Name: Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA In Situ Hybridisatie aan Geplette Chromosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor fluorescentie DNA in situ hybridisatie aan geplette chromosomen. Deze techniek visualiseert heterochromatische sequenties met minimale reagentia en is geschikt voor diverse weefsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Zhaohua Irene Tang in het W. M. Keck Science Department voor het gebruik van haar epifluorescentiemicroscoop en het Werren lab voor het doneren van Nasonia voor dissecties. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) aan AML.

1. Tissue Dissection en Fixatie (60 min) <ol><li> Voor Drosophila hersenen, plaats 3 e instar larven in een druppel 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing). Kies groot 3 e instar larven die actief kruipen uit flesjes of flessen die niet overvol zijn. <ol><li> Gebruik een ultrafijne pincet paar te houden van de mond haken en andere pincet pair te grijpen 2/3 de lengte van het lichaam (Figuur 1A, B) grijpen. Trek de mond haken aan de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en een deel van de larvale spijsverteringskanaal bloot. Gebruik de pincet naar de hersenen en ventrale ganglia scheiden (Figuur 1A, B) van de andere weefsels en in een druppel 1x PBT (fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween) op een plastic Petri schaal. </li></ol></li><li> Voor Nasonia testis dissecties, kiest mannelijke 3-dagen oude poppen (geel lichaam met rode ogen). Man Nasonia hebben kleine vleugel pad lengtes ten opzichte van females tijdens het popstadium (figuur 1C). <ol><li> Houd de pop bovenaan de buik bij de thoracale gebied met een pincet paar en met de andere pincet paar, pak het distale uiteinde van de buik en trek de traan-vormige testes (ze worden omringd door fat lichaam die zachtjes kan worden geschud weg; figuur 1D). Losmaken elke uitwendige lichaamsdelen van de testes, die zal voorkomen dat de juiste kneuzingen, en plaats in een druppel 1x PBT op een plastic Petri plaat. </li></ol></li><li> Voor elk objectglaasje, ontleden totaal vier of vijf weefselmonsters (bv. Drosophila larven hersenen of Nasonia testes). OPMERKING: Meer dan vijf monsters zal leiden tot overvolle kernen en chromosomen. </li><li> Eventueel enkele scheiding van zusterchromatiden in euchromatic gebieden van mitotische chromosomen bereiken, behandelen van het weefsel met een hypotone oplossing overbrengen hersenen van 1x PBT tot een daling van 0,5% natriumcitraat 5-10 (niet meer dan 10) min. OPMERKING: Colchicine (a Antimitoticum) kunnen nuttig voor het verhogen van het aantal mitotische figuren aan metafase 11 zijn. Echter, het gebruik ervan is niet nodig als zeer grote gezonde larven worden, en zelfs ongewenst, omdat het een negatieve invloed heeft op de chromosoom resolutie verspreiden en morfologie. </li><li> Plaats een druppel (~ 20 pi) fixeeroplossing (2,5% paraformaldehyde in 45% azijnzuur) op het oppervlak van een schone Sigmacote behandelde dekglas. OPMERKING: Zorg fixeeroplossing vers voor elke dag van gebruik. Fixatief oplossingen gaande 1,8-3,7% paraformaldehyde in 45% azijnzuur geven de beste resultaten voor FISH. Het gebruik van andere dan de hersenen of testes weefsels, of het aanpassen van dit protocol voor immuno-FISH kan verlangen te experimenteren met verschillende fixatieven (voor een lijst van verschillende fixatieven, zie 12). </li><li> Breng zorgvuldig elk weefselmonster van het ontleden buffer (1x PBT) in de fixatief druppel met ultrafijne pincet, minimizing van de overdracht van het ontleden van buffer in de fixeeroplossing. Plaats de weefselmonsters zodat zij op gelijke afstand van elkaar in het fixeermiddel druppel. Incubeer de weefsels in fixeermiddel gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats een poly-lysine-gecoate slide gezicht voorzichtig naar beneden op het weefsel en dekglas. Druk niet op dit punt, maar in plaats daarvan laat de twee tot licht contact, zodat het dekglas plakt op de onderkant van de dia. Keer de glijbaan zodat het deksel slip is op de top. </li><li> Sandwich de dia / weefsel / dekglas in een opgevouwen stuk filterpapier. Op een stabiele ondergrond, met de duim, drukt zeer stevig recht naar beneden op de locatie direct