeeldingen in een anders bruikbare dataset. Noteer alle beelden die artefacten bevatten; zij zullen later worden weggegooid, en de resterende tijdstippen van dergelijke data set kan nog worden geanalyseerd. </li><li> Gebruik de Python-based softwarepakket PyFDAP de FDAP gegevens te analyseren. PyFDAP berekent halfwaardetijden door bepaling van de gemiddelde intracellulaire en extracellulaire rode fluorescentie-intensiteit in elk beeld en aanbrengen gegevens met een exponentieel afnemende functie 56 (figuur 3). <ol><li> Download PyFDAP (zie Materialen List). </li><li> Gebruik PyFDAP intracellulaire en extracellulaire photoconverted signaal (figuur 3A, B) te scheiden. Onse de Alexa488 signaal, dat is strikt intracellulaire, om een ​​intracellulaire masker te creëren. Breng dit masker aan overeenkomstige afbeelding van de rode kanaal om te voorkomen dat intracellulaire pixels overweging wordt genomen bij het berekenen van de gemiddelde extracellulaire intensiteit. Om gemiddelde intracellulaire intensiteit te meten, inverteren het masker. </li><li> In PyFDAP, geven de gemaskerde beelden gegenereerd in stap 4.2.2. Visueel te inspecteren deze beelden en gooi datasets waarin maskers niet nauwkeurig intracellulaire van extracellulaire ruimte (dit moet zeldzaam zijn te onderscheiden; er rekening mee dat de celmembranen worden opgenomen in beelden waarin extracellulaire ruimte is gemaskeerd, maar ze konden worden verwijderd door het veranderen van de drempelwaarden algoritme of door de invoering van een membraan masker (bijvoorbeeld met behulp van membraan-GVB)). Ook gooi een enkele afbeeldingen met artefacten (bijvoorbeeld, bellen in de immersie olie) die in stap 4.1. </li><li> Gebruik PyFDAP gemiddelde extracellulaire en intracellulaire fluorescentie-intensiteiten voor eac berekenenh afbeelding. PyFDAP berekent deze gemiddelden door optelling van de intensiteiten van pixels die buiten het masker en delen vallen door het totale aantal pixels opgeteld. </li><li> Breng de fluorescentie data (Figuur 3C) met de volgende exponentiële functie: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> waarin t de tijd na photoconversion c (t) intensiteit bij een bepaalde waarde van t, c 0 is de intensiteit bij t = 0, k de klaringssnelheid constant en y 0 is de asymptoot dat de functie benadert fluorescentie daalt (figuur 1D). y 0 kan worden beperkt op basis van de metingen in stap 3.8 19. </li><li> Gebruik PyFDAP aan de extracellulaire en intracellulaire eiwit halfwaardetijden (τ) van de klaring snelheidsconstanten (k) met de volgende relatie te berekenen: <img fo:content-width = &quot;1in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. controle-experimenten om te beoordelen Fotobleken, Onbedoelde Photoconversion en Photoconversion Uniformiteit <ol><li> Het beoordelen photobleaching Opmerking: Fotobleken kan een artefact afname in fluorescentie intensiteit die de blekende eigenschappen van het fluorescente eiwit in aanvulling op de goedkeuring van het eiwit van interesse weergeeft veroorzaken. <ol><li> Om mogelijke photobleaching beoordelen, voert u een set van FDAP experimenten met 10 min intervallen tussen beeldvorming en een tweede set met 20 min intervallen tussen beeldvorming (figuur 4). Analyseer de gegevens van beide sets van experimenten met PyFDAP zoals beschreven in hoofdstuk 4. </li><li> Vergelijk het half-leven van de 10 en 20 min interval experimenten. Langere halfwaardetijden van 20 min interval experimenten wijzen op een significante fotobleking. Als de halfwaardetijd van beide experimenten zijn identiek, photobleaching is niet een belangrijke zorg. </li><li> Als alternatief beoordelen photobleaching door het verwerven van een reeks van ~ 30 beelden direct na photoconversion. Een significante afname in fluorescentie-intensiteit geeft duidelijk fotobleken. </li><li> Als photobleaching wordt gedetecteerd, gebruiken lagere laservermogen, verlagen beeldvorming tijd, of overwegen om een meer fotostabiel photoconvertible eiwit 32. </li></ol></li><li> Het beoordelen van onbedoelde photoconversion. Opmerking: Dendra2 kan worden photoconverted behulp van 488 nm verlichting 27. Wanneer spannend Alexa488 de 488 nm laser zoals beschreven in stap 3.3.1, onbedoelde fotoconversie en dus een kunstmatig verhoging van de halfwaardetijd van het eiwit van interesse mogelijk. Echter, wij en anderen 33 hebben gevonden dat 488 nm verlichting is een inefficiënte manier van photoconversion in de zebravis embryo&#39;s. <ol><li> Gebruik de controle-experiment in stap 5.1.1 beschreven om onbedoelde photoconversion detecteren. Vergelijk het half-leven van de 10 en 20 min interval experimenten. Kortere halfwaardetijd van 20 min interval experimenten wijzen op een significante onbedoelde photoconversion. Als de halfwaardetijd van beide experimenten zijn identiek, onbedoelde photoconversion is niet een belangrijke zorg. </li><li> Als onbedoelde photoconversion wordt gedetecteerd, gebruik dan een kleinere 488 nm laservermogen en kortere beeldvorming keer per ongeluk te voorkomen photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Het beoordelen photoconversion uniformiteit. Opmerking: Als fotoconversie wordt voorgespannen naar de animale pool van het embryo, de afname in fluorescentie beïnvloed door proteïne diffusie of beweging van cellen in diepere gebieden (figuur 5A). <ol><li> Om te bepalen of photoconversion uniform is, drukken een afgescheiden photoconvertible eiwit (voor experimenten met extracellulaire fusie-eiwitten) of een cytoplasmatisch photoconvertible eiwit (voor experimenten met intracellulaire fusie-eiwitten). Photoconvert zoals gebruikelijk, tkip verwerven van een z-stack omvat meeste blastoderm elke 20 min gedurende 80 min. </li><li> Als photoconversion is beïnvloed naar het dier paal, zal de fluorescentie-intensiteit in diepere vliegtuigen boven de tijd toenemen als gevolg van diffusie of cel beweging (Figuur 5B). Als niet-uniforme photoconversion gedetecteerd richten dieper in het embryo tijdens photoconversion. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben geen conflicten bekend te maken.

