Name: Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA In Situ Hybridisatie aan Geplette Chromosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor fluorescentie DNA in situ hybridisatie aan geplette chromosomen. Deze techniek visualiseert heterochromatische sequenties met minimale reagentia en is geschikt voor diverse weefsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Zhaohua Irene Tang in het W. M. Keck Science Department voor het gebruik van haar epifluorescentiemicroscoop en het Werren lab voor het doneren van Nasonia voor dissecties. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) aan AML.

1. Tissue Dissection en Fixatie (60 min) <ol><li> Voor Drosophila hersenen, plaats 3 e instar larven in een druppel 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing). Kies groot 3 e instar larven die actief kruipen uit flesjes of flessen die niet overvol zijn. <ol><li> Gebruik een ultrafijne pincet paar te houden van de mond haken en andere pincet pair te grijpen 2/3 de lengte van het lichaam (Figuur 1A, B) grijpen. Trek de mond haken aan de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en een deel van de larvale spijsverteringskanaal bloot. Gebruik de pincet naar de hersenen en ventrale ganglia scheiden (Figuur 1A, B) van de andere weefsels en in een druppel 1x PBT (fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween) op een plastic Petri schaal. </li></ol></li><li> Voor Nasonia testis dissecties, kiest mannelijke 3-dagen oude poppen (geel lichaam met rode ogen). Man Nasonia hebben kleine vleugel pad lengtes ten opzichte van females tijdens het popstadium (figuur 1C). <ol><li> Houd de pop bovenaan de buik bij de thoracale gebied met een pincet paar en met de andere pincet paar, pak het distale uiteinde van de buik en trek de traan-vormige testes (ze worden omringd door fat lichaam die zachtjes kan worden geschud weg; figuur 1D). Losmaken elke uitwendige lichaamsdelen van de testes, die zal voorkomen dat de juiste kneuzingen, en plaats in een druppel 1x PBT op een plastic Petri plaat. </li></ol></li><li> Voor elk objectglaasje, ontleden totaal vier of vijf weefselmonsters (bv. Drosophila larven hersenen of Nasonia testes). OPMERKING: Meer dan vijf monsters zal leiden tot overvolle kernen en chromosomen. </li><li> Eventueel enkele scheiding van zusterchromatiden in euchromatic gebieden van mitotische chromosomen bereiken, behandelen van het weefsel met een hypotone oplossing overbrengen hersenen van 1x PBT tot een daling van 0,5% natriumcitraat 5-10 (niet meer dan 10) min. OPMERKING: Colchicine (a Antimitoticum) kunnen nuttig voor het verhogen van het aantal mitotische figuren aan metafase 11 zijn. Echter, het gebruik ervan is niet nodig als zeer grote gezonde larven worden, en zelfs ongewenst, omdat het een negatieve invloed heeft op de chromosoom resolutie verspreiden en morfologie. </li><li> Plaats een druppel (~ 20 pi) fixeeroplossing (2,5% paraformaldehyde in 45% azijnzuur) op het oppervlak van een schone Sigmacote behandelde dekglas. OPMERKING: Zorg fixeeroplossing vers voor elke dag van gebruik. Fixatief oplossingen gaande 1,8-3,7% paraformaldehyde in 45% azijnzuur geven de beste resultaten voor FISH. Het gebruik van andere dan de hersenen of testes weefsels, of het aanpassen van dit protocol voor immuno-FISH kan verlangen te experimenteren met verschillende fixatieven (voor een lijst van verschillende fixatieven, zie 12). </li><li> Breng zorgvuldig elk weefselmonster van het ontleden buffer (1x PBT) in de fixatief druppel met ultrafijne pincet, minimizing van de overdracht van het ontleden van buffer in de fixeeroplossing. Plaats de weefselmonsters zodat zij op gelijke afstand van elkaar in het fixeermiddel druppel. Incubeer de weefsels in fixeermiddel gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats een poly-lysine-gecoate slide gezicht voorzichtig naar beneden op het weefsel en dekglas. Druk niet op dit punt, maar in plaats daarvan laat de twee tot licht contact, zodat het dekglas plakt op de onderkant van de dia. Keer de glijbaan zodat het deksel slip is op de top. </li><li> Sandwich de dia / weefsel / dekglas in een opgevouwen stuk filterpapier. Op een stabiele ondergrond, met de duim, drukt zeer stevig recht naar beneden op de locatie