boven het deksel slip. Wees voorzichtig om te voorkomen dat zijdelingse schuifdeuren van het dekglas (dit zal vegen veroorzaken van het weefsel). </li><li> Dompel de dia / weefsel / dekglas in vloeibare stikstof (zie apparaat in figuur 1E, F), en laat het staan ​​totdat de Stikstof stopt met koken (langer is fine). Verwijder de glijbaan en onmiddellijk snap het deksel slip met een frisse scheermesje door flicking een hoek van het dekglas in een opwaartse richting (geen krassen op de vaste weefsel met het scheermesje). <ol><li> Pre-koeling van de dia / weefsel / dekglas op een blok van droog ijs, dekking slip up, voor 1-2 min voorafgaand aan het onderdompelen in vloeibare stikstof zal helpen voorkomen dat de dia&#39;s van kraken. </li></ol></li><li> Onmiddellijk de dia met weefsel in een pot Coplin gevuld met 100% ethanol bij kamertemperatuur en laten staan ​​gedurende ten minste 5 minuten (deze tijd kan langer indien nodig). OPMERKING: koude 100% ethanol kunnen worden gebruikt. </li><li> Verwijder de dia met weefsel, lont overtollige ethanol met een Kimwipe weg (zonder het aanraken van de vaste weefsel), en laat de schuif aan de lucht drogen gedurende 1 uur. <ol><li> Ga dan naar stap 2 of houden dia droog in de lage luchtvochtigheid of in een verdroging kamer voor weken tot zelfs maanden voor het uitvoeren van de hybridisatie. </li></ol></li></ol> Figuur 1: (A) Een 3 e instar Drosophila larve (rechts), met posities geïndiceerd voor waar aan de mond haken grijpen (aangeduid met *) en 2/3 van de weg naar beneden de larven aan hersenen ontleden; (Links) een schema van een larve een gelijk ontwikkelingsstadium, die de relatieve positie van de hersenen in het larvale weg. (B) De hersenen en ventrale ganglia ontleed een 3e instar Drosophila larve (rechts) en een schema van deze weefsel (links). (C) 3 dagen oude Nasonia pop bij de gele body-rode ogen stadium. (D) een testis paar ontleed van een 3 dagen oude Nasonia mannelijke pop (rechts) met posities aangeeft waar de pop grijpen aan de achterkant van het abdomen (aangegeven met *) en halverwege op het lichaam; (Links) schematische beeltenis van mannelijke en vrouwelijke wasp poppen; mannelijke poppen kunnen worden onderscheiden door vleugels die niet voorbij de sagittale profiel (zwarte pijl), in tegenstelling tot vrouwen die vleugels die zich uitstrekken langs het profiel; de relatieve positie van de testis paar wordt getoond in de mannelijke pop. (E) De inrichting-een reeks paperclips-en (F) methode om dia dompelen in een vat van vloeibare stikstof. Meerdere paperclip strings kan worden gebruikt voor gelijktijdige onderdompeling van meerdere dia. 2. In situ hybridisatie (30 minuten op dag 1, 1 uur, 2,5 uur lange probes op dag 2) <ol><li> Voeg 1 pl (100 ng) van elke probe 20 gl 1,1 x hybridisatiebuffer. Pipet sonde / hybridisatie buffer op het oppervlak van de vaste weefsel (vermijd contact met het weefsel). </li><li> Plaats voorzichtig een dekglaasje direct op de sonde / hybridisatie buffer, en zorg ervoor dat het deksel slip direct wordt gecentreerd over het weefsel. De buffer moet migreren naar the buitenrand van het deksel slip, waardoor er geen luchtbellen. OPMERKING: Kleine bubbels die geen contact met het weefsel hebben geen problemen om de procedure niet opleveren. Verwijder grote luchtbellen door voorzichtig een tipje van de dekglas en voorzichtig laten vallen terug op de dia. </li><li> Plaats de dia / weefsel / dekglas op het oppervlak van een blok voorverwarmd tot 95 ° C (cover slip up). Dek af met een groot stuk aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Laat de schuif incubeer bij 95 ° C gedurende 5 min. OPMERKING: Een typische warmte blok met gaten voor buizen kan worden omgedraaid om een ​​plat oppervlak waarop de dia / weefsel / dekglas plaatsen bieden. </li><li> Verwijder de glijbaan, laat het iets afkoelen totdat het warm aanvoelt. Wikkelen zorgvuldig een stuk uitgerekt Parafilm rond het dekglas om de vloeistof af te dichten eronder. </li><li> Plaats de gesloten schuif in een vochtige kamer en plaats de kamer in een incubator voorverwarmd tot 30 ° C. Incubeer bij 30 ° C gedurende 4 uur tot overnacht.