Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo's met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)
28 januari 2015
Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.
Het algemene doel van het volgende experiment is om intracellulaire en extracellulaire eiwitstabiliteit te meten in levende zebravis embryo's. Dit wordt bereikt door een eiwit van belang te labelen met een fotoomzetbare fluorescente proteïne, en door mRNA, dat codeert voor de fusie evenals een fluorescente kleurstof, in zebravis embryo's te injecteren. Vervolgens wordt de fotoomzetbare fusieproteïne foto omgezet, wat het eiwit pulse-labels.
In dit voorbeeld wordt de fusieproteïne uitgescheiden, waarna de afname in intra- en extracellulaire foto omgezette fluorescentie-intensiteit in de tijd wordt gemonitord en gepast met een exponentieel afnemende functie om de intracellulaire en extracellulaire halfwaardetijden van de fusieproteïne te bepalen. De resultaten tonen de in vivo stabiliteit van fotoomzetbare fusieproteïnen op basis van de afname in fluorescent signaal over tijd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van cel- en ontwikkelingsbiologie.
Bijvoorbeeld, hoe stabiliteit de eiwitverdeling en beschikbaarheid beïnvloedt. We gebruiken onze software EP voor de analyse van FD DP data. EP is gratis beschikbaar op onze webpagina. Na het genereren van gecapt mRNA dat codeert voor een groen naar rood fotoomzetbare fusieproteïne van belang, worden ongeveer 31 celstadium zebravis embryo's overgebracht naar een glazen of agar beklede kunststof petrischaal van vijf centimeter diameter, bevattend ongeveer acht milliliter embryo medium.
Voeg twee milliliter van eerder bereide en ontdooide pro nay-voorraadoplossing toe aan de schaal en incubeer gedurende vijf tot tien minuten op kamertemperatuur. Vul een glazen speaker met embryo medium en terwijl de embryo's niet blootgesteld worden aan lucht of plastic, worden de embryo's overgebracht naar de beker door de petrischaal schuin te houden terwijl deze ondergedompeld wordt in het medium. Nadat de embryo's zich aan de bodem van de beker hebben gezet, giet je het meeste medium weg en vervang je het voorzichtig met vers medium.
Het lichte draaien van het verse medium zal ervoor zorgen dat de embryo's hun verzwakte corium verliezen. Na het herhalen van de wassing, gebruik je een glazen PEs pipet met een ontstoken punt om de gecoate embryo's over te brengen naar een agarose gecoate injectieschaal. Injecteer vervolgens het mRNA en een drie kilodalton Alexa 4 88 DExT Strand-conjugaat direct in het centrum van de cel om een gelijkmatige verdeling van mRNA en kleurstof te garanderen.
Zodra de klieving begint, breng je de geïnjecteerde embryo's over naar een een tot twee procent agarose gecoate put van een zes putten kunststof schaal gevuld met embryo, medium, en incubeer in het donker bij 28 graden Celsius totdat de embryo's de late sferestadium bereiken. Gebruik een stereomicroscoop om een tot vijf gezonde embryo's te identificeren en gebruik een glazen PEs pipet met een ontstoken punt om ze uit de schaal te verwijderen. Doe de embryo's voorzichtig in een microcentrifugebuisje met ongeveer een milliliter gesmolten 1% lage smeltpunt agaros in een x danio embryo medium. Trek vervolgens de embryo's samen met wat agaros terug in de pipet.
Spuit vervolgens voorzichtig de agaros en embryo's op het dekglas van een glazen bodemschaal. Om de glazen pipet opnieuw te gebruiken, spuug je het resterende agaros eruit om verstopping te voorkomen door snel embryo medium op en neer te pipetten, snel werken voordat het agaros stolt.
Gebruik een metalen sonde om de embryo's zo te positioneren dat de dierlijke pool het dekglas onder de stereomicroscoop toedraait. Monitor de posities van de embryo's en pas zo nodig aan totdat het agaro hard wordt. Wanneer het agaro is gestold, vul je de glazen bodemschaal met een x danio embryo medium.