direct boven het deksel slip. Wees voorzichtig om te voorkomen dat zijdelingse schuifdeuren van het dekglas (dit zal vegen veroorzaken van het weefsel). </li><li> Dompel de dia / weefsel / dekglas in vloeibare stikstof (zie apparaat in figuur 1E, F), en laat het staan ​​totdat de Stikstof stopt met koken (langer is fine). Verwijder de glijbaan en onmiddellijk snap het deksel slip met een frisse scheermesje door flicking een hoek van het dekglas in een opwaartse richting (geen krassen op de vaste weefsel met het scheermesje). <ol><li> Pre-koeling van de dia / weefsel / dekglas op een blok van droog ijs, dekking slip up, voor 1-2 min voorafgaand aan het onderdompelen in vloeibare stikstof zal helpen voorkomen dat de dia&#39;s van kraken. </li></ol></li><li> Onmiddellijk de dia met weefsel in een pot Coplin gevuld met 100% ethanol bij kamertemperatuur en laten staan ​​gedurende ten minste 5 minuten (deze tijd kan langer indien nodig). OPMERKING: koude 100% ethanol kunnen worden gebruikt. </li><li> Verwijder de dia met weefsel, lont overtollige ethanol met een Kimwipe weg (zonder het aanraken van de vaste weefsel), en laat de schuif aan de lucht drogen gedurende 1 uur. <ol><li> Ga dan naar stap 2 of houden dia droog in de lage luchtvochtigheid of in een verdroging kamer voor weken tot zelfs maanden voor het uitvoeren van de hybridisatie. </li></ol></li></ol> Figuur 1: (A) Een 3 e instar Drosophila larve (rechts), met posities geïndiceerd voor waar aan de mond haken grijpen (aangeduid met *) en 2/3 van de weg naar beneden de larven aan hersenen ontleden; (Links) een schema van een larve een gelijk ontwikkelingsstadium, die de relatieve positie van de hersenen in het larvale weg. (B) De hersenen en ventrale ganglia ontleed een 3e instar Drosophila larve (rechts) en een schema van deze weefsel (links). (C) 3 dagen oude Nasonia pop bij de gele body-rode ogen stadium. (D) een testis paar ontleed van een 3 dagen oude Nasonia mannelijke pop (rechts) met posities aangeeft waar de pop grijpen aan de achterkant van het abdomen (aangegeven met *) en halverwege op het lichaam; (Links) schematische beeltenis van mannelijke en vrouwelijke wasp poppen; mannelijke poppen kunnen worden onderscheiden door vleugels die niet voorbij de sagittale profiel (zwarte pijl), in tegenstelling tot vrouwen die vleugels die zich uitstrekken langs het profiel; de relatieve positie van de testis paar wordt getoond in de mannelijke pop. (E) De inrichting-een reeks paperclips-en (F) methode om dia dompelen in een vat van vloeibare stikstof. Meerdere paperclip strings kan worden gebruikt voor gelijktijdige onderdompeling van meerdere dia. 2. In situ hybridisatie (30 minuten op dag 1, 1 uur, 2,5 uur lange probes op dag 2) <ol><li> Voeg 1 pl (100 ng) van elke probe 20 gl 1,1 x hybridisatiebuffer. Pipet sonde / hybridisatie buffer op het oppervlak van de vaste weefsel (vermijd contact met het weefsel). </li><li> Plaats voorzichtig een dekglaasje direct op de sonde / hybridisatie buffer, en zorg ervoor dat het deksel slip direct wordt gecentreerd over het weefsel. De buffer moet migreren naar the buitenrand van het deksel slip, waardoor er geen luchtbellen. OPMERKING: Kleine bubbels die geen contact met het weefsel hebben geen problemen om de procedure niet opleveren. Verwijder grote luchtbellen door voorzichtig een tipje van de dekglas en voorzichtig laten vallen terug op de dia. </li><li> Plaats de dia / weefsel / dekglas op het oppervlak van een blok voorverwarmd tot 95 ° C (cover slip up). Dek af met een groot stuk aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Laat de schuif incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min. OPMERKING: Een typische warmte blok met gaten voor buizen kan worden omgedraaid om een ​​plat oppervlak waarop de dia / weefsel / dekglas plaatsen bieden. </li><li> Verwijder de glijbaan, laat het iets afkoelen totdat het warm aanvoelt. Wikkelen zorgvuldig een stuk uitgerekt Parafilm rond het dekglas om de vloeistof af te dichten eronder. </li><li> Plaats de gesloten schuif in een vochtige kamer en plaats de kamer in een incubator voorverwarmd tot 30 ° C. Incubeer bij 30 ° C gedurende 4 uur tot overnacht.