<ol><li> Maak een vochtige kamer van een lege tip doos of met deksel Tupperware container met vochtige Kimwipes of papieren handdoeken geplaatst op de bodem. OPMERKING: enkelstrengs DNA-oligo-probes werden ontworpen om 28-33 basen theoretische smelttemperatuur (Tm) van 45-47 ° C bereiken. Deze lengte en Tm reeksen weerspiegelen het feit dat veel repetitieve sequenties die we hebben bestudeerd zijn AT-rijk en hebben een zeer lage GC-gehalte dus. Langere probes zullen waarschijnlijk hogere Tm-waarden; Dit kan resulteren in hogere achtergrond hybridisatie bij standaard hybridisatie temperatuur van 30 ° C. Zo kunnen sommige problemen hybridisatie temperaturen gehouden de beste resultaten. Om de beste hybridisatietemperatuur, verhoging (of verlaging) van de temperatuur met 5 ° C vinden, stapsgewijs. </li></ol></li><li> Verwijder voorzichtig de Parafilm van de glijbaan en dan verwijder voorzichtig het deksel slip door langzaam te tillen één hoek. Wash de dia drie keer voor elk 15 minuten wassen in 0,1x SSC buffer. Bedek de Coplin pot met aluminiumfolie tijdens het wassen aan het licht blootstelling te minimaliseren. </li><li> Als u geen lange gebiotinyleerde sonde, ga dan naar stap 2.8. <ol><li> Bij gebruik van een lange gebiotinyleerd sonde, droog het gebied rond het weefsel met een Kimwipe, zorg dat het weefsel zich niet aan te raken. Plaats 100 ul van het blokkeren oplossing over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, en zorg ervoor dat het opsluiten luchtbellen te vermijden. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Verwijder voorzichtig het dekglaasje en dep rond het weefsel met een Kimwipe. Pipet 100 ul van rhodamine-avidine verdund 1: 1.000 in SBT over het weefsel en bedek voorzichtig met een dekglaasje, de zorg om te voorkomen dat het vangen bubbels. Wikkel het glijden over het dekglaasje met Parafilm en plaats bij 37 ° C gedurende 30 min. </li><li> Verwijder het dekglaasje voorzichtig en was de glijbaan 3 keer gedurende 5 minuten elk in 4x SSCT en dan3 maal gedurende 5 minuten elk in 0,1x SSC. OPMERKING: Dia&#39;s kunnen worden gewassen voor een langere periode van tijd. </li></ol></li><li> Verwijder de glijbaan en dep rond het weefsel met een droge Kimwipe om overtollige buffer te verwijderen (vermijd contact met het weefsel). Plaats de dia weefsel kant naar boven op een donkere plaats voor 10-15 minuten of tot het vocht volledig verdwijnt. </li><li> Pipetteer 11 ul Vectashield fixeermiddel (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool-DAPI) op het weefsel. Plaats een schoon dekglaasje (niet behandeld met Sigmacote) over het middelpunt van het fixeermiddel en de weefsels voorzichtig. Het fixeermiddel moet langzaam naar buiten migreren naar de randen van het dekglas. Opmerking: Als het fixeermiddel niet aan de rand van het dekglas rondom bereiken, wordt een 1-2 pi fixeermiddel worden aangebracht op één positie aan de rand van het dekglas van de benodigde volume te vullen. In dit geval moet u weg te vegen overtollige medium van de glijbaan oppervlak voordatafdichting. </li><li> Dicht de randen van het dekglas met nagellak. Vermijd het schilderen van de nagellak over het weefsel monster. </li><li> Plaats de dia rechtop in een donkere plaats en laat de nagellak droog tot het volledig vaste schijf (meestal 30 min of meer). Op dit punt, beeld het weefsel of bewaar bij -20 ° C gedurende 1 week later beeldvorming. </li></ol> Buffer / Solution Recepten 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH 7,4, H 2 O tot 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H2O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175.3 g NaCl </li><li> 88,2 g Nacitraat </li><li> in 800 ml H2O </li><li> pH 7 H 2 O tot 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0.1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H2O </li></ul> Hybridisatie mix (20 pl, gemodificeerd van 11) <ul><li> 10 pl formamide </li><li> 4 ui 50% dextransulfaat </li><li> 2 pl 20x SSC </li><li> 4 ui H2O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g runderserumalbumine (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7,9 ml H2O </li></ul> Blokkeeroplossing 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H2O </li></ul> Fixatief met paraformaldehyde (1 ml) <ul><li> 393,75 pi H 2 O (water toevoegen als eerste) </li><li> 450 ul ijsazijn </li><li> 156,25 pl 16% paraformaldehyde </li></ul>