Het succes van een FDAP proef berust op het genereren van een functioneel photoconvertible fusieproteïne. Tagging een eiwit kan zijn biologische activiteit en / of biofysische eigenschappen, zoals de lokalisatie, oplosbaarheid en stabiliteit 36-41 beïnvloeden. Wees bereid om de activiteit van verschillende fusieconstructen testen om een ​​die actief is te vinden. Wij hebben gevonden dat de positie van de photoconvertible eiwit ten opzichte van het eiwit van interesse of met meer linkers (bijvoorbeeld...

De niveaus van proteïnen in cellen en organismen worden bepaald door de productiesnelheden en klaring. Eiwit halfwaardetijden kan variëren van enkele minuten tot dagen 1-4. In veel biologische systemen, de stabilisatie of klaring van belangrijke eiwitten heeft belangrijke gevolgen voor de cellulaire activiteit. Modulatie van intracellulair eiwit stabiliteit vereist voor celcyclusprogressie 5,6, ontwikkelings signalering 7-9, apoptose 10 en normale functie en onderhoud van neuronen 11,12. Extracellulaire proteïne stabiliteit beïnvloedt de verdeling en de beschikbaarheid van uitgescheiden eiwitten zoals morfogenen 13,14 binnen een weefsel. In de afgelopen decennia heeft eiwitstabiliteit vooral beoordeeld in celkweek met behulp van radioactieve pulse-labeling of cycloheximide chase experimenten 15. In dergelijke pulse-chase experimenten worden cellen hetzij tijdelijk blootgesteld aan een &quot;puls&quot; van radioactieve aminozuurvoorlopers die zijn opgenomen in nieuw gesynthetiseerde eiwitten of ze worden blootgesteld aan cycloheximide, die eiwitsynthese remt. Gekweekte cellen worden dan verzameld op verschillende tijdstippen, en hetzij immunoprecipitatie gevolgd door autoradiografie (radioactieve pulse-chase experimenten) of western blotting (in cycloheximide experimenten) wordt gebruikt om de klaring van eiwit kwantificeren tijd. Conventionele eiwitstabiliteit assays meerdere tekortkomingen. Eerst eiwitten in deze assays worden vaak niet uitgedrukt in hun endogene omgevingen, maar in weefselkweek en soms van verschillende species. Voor eiwitten waarvan de stabiliteit is contextafhankelijk deze benadering problematisch. Ten tweede is het niet mogelijk om eiwitten speling in individuele cellen of organismen te volgen in de tijd en de gegevens van deze testen geeft een gemiddelde van verschillende populaties van cellen op verschillende tijdstippen. Aangezien individuele cellen kan zijn begonnenmet verschillende hoeveelheden eiwit, mogen hebben de radioactieve merker of cycloheximide op verschillende tijdstippen, of kunnen verschillend klaringskinetiek, zoals geaggregeerde gegevens misleidend kunnen zijn. Tenslotte, bij cycloheximide chase experimenten toevoeging van de eiwitsyntheseremmer kan onbedoelde fysiologische effecten die kunstmatig eiwit stabiliteit 16-18 kunnen veranderen hebben. Deze gebreken kunnen worden vermeden door gebruik fluorescentievervaltijd Na Photoconversion (FDAP), een techniek die gebruik maakt photoconvertible eiwitten proteïne klaring dynamisch meten levende organismen 19-25 (zie bespreking beperkingen van de FDAP techniek). Photoconvertible eiwitten zijn fluorescerende eiwitten waarvan excitatie en emissie-eigenschappen veranderen na blootstelling aan specifieke golflengten van het licht 26. Een vaak gebruikte variant is Dendra2, een &quot;groen-to-rode&quot; photoconvertible eiwit dat in eerste instantie heeft excitatie en emissie eigenschappen vergelijkbaar groen fluorescerende eiwitten, maar na blootstelling aan UV licht- &quot;fotoconversie&quot; -haar excitatie- / emissie-eigenschappen worden vergelijkbaar met die van rode fluorescente proteïnen 23,27. Belangrijk is dat nieuwe eiwit geproduceerd na photoconversion niet hetzelfde excitatie / emissie-eigenschappen als de photoconverted eiwit, waardoor ontkoppeling van de productie en de klaring na photoconversion en observatie van slechts een pool van photoconverted eiwit. Tagging eiwitten van belang met photoconvertible eiwitten biedt dus een handige manier om de pulse-label eiwitten in intacte, optisch toegankelijke levende organismen. In FDAP assays (figuur 1A), is een eiwit van belang gelabeld met een photoconvertible eiwit en uitgedrukt in een levend organisme (Figuur 1B). Het fusie-eiwit wordt photoconverted en de daling photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd door fluorescence microscopie (figuur 1C). De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt model om de halfwaardetijd van het fusie-eiwit (figuur 1D) te bepalen. De FDAP assay beschreven is ontworpen om het extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten in zebravisembryo bepalen tijdens de vroege embryogenese 19. Echter, kan deze benadering worden aangepast aan elke transparante modelorganisme dat live beeldvorming tolereert, en kunnen worden gebruikt om de klaring van taggable intracellulair of extracellulair eiwit controleren. Variaties van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd in gekweekte cellen 20,23 en Drosophila 22 en muis 21 embryo.