<ol><li> Maak een vochtige kamer van een lege tip doos of met deksel Tupperware container met vochtige Kimwipes of papieren handdoeken geplaatst op de bodem. OPMERKING: enkelstrengs DNA-oligo-probes werden ontworpen om 28-33 basen theoretische smelttemperatuur (Tm) van 45-47 ° C bereiken. Deze lengte en Tm reeksen weerspiegelen het feit dat veel repetitieve sequenties die we hebben bestudeerd zijn AT-rijk en hebben een zeer lage GC-gehalte dus. Langere probes zullen waarschijnlijk hogere Tm-waarden; Dit kan resulteren in hogere achtergrond hybridisatie bij standaard hybridisatie temperatuur van 30 ° C. Zo kunnen sommige problemen hybridisatie temperaturen gehouden de beste resultaten. Om de beste hybridisatietemperatuur, verhoging (of verlaging) van de temperatuur met 5 ° C vinden, stapsgewijs. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig de Parafilm van de glijbaan en dan verwijder voorzichtig het deksel slip door langzaam te tillen één hoek. Wash de dia drie keer voor elk 15 minuten wassen in 0,1x SSC buffer. Bedek de Coplin pot met aluminiumfolie tijdens het wassen aan het licht blootstelling te minimaliseren. </li><li> Als u geen lange gebiotinyleerde sonde, ga dan naar stap 2.8. <ol><li> Bij gebruik van een lange gebiotinyleerd sonde, droog het gebied rond het weefsel met een Kimwipe, zorg dat het weefsel zich niet aan te raken. Plaats 100 ul van het blokkeren oplossing over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, en zorg ervoor dat het opsluiten luchtbellen te vermijden. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Verwijder voorzichtig het dekglaasje en dep rond het weefsel met een Kimwipe. Pipet 100 ul van rhodamine-avidine verdund 1: 1.000 in SBT over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, de zorg om te voorkomen dat het vangen bubbels. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Verwijder het dekglaasje voorzichtig en was de glijbaan 3 keer gedurende 5 minuten elk in 4x SSCT en dan3 maal gedurende 5 minuten elk in 0,1x SSC. OPMERKING: Dia&#39;s kunnen worden gewassen voor een langere periode van tijd. </li></ol></li><li> Verwijder de glijbaan en dep rond het weefsel met een droge Kimwipe om overtollige buffer te verwijderen (vermijd contact met het weefsel). Plaats de dia weefsel kant naar boven op een donkere plaats voor 10-15 minuten of tot het vocht volledig verdwijnt. </li><li> Pipetteer 11 ul Vectashield fixeermiddel (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool-DAPI) op het weefsel. Plaats een schoon dekglaasje (niet behandeld met Sigmacote) over het middelpunt van het fixeermiddel en de weefsels voorzichtig. Het fixeermiddel moet langzaam naar buiten migreren naar de randen van het dekglas. Opmerking: Als het fixeermiddel niet aan de rand van het dekglas rondom bereiken, wordt een 1-2 pi fixeermiddel worden aangebracht op één positie aan de rand van het dekglas van de benodigde volume te vullen. In dit geval moet u weg te vegen overtollige medium van de glijbaan oppervlak voordatafdichting. </li><li> Dicht de randen van het dekglas met nagellak. Vermijd het schilderen van de nagellak over het weefsel monster. </li><li> Plaats de dia rechtop in een donkere plaats en laat de nagellak droog tot het volledig vaste schijf (meestal 30 min of meer). Op dit punt, beeld het weefsel of bewaar bij -20 ° C gedurende 1 week later beeldvorming. </li></ol> Buffer / Solution Recepten 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH 7,4, H 2 O tot 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H2O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175.3 g NaCl </li><li> 88,2 g Nacitraat </li><li> in 800 ml H2O </li><li> pH 7 H 2 O tot 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0.1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H2O </li></ul> Hybridisatie mix (20 pl, gemodificeerd van 11) <ul><li> 10 pl formamide </li><li> 4 ui 50% dextransulfaat </li><li> 2 pl 20x SSC </li><li> 4 ui H2O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g runderserumalbumine (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7,9 ml H2O </li></ul> Blokkeeroplossing 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H2O </li></ul> Fixatief met paraformaldehyde (1 ml) <ul><li> 393,75 pi H 2 O (water toevoegen als eerste) </li><li> 450 ul ijsazijn </li><li> 156,25 pl 16% paraformaldehyde </li></ul>