<ol><li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
<li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li>
<li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li>
<li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li>
<li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing%3A+computational+challenges+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li>
<li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li>
<li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li>
<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële of enige andere belangenconflict hebben.

DNA ISH wordt vaak gebruikt om specifieke sequenties met chromosomen in kaart. We hebben een eenvoudige methode voor DNA-ISH geoptimaliseerd voor een groot aantal kopieën, heterochromatische sequenties beschreven. In plaats van het gebruik wast in een formamide oplossing, wat een vereiste is in andere bestaande DNA-ISH protocollen, plaatsen we weefsel gemonteerde dia&#39;s direct op een voorverwarmd blok aan DNA denatureren. Deze werkwijze omzeilt het gebruik van grote hoeveelheden formamide. Een cruciale stap voor het ...

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Probes om enkele kopie gebieden in euchromatin kan worden opgewekt door een handvol benaderingen, zoals nick-translatie of end-labeling van lange DNA-producten 1,2 en de opname van deoxygenin (DIG) -attached nucleotiden en hun herkenning door allerlei -groep geconjugeerde antilichamen 1-3. Visualisatie van euchromatic sequenties in enkele of enkele kopie nummer vereist het gebruik van één enkele, grote probes met een hoge specifieke activiteit of een cocktail meerdere kleinere probes die gezamenlijk versterken signaal. In tegenstelling, zeer repetitieve sequenties gevonden in heterochromatine, zoals satelliet-DNA&#39;s, zijn gemakkelijker doelwitten voor DNA-ISH, omdat ze normaal bestaan ​​als tientallen tot duizenden herhalingen geclusterd in één chromosoom regio bekend als blokken. Transposons kunnen ookgevonden bij hoge kopie nummers op verschillende chromosomale loci 2. In deze gevallen kan één probes met een lage specifieke activiteit effectief labelen heterochromatic sequenties vanwege hun hybridisatie op meerdere plaatsen. Probes repeterende sequenties kunnen worden gesynthetiseerd commercieel als korte oligonucleotiden (30-50 bp) en chemisch geconjugeerd met een van meerdere verschillende fluorescerende groepen. In kaart brengen van repetitieve sequenties binnen heterochromatinevorming met behulp van genoom-sequencing technologie is moeilijk te wijten aan uitdagingen in de bouw steigers binnen zeer repetitief satelliet blokken 4-6,7. Momenteel ISH staat als de meest effectieve manier van het in kaart brengen van deze sequenties op de sub-chromosoom niveau. Deze strategie is belangrijk voor het in kaart brengen van grote aantallen repetitieve sequenties die worden ontdekt door aanhoudende genoom en transcriptoom sequencing studies. De efficiëntie en het gemak van het in kaart brengen repetitieve sequenties on-slide gemonteerd chromosomen zou worden greAtly versterkt door een vereenvoudigde protocol voor DNA ISH. Bijvoorbeeld, bestaande protocollen voor DNA-ISH betrekken meerdere wasbeurten van gehybridiseerd weefsels in formamide oplossing 2,8, dus aanzienlijk toe te voegen aan de vereiste tijd voor het in kaart brengen van sequenties en ook de productie van grote hoeveelheden chemisch afval voor deze dure reagens. Hier beschrijven we een gewijzigde DNA ISH methode de noodzaak van formamide wassingen omzeilt en gebruikt elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia. Deze methode werd oorspronkelijk ontworpen voor de snelle kartering van sterk herhaalde DNA-sequenties in heterochromatic gebieden van Drosophila larven neuroblasts met commercieel gesynthetiseerde oligo&#39;s die zijn geconjugeerd met fluorescentie kleurstoffen. Deze methode werkt ook voor het in kaart brengen repetitieve sequenties door grotere probes gesynthetiseerd via andere middelen 9,10 en in meerdere verschillende weefsels en chromosoom types. Daarnaast kan deze methode gebruikt worden om euchromatic sequenties in kaart met behulp van langere of multiple, korte sondes binnen de euchromatic sequentie van belang.