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (download van de volgende website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>Installeer en gebruik volgens de instructies op de PyFDAP website; PyFDAP is compatibel met Linux, Mac en Windows besturingssystemen.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Om capped mRNA te genereren voor injectie in embryo's</td></tr><tr><td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Co-injecteer met mRNA om intracellulaire en extracellulaire maskers te creëren</td></tr><tr><td>6-well plastic schaal</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Incubeer embryo's in agarose-gecoate putjes tot ze klaar zijn voor montage</td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>250 mg/L Instant Ocean zout, 1 mg/L methyleenblauw in omgekeerd osmose water aangepast naar pH 7 met NaHCO3</td></tr><tr><td>Protease van Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Maak een 5 mg/ml stockoplossing en gebruik 1 mg/ml om embryo's te dechorioneren in het enkele celstadium</td></tr><tr><td>Glazen Petri schotel met een diameter van 5 cm</td><td></td><td></td><td>Voor dechorionering van embryo's</td></tr><tr><td>200 ml glazen beker</td><td></td><td></td><td>Voor dechorionering van embryo's</td></tr><tr><td>Micro-injectie apparaat</td><td></td><td></td><td>Voor injectie van mRNA en kleurstof in embryo's in het enkele celstadium</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td></td><td></td><td>Voor het injecteren en monteren van embryo's</td></tr><tr><td>1x Danieau's medium</td><td></td><td></td><td>Verdun laagsmeltende agarose en voer beeldvorming uit in dit medium; recept: 0,2 mm gefilterde oplossing van 58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,2</td></tr><tr><td>UltraPure laagsmeltende agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Voor het monteren van embryo's; gebruik in een concentratie van 1% in Danieau's medium: voeg 200 mg toe aan 20 ml Danieau's medium, verwarm tot het is opgelost, verdeel vervolgens in 1 ml aliquoten in microcentrifugebuisjes; aliquoten kunnen worden bewaard bij 4 °C, opnieuw gesmolten bij 70 °C en gekoeld tot 40-42 °C wanneer ze klaar zijn om te gebruiken</td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipet</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>Voor het monteren van embryo's; verhit de punt om te voorkomen dat scherpe randen embryo's verwonden</td></tr><tr><td>Metalen sonde</td><td></td><td></td><td>Voor het positioneren van embryo's tijdens het monteren</td></tr><tr><td>Schalen met glazen bodem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Gebruik de juiste dikte dekglas voor uw objectief; hier genoemd artikelnummer is voor dekglas Nr. 1,5</td></tr><tr><td>15 ml buisje gevuld met ~5 ml embryo medium</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Voor het spoelen van resterend agarose uit de Pasteur pipet</td></tr><tr><td>Omgekeerde laser scanning confocale microscoop</td><td></td><td></td><td>Een kwikbooglamp, 488 nm laser, 543 nm laser en de juiste filtersets zijn vereist</td></tr><tr><td>Verwarmde stage</td><td></td><td></td><td>Om embryo's op de optimale temperatuur van 28 °C te houden tijdens het experiment</td></tr><tr><td>Confocale software die in staat is tot time-lapse beeldvorming</td><td></td><td></td><td>Moet in staat zijn om meerdere posities te definiëren en deze automatisch met gedefinieerde intervallen te beeldvormen</td></tr><tr><td>25X of 40X water objectief</td><td></td><td></td><td>Objectief voor beeldvorming</td></tr><tr><td>10X luchtobjectief</td><td></td><td></td><td>Objectief voor fotoconversie</td></tr><tr><td>Immersieolie</td><td></td><td></td><td>Immersieolie met dezelfde brekingsindex als water</td></tr></tbody></table>

