Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA In Situ Hybridisatie aan Geplette Chromosomen
6 januari 2015
Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.
Het algemene doel van deze procedure is om DNA in situ hybridisatie te gebruiken om heterochromatische sequenties in kaart te brengen op mitotische chromosomen. Dit wordt bereikt door eerst hersenen van derde instar drosophila larven, of een ander weefsel van belang, te dissecteren. De tweede stap is om het weefsel op een dekselglas te fixeren.
Vervolgens wordt het weefsel tussen het dekselglas en een glaasje geplet. Om de chromosomen voor hybridisatie voor te bereiden, is de laatste stap om korte gesynthetiseerde oligo-probes te hybridiseren met het geplette weefsel. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van sequenties complementair aan de oligo-probes op de chromosomen te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze methode boven bestaande methoden is de eenvoud. De meeste andere chromosoom- en C twee hybridisatiemethoden omvatten wasbeurten met grote hoeveelheden formamide, wat duur en rommelig kan zijn. Onze methode vereist geen form IDE wasbeurten, waardoor het een goedkopere, schonere en snellere techniek is.
Hoewel deze methode een eenvoudige manier biedt om sequenties zichtbaar in kaart te brengen op de somatische chromosomen van drosophila hersenen, kan het ook worden gebruikt om sequenties op andere typen chromosomen van verschillende weefsels in de verschillende organismen in kaart te brengen. Voor elke plaat die gemaakt moet worden, bereid vier of vijf weefsels voor, maar niet meer voor hersendissecties. Begin met het selecteren van wanderende derde instar larven en verzamel ze in een druppel van één XPBS.
Kies flesjes om uit te verzamelen die niet overbevolkt zijn. Gebruik onder de dissectiemicroscoop ultrafijne pincetten om de mondhaken vast te pakken en een ander paar om twee derde van de lengte van het lichaam vast te grijpen. Trek dan voorzichtig aan de mondhaken om de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en delen van het spijsverteringskanaal bloot te leggen.
Vervolgens tweeze de hersenen en ventrale ganglia weg van de andere weefsels en breng ze over in een druppel van één XPBT op een plastic plaat. Voor nasia testis dissecties verzamel mannelijke drie dagen oude pupa. Drie dagen oude pupa hebben gele lichamen en rode ogen.
Degenen met kleinere vleugelkussens zijn mannelijk. Pak de pupa bij de bovenkant van het abdomen dicht bij de thoracale regio met één paar pincetten en met een tweede paar pincetten. Pak het zeer distale uiteinde van het abdomen vast en trek de druppelvormige testes eruit.
Ze worden omringd door vetlichamen die voorzichtig kunnen worden weggeschudden, loskoppel eventuele buitenste lichaamsdelen van de testes, wat een goede pletten en het overbrengen van de testes naar een druppel van één XPBT op een schone plaat zal voorkomen. Zodra alle weefsels zijn verzameld, behandel ze met een hypotone oplossing om de scheiding van zusterchromatiden te verbeteren. In de e chromatische regio's, breng de weefsels over naar een druppel van 0,5% natriumcitraat gedurende 10 minuten.
Om dit effect te krijgen, wordt colchicine niet aanbevolen omdat het artefacten in de chromosoommorfologie kan veroorzaken. Fixeer nu de weefsels met ultrafijne pincetten. Breng ze over in een 20 microliter druppel vers gemaakt 2,5%PFA in 45% azijnzuur op een schone sigma coat behandeld dekglas. Ruim de weefsels gelijkmatig uit in het fixeermiddel en incubeer ze gedurende vier minuten bij kamertemperatuur en ga dan verder met het pletten van de dekglasjes. Begin door een polylysine gecoat glaasje lichtjes met de kant naar beneden op het weefsel en dekglas te plaatsen.
Laat het dekglas op de onderkant van het glaasje plakken zonder te drukken.Behandeling. Het bedekken van dekglasjes met sigma coat helpt om ervoor te zorgen dat het geplette weefsel op het glaasje blijft na het verwijderen van het dekglas. Echter, onregelmatig kan het weefsel aan het dekglas blijven gehecht.
Tijdens deze stap raden we aan om meerdere weefselpletten uit te voeren. Draai nu het glaasje om en plaats het in een gevouwen stuk dik papier. Druk vervolgens op een stabiel oppervlak met de duim heel stevig recht naar beneden op het dekglas.
Druk niet op een manier dat het glaasje verschuift, anders zal het weefsel worden uitgesmeerd. Zeer stevig drukken resulteert normaal gesproken in mooi opgeloste chromosomen binnen het geplettlde weefsel. Echter, soms kunt u variabiliteit in chromosoomkwaliteit tegenkomen, zoals onvolledige, gepletten of gefragmenteerde chromosomen.
Dus nogmaals, we raden aan om twee of drie herhalingen van weefselpletters uit te voeren. Breng de assemblage naar een blok ijs voor een paar minuten, dompel het vervolgens in vloeibare stikstof tot de stikstof stopt met koken of langer. Nadat u de plaat direct voordat het weefsel ontdooit hebt verwijderd, gebruikt u een nieuw scheermesje om een hoekje van het dekglas omhoog te klappen. Verwijder het dus.