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafijne pincetten (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm dekglasjes</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-behandeld door 15 seconden onderdompelen, afdrogen en alle sporen van Sigmacote wegvegen zodat het dekglas helder is</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffinewaspapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsblok met thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Droge incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veshaaiers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vochtigheidskamer</td><td></td><td></td><td>lege pipettipbox of Tupperware, bekleed met vochtige papierhanddoeken of Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin-potten</td><td></td><td></td><td>met gleufjes voor de slides</td></tr><tr><td>Alumiiniumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nailpolish</td><td></td><td></td><td>helder of gekleurd</td></tr><tr><td>P20 micropipet en plastic punten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standaard metalen paperclips aan elkaar gelinkt om een ketting te vormen</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>16% EM-kwaliteit paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemisch zuiver</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercieel gesynthetiseerde, fluorescerend gelabelde oligo's</td></tr><tr><td>Lange biotinylering probe</td><td>Invitrogen; Alternatieve stappen 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>bijv. nick vertaald en biotinyleerd met BioNick van Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternatieve stappen 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>voor detectie van lange biotinylering probe</td></tr><tr><td>Hybridisatiebuffer</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>saline-natriumcitraat + Tween</td></tr><tr><td>0,1x SSC</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>saline-natriumcitraat</td></tr><tr><td>Blokkaloplossing</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>SSC, bovien serumalbumine, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recept hierboven</td><td></td><td>fosfaat-gebufferde zoutoplossing + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td></tr><tr><td>Hypotone oplossing</td><td></td><td></td><td>0,5% natriumcitraat in H2O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield montagemedium met DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eenvoudige methode voor fluorescentie dna<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie aan geplette chromosomen

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridisatie (ISH DNA) is een veelgebruikte werkwijze voor het toewijzen sequenties specifiek chromosoom regio. Deze aanpak is vooral effectief bij het in kaart brengen van zeer repetitieve sequenties te heterochromatische regio&#39;s, waar computationele benaderingen geconfronteerd onbetaalbaar uitdagingen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor DNA-ISH dat formamide wast die standaard stappen in andere DNA-ISH protocollen zijn omzeilt. Ons protocol is geoptimaliseerd voor hybridisatie met korte enkelstrengs DNA probes die fluorescente kleurstoffen, die effectief markeren repeterende DNA sequenties binnen heterochromatic chromosomale regio&#39;s in een aantal verschillende insecten weefsel dragen. Echter, kunnen aanvragen worden uitgebreid om te gebruiken met grotere sondes en visualisatie van enkele kopie (niet-repeterende) DNA-sequenties. We tonen deze methode in kaart brengen van verschillende repetitieve sequenties te geplet chromosomen van Drosophila melanogaster neurale cellen en Nasoniavitripennis spermatocyten. We tonen hybridisatie patronen voor zowel kleine, commercieel gesynthetiseerde probes en voor een grotere probe voor vergelijking. Deze procedure maakt gebruik van eenvoudige laboratoriumbenodigdheden en reagentia, en is ideaal voor onderzoekers die weinig ervaring hebben met het uitvoeren van DNA-ISH.