meten eiwit stabiliteit in living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie decay na photoconversion (fdap)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Eiwitstabiliteit invloed op vele aspecten van de biologie, en het meten van de klaringskinetiek van eiwitten kan belangrijke inzichten verschaffen in biologische systemen. In FDAP experimenten, kan de klaring van eiwitten in levende organismen worden gemeten. Een eiwit van belang wordt gelabeld met een photoconvertible fluorescent eiwit expressie in vivo en photoconverted, en de daling van de photoconverted signaal over de tijd wordt gecontroleerd. De gegevens worden vervolgens voorzien van een geschikt klaringsmodel de halfwaardetijd van het eiwit te bepalen. Belangrijk is dat de klaringskinetiek eiwit populaties in verschillende compartimenten van het organisme worden afzonderlijk door toepassing compartimentele maskers onderzocht. Deze benadering is gebruikt om de intra- en extracellulaire halfwaardetijden van uitgescheiden signaaleiwitten bepaalt gedurende ontwikkeling van de zebravis. We beschrijven hier een protocol voor FDAP experimenten in de zebravis embryo&#39;s. Het moet mogelijk zijn om FDAP om de kinetiek van de klaring bepalenelke taggable eiwit in elk optisch toegankelijke organisme.

FDAP is gebruikt om de halfwaardetijden van extracellulaire signaaleiwitten bepalen zebravisembryo 19. Een van deze eiwitten, Scheel, induceert expressie van genen gedurende embryogenese mesendodermal 34. Scheel-Dendra2 activeert expressie van mesendodermal genen op een niveau dat vergelijkbaar is met niet-gecodeerde Scheel, zoals aangetoond door qRT-PCR en in situ hybridisatie assays 19. Embryo&#39;s werden co-geïnjecteerd met Alexa488-dextran en mRNA coderend Scheel-Dendra2 en...

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om intracellulaire en extracellulaire eiwitstabiliteit te meten in levende zebravis embryo's. Dit wordt bereikt door een eiwit van belang te labelen met een fotoomzetbare fluorescente proteïne, en door mRNA, dat codeert voor de fusie evenals een fluorescente kleurstof, in zebravis embryo's te injecteren. Vervolgens wordt de fotoomzetbare fusieproteïne foto omgezet, wat het eiwit pulse-labels.In dit voorbeeld wordt de fusieproteïne uitgescheiden, waarna de afname in intra- en extracellulaire foto omgezette fluorescentie-intensiteit in de tijd wordt gemonitord en gepast met een exponentieel afnemende functie om de intracellulaire en extracellulaire halfwaardetijden van de fusieproteïne te bepalen. De resultaten tonen de in vivo stabiliteit van fotoomzetbare fusieproteïnen op basis van de afname in fluorescent signaal over tijd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van cel- en ontwikkelingsbiologie.Bijvoorbeeld, hoe stabiliteit de eiwitverdeling en beschikbaarheid beïnvloedt. We gebruiken onze software EP voor de analyse van FD DP data. EP is gratis beschikbaar op onze webpagina. Na het genereren

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Hier presenteren we een methode voor het foto-geactiveerd schakelen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen te monitoren die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.

Generatie Dispersed presomitische Mesoderm Cell Cultures for Imaging van de zebravis Segmentatie Klok in enkele cellen

De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.

Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer eiwitstabiliteit meten in levende zebravisembryo's met fluorescentieverval na fotoconversie. Deze methode bepaalt intracellulaire en extracellulaire halfwaardetijden van fusie-eiwitten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo's met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Meer video's verkennen