Wees voorzichtig om het weefsel niet te krassen. Plaats vervolgens snel het glaasje in een Coplin-pot gevuld met 100% ethanol en laat het minimaal vijf minuten weken. Verwijder het glaasje, veeg het overtollige ethanol zonder het weefsel aan te raken weg en laat het glaasje een uur lang luchtdrogen.
Glaazen kunnen vervolgens weken tot maanden worden bewaard in een uitdrogingskamer. Begin met het toevoegen van 100 nanogram van elke sonde aan 20 microliter van 1,1 x hybridisatiebuffer voor een 22 microliter oplossing van één x hybridisatiebuffer. Pipetteer vervolgens het mengsel op het gefixeerde weefsel, laat het weefsel onaangeroerd en breng voorzichtig een dekglas aan.
Een kleine luchtbel die niet in contact komt met het weefsel, zal geen problemen opleveren, maar meer bubbels vereisen het opnieuw aanbrengen van het dekglas. Zet het glaasje op de platte kant van een 95 graden Celsius hitteblok en bedek het met folie. Wacht vijf minuten, waarin u de vochtigheidskamer kunt voorbereiden door natte papieren handdoeken
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op chromosomen te visualiseren. De techniek is aanpasbaar voor verschillende weefselsoorten en sondelengtes, met behulp van fluorescentiemicroscopie voor detectie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Celbiologie
Achtergrond
- DNA in situ hybridisatie is een krachtige techniek voor het bestuderen van chromosomaal structuren.
- Heterochromatine speelt een cruciale rol in genexpressie en chromosomaal stabiliteit.
- Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van specifieke DNA-sequenties mogelijk.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende weefsels, waardoor de veelzijdigheid wordt vergroot.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige methode te ontwikkelen voor het in kaart brengen van heterochromatische sequenties.
- Om deze sequenties op mitotische chromosomen te visualiseren.
- Om een protocol te bieden dat minimale reagentia vereist.
Gebruikte methoden
- Dissectie van hersenen van Drosophila-larven in het derde stadium of andere weefsels.
- Fixatie van het weefsel op een dekglas.
- Verspreiden van het weefsel tussen een dekglas en een glasplaat.
- Hybridisatie van korte gesynthetiseerde oligo sondes op de bereide chromosomen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van heterochromatische sequenties op chromosomen.
- Demonstratie van de veelzijdigheid van de methode met verschillende sondelengtes.
- Effectief gebruik van fluorescentiemicroscopie voor lokalisatie.
- Minimale reagentiavereiste verhoogt de toegankelijkheid voor onderzoekers.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is efficiënt voor het bestuderen van heterochromatine.
- Het kan worden aangepast voor verschillende experimentele omstandigheden.
- Deze techniek draagt bij aan het begrip van chromosomaal dynamica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This streamlined DNA ISH method enables rapid, cost-effective mapping of repetitive DNA sequences to heterochromatic regions, addressing a key challenge in target validation where computational approaches fail. By eliminating formamide washes, the protocol reduces technical complexity and reagent burden, supporting early-stage mechanistic de-risking of chromosomal targets. The approach is particularly valuable for phenotypic screening workflows requiring reliable visualization of satellite repeats in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of repetitive DNA sequences in heterochromatic regions, supporting target validation in genomic regions inaccessible to computational methods.
- Operational Value: Eliminates formamide wash steps, reducing protocol time, cost, and technical variability for high-throughput target interrogation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for repetitive sequence localization, enabling assay standardization across insect tissue types.
- Operational Value: Uses simple laboratory supplies and short fluorescent oligo probes, facilitating assay scalability and reuse in screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system analysis by mapping sequences in Drosophila neural cells and Nasonia spermatocytes, providing mechanistic insight into chromosomal organization.
- Operational Value: Adaptable to larger probes and single-copy sequences, allowing translational extension to non-repetitive targets in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing of repetitive elements and enabling progression to lead identification through chromosomal target de-risking.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis interrogation of heterochromatic regions by providing direct visualization of repeat localization on mitotic chromosomes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence outputs that support reliable compound or genetic perturbation screening in chromosomal contexts.
- Analytics: Generates measurable hybridization signals (e.g., multi-megabase pair blocks) that allow comparative analysis across conditions or genetic backgrounds.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation by visualizing targets in disease-relevant tissues such as neural cells and germline cells.
- Enterprise Reuse: Requires only basic lab equipment (dissection tools, cover slips, hybridization buffer, fluorescence microscope), positioning it as a reusable platform across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterochromatic regions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through elimination of variable formamide wash steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering reagent costs and technical training barriers for target validation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets located in repetitive, heterochromatic genomic regions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection (e.g., Drosophila larval brains, insect testes) and chromosome preparation techniques.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and basic molecular biology reagents (fluorescent oligos, hybridization buffer, SSC buffers).
- Necessitates standardization of squashing pressure and incubation times to ensure consistent chromosome resolution across users.
- Adaptation to larger probes or single-copy sequences may require optimization of hybridization temperature and blocking steps.
- Practical limitations include potential variability in chromosome quality (incomplete or fragmented squashes), mitigated by performing replicate tissue squashes.