Om deze methode te demonstreren we gehybridiseerd een reeks kleine commercieel gesynthetiseerde oligonucleotiden die chemisch zijn gemodificeerd met fluorescente conjugaten (figuur 2) en een langere gebiotinyleerd probe (gemaakt door nick translatie van een PCR-product Figuur 2B) om chromosomen van verschillende weefsels soorten (zie tabel 1). De doelwitsequenties satelliet opgenomen herhalingen gelegen in pericentromerische (heterochromatische) regio&#39;s van mitotisc...

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Het algemene doel van deze procedure is om DNA in situ hybridisatie te gebruiken om heterochromatische sequenties op mitotische chromosomen in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van Drosophila-larven in het derde stadium, of een ander relevant weefsel, te dissekeren. De tweede stap is het fixeren van het weefsel op een dekglas.Vervolgens wordt het weefsel platgedrukt tussen het dekglas en een objectglas. Om de chromosomen voor te bereiden op hybridisatie, is de laatste stap het hybridiseren van korte gesynthetiseerde oligo-probes aan het platgedrukte weefsel. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de lokalisatie van sequenties aan te tonen die complementair zijn aan de oligo-probes op de chromosomen.Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden is de eenvoud. De meeste andere hybridisatiemethoden voor chromosomen en C2 maken gebruik van wasstappen met grote hoeveelheden formamide, wat duur en omslachtig kan zijn. Onze methode vereist geen wasstappen met formamide, waardoor het een goedkopere, schonere en snellere techniek is.Hoewel deze methode een eenvoudige manier biedt om sequenties zichtbaar in kaart te brengen op de somatische chromosomen van drosophila-hersenen, kan deze ook worden gebruikt om sequenties op andere typen chromosomen uit verschillende weefsels in diverse organismen in kaart te brengen. Bereid voor elk te maken preparaat vier of vijf weefsels voor, maar niet meer bij hersendissecties. Begin met het selecteren van dwalende larven in het derde stadium en verzamel deze in een druppel 1x PBS.Kies vials voor collectie die niet overvol zijn. Gebruik onder de dissectiescoop ultrafijne pincetten om de mondhaken vast te pakken en een tweede paar om tweederde van de lichaamslengte vast te pakken. Trek vervolgens voorzichtig aan de mondhaken om de hersenen, ventrale ganglia, speekselklieren en delen van het spijsverteringskanaal bloot te leggen.Verwijder vervolgens met een pincet de hersenen en de ventrale ganglia van de overige weefsels en breng deze over in een druppel XPBT op een plastic plaat. Verzamel voor dissecties van de testikels van nasia mannelijke puy van drie dagen oud. Puyen van drie dagen oud hebben gele lichamen en rode ogen.Degenen met kleinere vleugelknoppen zijn mannetjes. Pak de pop aan de bovenzijde van het abdomen nabij de thoracale regio vast met één pincet en met een tweede pincet. Pak het uiterste distale uiteinde van het abdomen vast en trek vervolgens de traanvormige testes eruit.Ze zijn omgeven door vetlichamen die voorzichtig kunnen worden weggeschud. Verwijder alle externe lichaamsdelen van de testes, omdat deze een correcte squashing-procedure in de weg staan, en breng de testes over naar een druppel XPBT op een schone plaat. Zodra alle weefsels zijn verzameld, worden deze behandeld met een hypotone oplossing om de scheiding van zusterchromatiden te verbeteren. Voor de e-chromatische regio's worden de weefsels gedurende 10 minuten overgebracht naar een druppel 0,5% natriumcitraat.Om dit effect te bereiken wordt colchicine niet aanbevolen, omdat dit artefacten in de chromosoommorfologie kan veroorzaken. Fixeer nu de weefsels met ultrafijne pincetten. Breng ze over naar een druppel van 20 µL vers bereide 2,5% PFA in 45% azijnzuur op een schoon, sigma-coat behandeld dekglas. Verdeel de weefsels