<ol><li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
<li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li>
<li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li>
<li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing%3A+computational+challenges+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li>
<li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
<li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële of enige andere belangenconflict hebben.

DNA ISH wordt vaak gebruikt om specifieke sequenties met chromosomen in kaart. We hebben een eenvoudige methode voor DNA-ISH geoptimaliseerd voor een groot aantal kopieën, heterochromatische sequenties beschreven. In plaats van het gebruik wast in een formamide oplossing, wat een vereiste is in andere bestaande DNA-ISH protocollen, plaatsen we weefsel gemonteerde dia&#39;s direct op een voorverwarmd blok aan DNA denatureren. Deze werkwijze omzeilt het gebruik van grote hoeveelheden formamide. Een cruciale stap voor het ...

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Probes om enkele kopie gebieden in euchromatin kan worden opgewekt door een handvol benaderingen, zoals nick-translatie of end-labeling van lange DNA-producten 1,2 en de opname van deoxygenin (DIG) -attached nucleotiden en hun herkenning door allerlei -groep geconjugeerde antilichamen 1-3. Visualisatie van euchromatic sequenties in enkele of enkele kopie nummer vereist het gebruik van één enkele, grote probes met een hoge specifieke activiteit of een cocktail meerdere kleinere probes die gezamenlijk versterken signaal. In tegenstelling, zeer repetitieve sequenties gevonden in heterochromatine, zoals satelliet-DNA&#39;s, zijn gemakkelijker doelwitten voor DNA-ISH, omdat ze normaal bestaan ​​als tientallen tot duizenden herhalingen geclusterd in één chromosoom regio bekend als blokken. Transposons kunnen ookgevonden bij hoge kopie nummers op verschillende chromosomale loci 2. In deze gevallen kan één probes met een lage specifieke activiteit effectief labelen heterochromatic sequenties vanwege hun hybridisatie op meerdere plaatsen. Probes repeterende sequenties kunnen worden gesynthetiseerd commercieel als korte oligonucleotiden (30-50 bp) en chemisch geconjugeerd met een van meerdere verschillende fluorescerende groepen. In kaart brengen van repetitieve sequenties binnen heterochromatinevorming met behulp van genoom-sequencing technologie is moeilijk te wijten aan uitdagingen in de bouw steigers binnen zeer repetitief satelliet blokken 4-6,7. Momenteel ISH staat als de meest effectieve manier van het in kaart brengen van deze sequenties op de sub-chromosoom niveau. Deze strategie is belangrijk voor het in kaart brengen van grote aantallen repetitieve sequenties die worden ontdekt door aanhoudende genoom en transcriptoom sequencing studies. De efficiëntie en het gemak van het in kaart brengen repetitieve sequenties on-slide gemonteerd chromosomen zou worden greAtly versterkt door een vereenvoudigde protocol voor DNA ISH. Bijvoorbeeld, bestaande protocollen voor DNA-ISH betrekken meerdere wasbeurten van gehybridiseerd weefsels in formamide oplossing 2,8, dus aanzienlijk toe te voegen aan de vereiste tijd voor het in kaart brengen van sequenties en ook de productie van grote hoeveelheden chemisch afval voor deze dure reagens. Hier beschrijven we een gewijzigde DNA ISH methode de noodzaak van formamide wassingen omzeilt en gebruikt elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia. Deze methode werd oorspronkelijk ontworpen voor de snelle kartering van sterk herhaalde DNA-sequenties in heterochromatic gebieden van Drosophila larven neuroblasts met commercieel gesynthetiseerde oligo&#39;s die zijn geconjugeerd met fluorescentie kleurstoffen. Deze methode werkt ook voor het in kaart brengen repetitieve sequenties door grotere probes gesynthetiseerd via andere middelen 9,10 en in meerdere verschillende weefsels en chromosoom types. Daarnaast kan deze methode gebruikt worden om euchromatic sequenties in kaart met behulp van langere of multiple, korte sondes binnen de euchromatic sequentie van belang.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafijne pincetten (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm dekglasjes</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-behandeld door 15 seconden onderdompelen, afdrogen en alle sporen van Sigmacote wegvegen zodat het dekglas helder is</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffinewaspapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsblok met thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Droge incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veshaaiers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vochtigheidskamer</td><td></td><td></td><td>lege pipettipbox of Tupperware, bekleed met vochtige papierhanddoeken of Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin-potten</td><td></td><td></td><td>met gleufjes voor de slides</td></tr><tr><td>Alumiiniumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td></td><td></td><td>helder of gekleurd</td></tr><tr><td>P20 micropipet en plastic punten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standaard metalen paperclips aan elkaar gelinkt om een ketting te vormen</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>16% EM-kwaliteit paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemisch zuiver</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercieel gesynthetiseerde, fluorescerend gelabelde oligo's</td></tr><tr><td>Lange biotinylering probe</td><td>Invitrogen; Alternatieve stappen 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>bijv. nick vertaald en biotinyleerd met BioNick van Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternatieve stappen 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>voor detectie van lange biotinylering probe</td></tr><tr><td>Hybridisatiebuffer</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>saline-natriumcitraat + Tween</td></tr><tr><td>0,1x SSC</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>saline-natriumcitraat</td></tr><tr><td>Blokkaloplossing</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>SSC, bovien serumalbumine, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>fosfaat-gebufferde zoutoplossing + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td></tr><tr><td>Hypotone oplossing</td><td></td><td></td><td>0,5% natriumcitraat in H2O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium met DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eenvoudige methode voor fluorescentie dna<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie aan geplette chromosomen

