Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen
7 juli 2015
Hier maken we een glazen pipette met twee functies: remming van diepe hersenstructuren door micro-injecties van geneesmiddelen en real-time monitoring van hun effecten door gelijktijdige elektrofysiologische opnames.
Het algemene doel van deze procedure is om een betaalbaar injectiekanaal te construeren om neurotransmitters te micro-injecteren in de superieure colliculus van de rat, terwijl de multi-unit neuronale activiteit wordt gemonitord. Dit wordt bereikt door eerst een glazen pipet te maken met behulp van een glazen capillair en een verticale micropipettrekker. De tweede stap is het inbrengen van een zilverdraad in het capillair met een gedeelte van de draad dat uit het niet-versmallende uiteinde steekt.
Vervolgens wordt lijm gebruikt om een strakke afdichting te maken tussen de glazen pipet en een hypodermische naald. De laatste stappen zijn het vullen van de pipet met een Chicago sky blue gekleurde GABA-oplossing, die is bevestigd aan een microspuit gevuld met minerale olie en vastgemaakt aan een micro-injector. Uiteindelijk kan deze constructie van een injectie met toegankelijke en betaalbare onderdelen worden gebruikt om diepe hersenstructuren te inactiveren terwijl de neuronale activiteit van het geïnactiveerde gebied wordt opgenomen vóór, tijdens en na het injecteren van een medicijn.
Er zijn enkele voordelen van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals gas-gebaseerde drukpulsen en fotische injectiesystemen. Een voordeel is dat het een kosteneffectieve methode is die functie-gebaseerde controle over de medicijnafgifte mogelijk maakt, wat de weefselschade die wordt veroorzaakt door overmatig injecteren beperkt. Een ander voordeel dat dit systeem biedt, is een gecombineerde opnamemogelijkheid, die efficiënte controle over de temporele component van neurale deactivatie mogelijk maakt.
Om de opname-injectiepipetten voor te bereiden, trekt u eerst een capillair van zeven centimeter met een buitendiameter van één millimeter voor een cop verticale model. Zeven 20 of soortgelijke eenheid. Stel de verwarmer in op 18 en de solenoïde op één, draag vervolgens handschoenen en breek handmatig de punt om een opening te maken en verifieer onder een microscoop dat de binnendiameter tussen 30 en 40 micrometer ligt.
Meet dit met de zoeker-regel. Het zal een relatief lage impedantie van 0,3 tot 0,6 mega ohm produceren. Voer vervolgens vanaf het niet-versmallende uiteinde een zilverdraad in de pipet in, ongeveer zeven centimeter lang, en laat een tot twee centimeter uit de pipet steken.
Buigdeze overtollige draad orthogonaal aan de capillair. Neem vervolgens een hypodermische naald van 30 gauge en breng flexibele plastic lijm aan op de schacht. Steek vervolgens langzaam de naald in de pipet.
Zo ver mogelijk. Voeg meer lijm toe om een afdichting te maken op de verbinding tussen de pipet en de naald. Laat de assemblage met de pipettip omhoog ongeveer 12 uur drogen.
Na het anesthetiseren en het plaatsen van de rat in een stereotactische frame, brengt u oogzalf aan en scheert u zijn hoofd schoon. Na het aanbrengen van een lokaal anestheticum en het bevestigen van een chirurgisch anesthesieniveau, gaat u verder met het insnijden van de hoofdhuid langs de mediane met een scalpelblad nummer 10. Dit zal de coronale en sagittale naden blootleggen.
Gebruik vervolgens een chirurgische spatel om de Lambda en bgma anatomische referenties te identificeren. Pas de positie van het hoofd aan zodat deze landmarks zich in hetzelfde horizontale vlak bevinden. Zet vervolgens een fijne stijve wijzer, zoals een glazen buis, op de bgma.
Pas vervolgens de positie van de buis aan op een locatie van belang met behulp van coördinaten vanaf de bgma. Gebruik de Sharpie om een vierkant te tekenen rond het doelgebied voor de craniotomie. Verwijder nu met de chirurgisch gesteriliseerde boor langzaam het bot langs de markeringen.
Begin met zo weinig mogelijk druk te gebruiken en houd de boor in beweging om weefselschade door wrijving te voorkomen wanneer het bot dun is geworden. Verwijder voorzichtig de vierkante sectie met een pincet. De Dora MA hoeft niet te worden verwijderd, aangezien de injectie het naar voren zal penetreren. Houd de blootgestelde cortex geïrrigeerd met hersenvocht.
Bereid de injectie voor door eerst een spuit van vijf tot 10 microliter te vullen met minerale olie. Bereid vervolgens het gewenste medicijn met een kleurstof in fysiologische zoutoplossing voor. Hier wordt 0,5% Chicago sky blue gemengd met 300 micromolar gaba.
Vul nu de injectiepipet door eerst een spuit van één milliliter te laden met een bereide oplossing en vervolgens de spuit te gebruiken om de pipet te laden. Houd bij het verwijderen van de spuit lichte druk op de zuiger, zodat een vacuüm geen oplossing uit het injectiekanaal verwijdert. Controleer op ontsnappende vloeistof op mogelijke lekkagepunten.