Voorbereiding voor fotoconversie, stel de incubator in op 28 graden Celsius en plaats een grote druppel immersieolie op het objectief om ervoor te zorgen dat de oliefilm tussen het objectief en het dekglas niet breekt terwijl de stage naar verschillende embryo posities beweegt. Tijdens het beeldvormen, plaats je de glazen bodemschaal stevig op de stage zodat de schaal niet verschuift wanneer de stage beweegt. Definieer vervolgens in de software van de confocale microscoop de positie van elke embryo.
Pas de Z-diepte voor elk embryo aan en probeer om ongeveer hetzelfde vlak in elk embryo te targeten met behulp van zowel de 488 als 543 nanometer lasers. Verzamel pre-fotoconversie beelden. Configureer vervolgens de confocale microscoop software om elk van de eerder gedefinieerde posities met de juiste beeldvormingscondities te beeldvormen.
Elke 10 of 20 minuten of een vijf uur durend tijdsverloop om de fusieproteïne te foto-omzetten, schakel je over naar een 10 x objectief en exposeer groepen embryo's gedurende twee minuten aan UV licht van de kwiklamp met een ongeveer 300 tot 400 nanometer filter op 100% output. Verplaats de focus langs de Z-as om een uniforme fotoconversie na fotoconversie te bevorderen. Schakel onmiddellijk terug naar het 25 x of 40 x objectief en om te bevestigen dat de eerder gedefinieerde posities nog steeds nauwkeurig zijn.
Als de schaal tijdens fotoconversie is verschoven, definieer je de posities van de embryo's opnieuw. Start de beeldvormingstijdsverloop en laat het vijf uur lang lopen. Noteer de tijd die is verstreken tussen fotoconversie en het begin van beeldvorming voor elk embryo.
Controleer het experiment af en toe en monitor het niveau van het medium van Danielle, voeg indien nodig meer toe. Begin met het visueel inspecteren van de tijdsverloop datasets van elk embryo. Gooi datasets weg van embryo's die tijdens beeldvorming zijn gestorven, die significant zijn verschoven, die zeer lage niveaus van foto-omgezet signaal hebben, of die gebieden van cellen bevatten die er ongebruikelijk uitzien en die zijn gestopt met bewegen en delen.
Gebruik het Python-gebaseerde softwarepakket, PI F DAP om een masker te maken met behulp van het Alexa 4 88 signaal, dat strikt intracellulair is. Om intracellulair en extracellulair foto-omgezet signaal te scheiden, pas je het masker toe op het corresponderende rode kanaalbeeld om te voorkomen dat intracellulaire pixels worden overwogen. Bij het berekenen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de stabiliteit van eiwitten in levende zebravisembryo's met behulp van een fotoconverteerbaar fluorescent eiwit. Het verval van de fluorescentie-intensiteit wordt gemonitord om de halfwaardetijden van de eiwitten in zowel intracellulaire als extracellulaire omgevingen te bepalen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Fluorescentie-imaging
Achtergrond
- Proteïneniveaus worden gereguleerd door productie en klaring.
- Inzicht in proteïnestabiliteit is essentieel voor de cellulaire functie.
- Fluorescentietechnieken kunnen inzicht bieden in proteïnedynamiek.
- Zebravissenembryo's zijn een nuttig model voor in vivo studies.
Doel van de studie
- Om de stabiliteit van proteïnen in levende zebravissenembryo's te meten.
- Om foto-convertibele fluorescerende proteïnen te gebruiken voor tracking.
- Om zowel intracellulaire als extracellulaire proteïnehalfwaardetijden te bepalen.
Gebruikte methoden
- Het labelen van een doeleiwit met een fotoconverteerbaar fluorescent eiwit.
- Het injecteren van mRNA dat codeert voor het fusie-eiwit en een fluorescente kleurstof in zebravissenembryo's.
- Het fotoconverteren van het fusie-eiwit voor pulslabeling.
- Het monitoren van het verval van de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd.
Belangrijkste Resultaten
- Een afname in fluorescentie-intensiteit duidt op proteïnestabiliteit.
- De halfwaardetijden van het fusieproteïne kunnen worden bepaald.
- De methode demonstreert de in vivo stabiliteit van fotoconverteerbare proteïnen.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van proteïnedynamiek in levende organismen.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van eiwitstabiliteit in vivo.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan onderzoek in de cel- en ontwikkelingsbiologie.