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Deze aanpak is vooral effectief bij het in kaart brengen van zeer repetitieve sequenties te heterochromatische regio&#39;s, waar computationele benaderingen geconfronteerd onbetaalbaar uitdagingen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor DNA-ISH dat formamide wast die standaard stappen in andere DNA-ISH protocollen zijn omzeilt. Ons protocol is geoptimaliseerd voor hybridisatie met korte enkelstrengs DNA probes die fluorescente kleurstoffen, die effectief markeren repeterende DNA sequenties binnen heterochromatic chromosomale regio&#39;s in een aantal verschillende insecten weefsel dragen. Echter, kunnen aanvragen worden uitgebreid om te gebruiken met grotere sondes en visualisatie van enkele kopie (niet-repeterende) DNA-sequenties. We tonen deze methode in kaart brengen van verschillende repetitieve sequenties te geplet chromosomen van Drosophila melanogaster neurale cellen en Nasoniavitripennis spermatocyten. We tonen hybridisatie patronen voor zowel kleine, commercieel gesynthetiseerde probes en voor een grotere probe voor vergelijking. Deze procedure maakt gebruik van eenvoudige laboratoriumbenodigdheden en reagentia, en is ideaal voor onderzoekers die weinig ervaring hebben met het uitvoeren van DNA-ISH.

Om deze methode te demonstreren we gehybridiseerd een reeks kleine commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden die chemisch zijn gemodificeerd met fluorescente conjugaten (figuur 2) en een langere gebiotinyleerd probe (gemaakt door nick translatie van een PCR-product Figuur 2B) om chromosomen van verschillende weefsels soorten (zie tabel 1). De doelwitsequenties satelliet opgenomen herhalingen gelegen in pericentromerische (heterochromatische) regio&#39;s van mitotisc...

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA in situ hybridisatie te gebruiken om heterochromatische sequenties op mitotische chromosomen in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van Drosophila-larven in het derde stadium, of een ander relevant weefsel, te dissekeren. De tweede stap is het fixeren van het weefsel op een dekglas.Vervolgens wordt het weefsel platgedrukt tussen het dekglas en een objectglas. Om de chromosomen voor te bereiden op hybridisatie, is de laatste stap het hybridiseren van korte gesynthetiseerde oligo-probes aan het platgedrukte weefsel. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van sequenties aan te tonen die complementair zijn aan de oligo-probes op de chromosomen.Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden is de eenvoud. De meeste andere hybridisatiemethoden voor chromosomen en C2 maken gebruik van wasstappen met grote hoeveelheden formamide, wat duur en omslachtig kan zijn. Onze methode vereist geen wasstappen met formamide, waardoor het een goedkopere, schonere en snellere techniek is.Hoewel deze methode een eenvoudige manier biedt om sequenties zichtbaar in kaart te

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genoomassemblages op basis van massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn doorgaans sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan genoomassemblages potentieel verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie en imaging die de doorvoer van de ontwikkeling van de fysieke kaart aanzienlijk verhogen.

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Circulating tumor cells (CTC) isolation and characterization from the blood of cancer patients is a type of non-invasive liquid biopsy and associated with relapse and disease progression. This video describes the technique of DNA fluorescence-in-situ-hybridization (DNA FISH) on CTCs captured on a medical wire, to study a specific gene of interest.

3D DNA FISH: A Technique to Locate a Specific Gene on a Chromosome

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Het combineren van DNA-halopreparaten met fluorescentie in situ hybridisatie maakt een analyse met hoge resolutie van genomische interacties met het nucleoskelet mogelijk. Bijgevoegd genoom leidt tot gehybridiseerde fluorescerende signalen die zich in de resterende geëxtraheerde kernen bevinden, terwijl het niet-gehechte genoom zich in de halo van DNA rond de resterende kernen bevindt.

Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

Leer een eenvoudige methode voor fluorescentie DNA in situ hybridisatie aan geplette chromosomen. Deze techniek visualiseert heterochromatische sequenties met minimale reagentia en is geschikt voor diverse weefsels.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA

Meer video's verkennen