Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Het algemene doel van deze procedure is om een betaalbare injectienaald te construeren voor het micro-injecteren van neurotransmitters in de superieure colliculus van de rat, terwijl de multi-unit neuronale activiteit wordt gemonitord. Dit wordt bereikt door eerst een glazen pipet te maken met behulp van een glazen capillair en een verticale micropipettrekker. De tweede stap is het inbrengen van een zilverdraad in het capillair, waarbij een gedeelte van de draad uit het niet-taps toelopende uiteinde steekt.

Vervolgens wordt lijm gebruikt om een luchtdichte afsluiting te creëren tussen de glazen pipet en een hypodermische naald. De laatste stappen bestaan uit het vullen van de pipet met een Chicago sky blue gekleurde GABA-oplossing, bevestigd aan een microspuit gevuld met minerale olie en gefixeerd aan een micro-injector. Uiteindelijk kan deze constructie van een injector, bestaande uit toegankelijke en betaalbare onderdelen, worden gebruikt om diepe hersenstructuren te inactiveren, terwijl de neuronale activiteit van het geïnactiveerde gebied wordt geregistreerd vóór, tijdens en na de injectie van een geneesmiddel.

Deze techniek biedt enkele voordelen ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals gasgebaseerde drukpulsen en fotische injectiesystemen. Ten eerste is het een kostenefficiënte methode die functiegebaseerde controle over de toediening van het geneesmiddel mogelijk maakt, waardoor weefselschade als gevolg van overinjectie wordt beperkt. Een ander voordeel van dit systeem is de gecombineerde registratiecapaciteit, wat een efficiënte controle over de temporele component van neurale deactivatie mogelijk maakt.

Om de injectiepipetten voor registratie voor te bereiden, trek eerst een capillair van zeven centimeter met een buitendiameter van één millimeter met een cop verticaal model. Seven 20 of een soortgelijke unit. Stel de verwarmer in op 18 en de solenoïde op één; breek vervolgens, met handschoenen aan, handmatig de punt af om een opening te maken en verifieer onder een microscoop of de binnendiameter tussen 30 en 40 micrometers ligt.

Meet dit met de liniaal van de zoeker. Dit zal een relatief lage impedantie van 0,3 tot 0,6 mega ohm opleveren. Steek vervolgens vanaf het niet-toelopende uiteinde een zilverdraad van ongeveer zeven centimeter lang in de pipette en laat één tot twee centimeter uit de pipette steken.

Buig dit overtollige draad orthogonaal ten opzichte van de capillair. Neem vervolgens een hypodermische naald van 30 gauge en breng flexibele plasticlijm aan op de schacht. Voer de naald daarna langzaam in de pipet in.

Voeg zoveel mogelijk extra lijm toe om een afdichting te creëren op het verbindingspunt tussen de pipet en de naald. Laat de assemblage ongeveer 12 uur drogen met de pipetpunt naar boven gericht.

Nadat de rat is geanestheseerd en in een stereotaxisch frame is geplaatst, brengt u oogzalf aan en scheert u de kop schoon. Na het toedienen van een plaatselijk anestheticum en het bevestigen van een chirurgisch vlak van anesthesie, wordt de hoofdhuid langs de mediaan ingesneden met een scalpelblad nummer 10. Hierdoor komen de coronale en sagittale suturen bloot te liggen.

Identificeer vervolgens met een chirurgische spatel de anatomische referentiepunten Lambda en bgma. Pas de positie van de kop aan zodat deze referentiepunten zich op hetzelfde horizontale vlak bevinden. Nul vervolgens een fijne, stijve aanwijzer, zoals een glazen buisje, af op de bgma.

Pas vervolgens de positie van de buis aan naar een locatie van belang met behulp van de coördinaten van de bgma. Gebruik de markeerstift om een vierkant rond het doelgebied voor de craniotomie te tekenen. Verwijder nu met de chirurgisch gesteriliseerde boor langzaam het bot langs de markeringen.

Begin met het uitoefenen van zo min mogelijk druk en houd de boor in beweging om weefselschade door wrijving te voorkomen wanneer het bot dun is geworden; verwijder vervolgens voorzichtig het vierkante gedeelte met een pincet. De Dora MA hoeft niet te worden verwijderd, aangezien de injectie hier voortaan doorheen zal dringen. Houd de blootgestelde cortex geïrrigeerd met cerebrospinale vloeistof.

Bereid het injectaat voor door eerst een spuit van vijf tot 10 µL te vullen met minerale olie. Bereid vervolgens het betreffende geneesmiddel voor met een kleurstof in fysiologisch zout. Hierbij wordt 0,5% Chicago sky blue gemengd met 300 µM gaba.

Vul nu de injectiepipet door eerst een spuit van 1 ml te vullen met een bereide oplossing en vervolgens de spuit te gebruiken om de pipet te vullen. Oefen bij het verwijderen van de spuit lichte druk uit op de zuiger, zodat er door een vacuüm geen oplossing uit de injectiebuis wordt getrokken. Controleer op lekkende vloeistof bij mogelijke lekpunten.

Dep eventueel overtollige vloeistof weg en controleer opnieuw op lekkages. Bevestig nu de microspuit met minerale olie aan de injectiearm. Veeg vervolgens alle overtollige oplossing weg.

Met gaas. Controleer de injectietip. Er moeten kleine druppels oplossing doorheen kunnen vloeien, anders is deze geblokkeerd; bevestig anders de injector stevig op een micropompsysteem.

Verplaats vervolgens de positie van de injectienaald naar de doelcoördinaten en laat de elektrode zakken tot de colliculus superior, die kan worden geïdentificeerd door de registratie van visueel opgeroepene potentialen. Pas tijdens het zakken van de elektrode een kleine positieve druk toe door een lage injectiesnelheid te hanteren om verstopping te voorkomen. Stop de injectie zodra de structuur is bereikt.

Nadat de injectienaald is ingebracht, wordt de blootgestelde cortex bedekt met warme agar om uitdroging te voorkomen. Wacht na de definitieve plaatsing van de elektrode 30 minuten om stabilisatie van het weefsel rondom de elektrode mogelijk te maken. Injecteer vervolgens 400 tot 800 nanoliters van de oplossing met een snelheid van 40 nanoliters per minuut totdat er neuronale activiteit in de superior colliculus wordt geactiveerd; tijdens de injectie van de inhiberende oplossing moet de elektrode een afname in spikes vertonen.

Visueel opgewekte potentialen werden gemeten in de colliculus superior. Na een flits van 300 milliseconden in het contralaterale oog bij injectie van gaba, werd de spiking-activiteit als reactie op een flitsstimulus gedurende 45 tot 60 minuten onderdrukt. Tijdens deze procedure is het belangrijk om tijdens het laden op lekken te controleren en te verifiëren dat de drugsolution ongehinderd door de injectietip stroomt.