- Fluorescentie-decayanalyse is een waardevolle tool voor eiwitonderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het meten van de klaringkinetiek van eiwitten in levende systemen maakt doelvalidatie mogelijk door functionele halfwaardetijden te onthullen die de therapeutische beschikbaarheid en padactiviteit beïnvloeden. Deze benadering ondersteunt mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase door de intracellulaire en extracellulaire stabiliteit van uitgescheiden signaleringseiwitten te kwantificeren, wat informatie verschaft voor doserings- en engineeringstrategieën. De methode biedt voorspellend vertrouwen voor lead-identificatie door eiwitstabiliteit te koppelen aan ontwikkelingsfenotypen in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoek therapeutische hypothesen door te meten hoe eiwitstabiliteit de distributie en beschikbaarheid in vivo beïnvloedt.
- Operationele waarde: Maak functionele targetvalidatie mogelijk door directe meting van de klaringkinetiek in levende zebravissenembryo's.
- Voorspellende waarde: Ondersteun portfolio-triage door eiwitten met gunstige intra- en extracellulaire halfwaardetijden te identificeren voor verdere ontwikkeling.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereid gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door basislijnen voor eiwitomzetelingssnelheden vast te stellen.
- Operationele waarde: Pak assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via kwantificeerbare fluorescentie-afname-metingen die zijn gefit aan exponentiële modellen.
- Schaalbaarheid: Benadruk de gereedheid voor screening en platformhergebruik door compartiment-specifieke analyse mogelijk te maken via intracellulaire en extracellulaire masking.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Bespreek de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door de stabiliteit van uitgescheiden signaleringsproteïnen tijdens de ontwikkeling van zebravis te meten.
- Preklinische Validatie: Beschrijf de continuïteit van ontdekking tot preklinisch werk door de halfwaardetijden van proteïnen in een fysiologisch relevante context te beoordelen.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Ondersteun beslissingen over verdere ontwikkeling door kwantitatieve klaringgegevens te verstrekken die inzicht geven in de target-binding en de werkingsduur.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie door mechanistische inzichten te verschaffen in de eiwitstabiliteit, wat invloed heeft op de screening en optimalisatie van verbindingen.
- Discovery Biology: Leg uit hoe de methode hypothesetesten, pathway-verduidelijking of biologische risicoreductie ondersteunt door proteinklarering te koppelen aan ontwikkelingsfenotypen.
- Screening: Beschrijf de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid of kwantitatieve output, indien ondersteund door het artikel, via meetbare intracellulaire en extracellulaire fluorescentie-afname.
- Analytics: Benadruk metingen, read-outs of statistische resultaten die teams helpen om condities te vergelijken via gefitte klareringsmodellen en halfwaardetijdberekeningen (tau).
- Translational Research: Verbind de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt via analyse van de stabiliteit van gesecreteerde eiwitten in ontwikkelende embryo's.
- Enterprise Reuse: Formuleer de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek door de meting van klareringskinetiek mogelijk te maken voor elk tagbaar eiwit in optisch toegankelijke organismen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in mRNA-injectie, confocale beeldvorming en fluorescentie-decayanalyse.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een confocale microscoop, een UV-foto-conversiesysteem en Python-gebaseerde PI F DAP-software.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor maskergeneratie, compartimentsegmentatie en consistentie bij tijdreeksbeeldvorming.
- Overwegingen voor adaptatie over modelsystemen heen, afhankelijk van de optische toegankelijkheid en protocollen voor embryo-onderhoud.
- Praktische beperkingen ondersteund door bronmateriaal, waaronder de levensvatbaarheid van embryo's tijdens beeldvorming en het nauwkeurig onderscheiden van intracellulaire versus extracellulaire signalen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Generating a Photoconvertible Fusion Construct and Injecting Dechorionated Zebrafish Embryos
3:22
Mounting Zebrafish Embryos for Photoconversion and Confocal Imaging
4:37
Photoconverting and Measuring the Decrease of the Photoconverted Signal
6:47
Analyzing the Data Using PyFDAP
8:18
Results: Half-life of Squint-Dendra2 as Determined by Fluorescence Decay After Photoconversion during Embryogenesis
9:19
Conclusion