gelijkmatig in het fixatief en incubeer ze vier minuten bij kamertemperatuur. Ga vervolgens over tot het platdrukken (squashing) van de dekglazen; begin hiermee door een polylysine-gecoat objectglas voorzichtig met de zijde voor het monster naar beneden op het weefsel en het dekglas te plaatsen.Laat het dekglas zonder te drukken aan de onderzijde van het objectglas hechten. Het behandelen van dekglas met sigma coat helpt om ervoor te zorgen dat het geplette weefsel op het objectglas blijft nadat het dekglas is verwijderd. In zeldzame gevallen kan het weefsel echter aan het dekglas blijven kleven.Tijdens deze stap raden wij aan om herhaalde weefselpreparaten (squashes) te maken. Draai het objectglas nu om en plaats het in een gevouwen stuk dik papier. Druk vervolgens op een stabiel oppervlak met de duim zeer stevig recht naar beneden op het dekglas.Druk niet op een manier waardoor het dekglas verschuift, anders zal het weefsel uitgesmeerd worden. Zeer stevig drukken resulteert normaal gesproken in mooi gedefinieerde chromosomen binnen het geplette weefsel. Af en toe kunt u echter variabiliteit in de chromosoomkwaliteit tegenkomen, zoals onvolledige, geplette of gefragmenteerde chromosomen.Daarom bevelen we aan om twee of drie replica's van de weefsel-squashes uit te voeren. Plaats de assemblage enkele minuten op een blok ijs en dompel deze vervolgens onder in vloeibare stikstof totdat de stikstof stopt met koken of langer. Verwijder de slide vlak voordat het weefsel ontdooit en gebruik een nieuw scheermesje om een hoek van het dekglas omhoog te tikken, zodat dit verwijderd wordt.Zorg ervoor dat het weefsel niet wordt bekrast. Plaats de objectglas vervolgens snel in een Coplin-pot gevuld met 100% ethanol en laat dit gedurende ten minste vijf minuten weken. Verwijder het objectglas, dep het overtollige ethanol weg zonder het weefsel aan te raken en laat het objectglas een uur aan de lucht drogen.De objectglazen kunnen vervolgens gedurende weken tot maanden worden bewaard in een desiccatiekamer. Begin met het toevoegen van 100 nanogram van elke probe aan 20 microliters van 1,1 x hybridisatiebuffer voor een oplossing van 22 microliters eenvoudige hybridisatiebuffer. Pipetteer vervolgens het mengsel op het gefixeerde weefsel, waarbij het weefsel ongemoeid blijft, en breng voorzichtig een dekglas aan.Een kleine luchtbel die het weefsel niet raakt, vormt geen probleem, maar bij meer bellen moet het dekglas opnieuw worden aangebracht. Plaats het preparaat op de vlakke zijde van een hitteblok van 95 °C en dek het af met folie. Wacht vijf minuten; gedurende deze tijd kunt u de bevochtigingskamer voorbereiden door natte papieren handdoekjes in een tipdoos te plaatsen.Verwijder vervolgens het preparaatglas. Wikkel het glas zorgvuldig in uitgerekte parafilm en breng het over naar een bevochtigingskamer, bestaande uit een vochtige handdoek in een tipbox. Incubeer het preparaatglas in de kamer gedurende vier uur tot overnight bij 30 °C. Deze temperatuur werkt goed voor probes met een laag GC-gehalte, maar voor probes met een hoger GC-gehalte kan het nodig zijn om de hybridisatietemperaturen te optimaliseren.Verwijder na de incubatie voorzichtig de parafilm en til het dekglas langzaam aan één hoek op. Was de slide vervolgens drie keer in 0,1 XSSC-buffer gedurende 15 minuten per wasbeurt. Bedek de pot tijdens het wassen met folie om de blootstelling aan licht te minimaliseren.Voeg bij lange gebiotinyleerde probes rod domine avadon toe en was voordat u verdergaat. Droog vervolgens het gebied rondom het weefsel en bedek het weefsel met 100 µL blokkeringsoplossing. Breng daarna voorzichtig een nieuw dekglas aan zonder luchtbellen te laten ontstaan.Wikkel de dia opnieuw in met parafilm. Incubeer de dia vervolgens 30 minuten bij 37 °C. Verwijder na de incubatie het dekglas en dep rondom het weefsel met een Что-doekje.Breng