Dekvloeistof verwijderen met een wattenstaafje en opnieuw controleren op lekkage. Bevestig vervolgens de microspuit met minerale olie aan het injectiekanaal. Veeg vervolgens eventuele overtollige oplossing weg.
Controleer met gaas de injectietip. Het zou mogelijk moeten zijn om kleine druppels oplossing erdoorheen te laten stromen, anders is deze geblokkeerd of monteer nu de injector veilig op een micropompsysteem.
Vervolgens beweegt u de positie van het injectiekanaal naar de doelcoördinaten en laat u de elektrode zakken naar de superieure colus, die kan worden geïdentificeerd door de opname van visueel geëvokeerd potentieel. Terwijl de elektrode wordt verlaagd, brengt u een kleine positieve druk aan door een lage injectiesnelheid toe te passen om verstopping te voorkomen. Onderbreek de injectie wanneer de structuur is bereikt.
Na het inbrengen van de injectie bedekt u de blootgestelde cortex met warme agar om uitdroging te voorkomen. Wacht na de definitieve plaatsing van de elektrode 30 minuten om de stabilisatie van het weefsel rond de elektrode mogelijk te maken. Injecteer vervolgens 400 tot 800 nanoliter oplossing met een snelheid van 40 nanoliter per minuut totdat een activering van neuronale activiteit in de superieure colus wordt gezien, de elektrode zou een vermindering in spikes moeten vertonen tijdens de injectie van de remmende oplossing.
Visueel geëvokeerd potentieel werd verkregen in de superieure colus. Na een flits van 300 millisecond
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de constructie van een glazen pipet die is ontworpen voor twee doeleinden: het toedienen van geneesmiddelen om diepe hersenstructuren te remmen en het bewaken van neuronale activiteit door middel van elektrofysiologische opnames.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neurofarmacologie
Achtergrond
- Het begrijpen van diepe hersenstructuren is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Microinjecties maken gerichte geneesmiddeltoediening mogelijk.
- Gelijktijdige bewaking van neuronale activiteit verbetert de gegevensnauwkeurigheid.
- Betaalbare hulpmiddelen kunnen bredere onderzoekstoepassingen mogelijk maken.
Doel van het onderzoek
- Om een kosteneffectieve methode te creëren voor microinjectie van neurotransmitters.
- Om multi-unit neuronale activiteit te bewaken tijdens geneesmiddeltoediening.
- Om de toegankelijkheid van experimentele technieken in de neurowetenschappen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Constructie van een glazen pipet met behulp van een glazen capillair.
- Inbrengen van een zilverdraad voor elektrische opname.
- Versluiten van de pipet op een hypodermische naald met lijm.
- Vullen van de pipet met een GABA-oplossing voor microinjectie.
Belangrijkste resultaten
- De geconstrueerde pipet leverde effectief geneesmiddelen af aan de superieure colliculus van de rat.
- Gelijktijdige opnames van neuronale activiteit werden met succes verkregen.
- De methode toonde betrouwbaarheid in het inactiveren van doelgerichte hersenstructuren.
- Resultaten wezen op potentieel voor bredere toepassingen in neurowetenschappelijk onderzoek.
Conclusies
- De pipet met dubbele functie is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijke studies.
- Het maakt zowel geneesmiddeltoediening als real-time bewaking van neuronale activiteit mogelijk.
- Deze aanpak kan experimentele resultaten in de neurofarmacologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables real-time functional validation of drug effects on neuronal circuits, supporting target de-risking in early neuropharmacology discovery. By combining microinjection with electrophysiological readout, it provides mechanistic confidence for inhibitory compound screening. The approach offers a low-cost, adaptable platform for probing brain region-specific pharmacodynamics prior to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic targets through site-specific drug delivery and concurrent neuronal activity monitoring.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven validation of neuronal pathway involvement in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time electrophysiological readouts as functional biomarkers of drug engagement.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through reproducible microinjection and recording parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges in vitro findings to intact circuit function by validating drug effects in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Supports go/no-go decisions by linking target inhibition to measurable changes in neural network activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement and functional consequence must be established before compound advancement.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by confirming that target modulation produces expected electrophysiological outcomes.
- Screening: Enables primary screening of inhibitory agents using neuronal silencing as a functional readout.
- Analytics: Provides spike suppression metrics and latency-to-effect measurements for compound comparison.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by demonstrating target-mediated effects in vivo.
- Enterprise Reuse: The injectrode design is adaptable across brain regions and chemical compounds, supporting broad reuse in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking pharmacological intervention to functional neural output.
- Operational Value: Reduces reliance on separate injection and recording systems, improving workflow efficiency and data synchronization.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by minimizing false positives through functional target confirmation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent electrophysiological responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electrophysiology, and stereotaxic targeting.
- Depends on access to microinjectors, amplifiers, and signal acquisition systems capable of multi-unit recording.
- Necessitates standardization of injection volumes, rates, and post-injection stabilization periods across studies.
- Adaptation to different brain regions may require recalibration of coordinates and electrode positioning.
- Potential limitations include tissue damage from repeated insertions and variability in seal integrity affecting drug delivery accuracy.