vervolgens 100 µL van een 1:1000 verdunning van rumine avadon in SBT aan op het weefsel. Bedek, wikkel en incubeer de slide daarna op dezelfde wijze als bij het blok. Verwijder ten slotte voorzichtig het dekglas en was de slide.Was drie keer met 4 x SSC T, gevolgd door drie keer wassen met 0,1 X SSC. Elke wasstap moet minimaal vijf minuten duren. Ga verder met het protocol en droog de coupes door het overtollige buffer weg te blotten zonder het weefsel aan te raken.Plaats het objectglas vervolgens met de weefselzijde naar boven op een donkere plaats gedurende 10 tot 15 minuten of totdat het vocht volledig is verdampt. Monteer het objectglas nu met 11 µL vector shield met DPI en laat dit voorzichtig zakken op een niet-sigma-gecoat dekglas. Als het medium de randen niet bereikt, breng dan langs de rand nog enkele µL medium aan en veeg het teveel weg.Zegel vervolgens het dekglas af met nagellak en bewaar de slide rechtopstaand op een donkere plaats terwijl de nagellak droogt, wat gewoonlijk ten minste een half uur duurt. Bewaar de slide vervolgens bij minus 20 °C voor maximaal een week en beeld het weefsel zo snel mogelijk af. Een set kleine, commercieel gesynthetiseerde oligos met fluorescente conjugaten en een langere biotinylatiesonde gemaakt via Nick Translation werden allemaal gehybridiseerd met chromosomen van verschillende weefseltypes.Met behulp van de beschreven methodologie herkende de probe voor de 359 base paar satellietherhaling van Drosophila Melanogaster een groot blok van meerdere megabaseparen op de x en een veel kleiner gebied op chromosoom drie. Een langere probe tegen de responder-satelliet detecteerde herhalingsblokken bestaande uit relatief lage herhalingsaantallen van ongeveer 700. Hiermee maakt deze methode de visualisatie van zeer kleine satellietblokken mogelijk.Wanneer de duur van de behandeling met de hypotone oplossing werd verdubbeld naar 10 minuten, nam de scheiding van de zusterchromatiden toe. Deze procedure kan worden gekoppeld aan andere methoden, zoals antilichaamkleuring, om vragen te beantwoorden zoals of bepaalde chromatine-eiwitten gelokaliseerd zijn op specifieke sequenties.

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genoomassemblages op basis van massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn doorgaans sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan genoomassemblages potentieel verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie en imaging die de doorvoer van de ontwikkeling van de fysieke kaart aanzienlijk verhogen.

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Circulating tumor cells (CTC) isolation and characterization from the blood of cancer patients is a type of non-invasive liquid biopsy and associated with relapse and disease progression. This video describes the technique of DNA fluorescence-in-situ-hybridization (DNA FISH) on CTCs captured on a medical wire, to study a specific gene of interest.

3D DNA FISH: A Technique to Locate a Specific Gene on a Chromosome

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.

Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Het combineren van DNA-halopreparaten met fluorescentie in situ hybridisatie maakt een analyse met hoge resolutie van genomische interacties met het nucleoskelet mogelijk. Bijgevoegd genoom leidt tot gehybridiseerde fluorescerende signalen die zich in de resterende geëxtraheerde kernen bevinden, terwijl het niet-gehechte genoom zich in de halo van DNA rond de resterende kernen bevindt.

Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

Leer een eenvoudige methode voor fluorescentie DNA in situ hybridisatie aan geplette chromosomen. Deze techniek visualiseert heterochromatische sequenties met minimale reagentia en is geschikt voor diverse weefsels.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA

Meer video's verkennen