Name: Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer polysome profiling voor selectieve mRNA-translatie in zoogdiercellen met sucrosegradiënt-ultracentrifugatie. Deze methode identificeert mRNA's onder stress en onthult celbiologische aanpassingsmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar aan de voormalige en huidige leden van het laboratorium, in het bijzonder Urszula Liwak, voor de kritische discussie over polysoomprofileringsprotocollen en het delen van gegevens. Dit werk werd ondersteund door operationele subsidies van de Canadese instituten voor Gezondheidsonderzoek, de Cancer Research Society en de Nationale Raad voor Wetenschappelijk en Technologisch Onderzoek van Canada aan MH. MDF werd ondersteund door de Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoraalbeurs en de Ontario Graduate Scholarship, en dit werk maakt deel uit van haar Ph.D. proefschrift.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Polysomale profilering is een techniek die het mogelijk maakt voor de kwantificering van de stand van de vertaling van specifieke transcripten in verschillende behandelingsomstandigheden. Het is een zeer eenvoudige techniek in principe nog verscheidene stappen uitgevoerd, waarvan sommige kritisch voor het produceren van goede polysoom profielen vereist. De belangrijkste stappen zijn: 1) met RNase-vrij chemicaliën en plasticware, 2) het bereiden goed sucrose gradiënten (in onze ervaring een 10-50% sucrose gradiënten beste werken voor efficiënt oplossen 40 / 60S subeenheden en mRNAs met gebonden ribosomen) en 3 ) met cellen die exponentieel groeien en niet meer dan 80% confluent om de hoogste vertaling vangen. Deze laatste stap moet rekening worden gehouden bij het doen van lange cel behandelingen, zoals gentherapie knockdown of overexpressie, waardoor het aantal cellen plaat een functie van hoeveel de cellen confluent worden bij het eindpunt is. In de resultaten presented hier, polysoom profiel analyse is een belangrijk instrument voor de beoordeling PDCD4 rol in de vertaling regulering van de IRES-herbergen mRNA XIAP en Bcl-xL 12. Het feit dat we geen verandering in de algemene polysoom profielen op PDCD4 knock-down (Figuur 1B) heeft gehouden, konden we concluderen dat PDCD4 niet aantasten wereldwijde cellulaire vertaling onder de voorwaarden van het experiment. We vervolgens gebruikte RT-qPCR analyse om de verdeling van de XIAP en Bcl-xL mRNA in cellen behandeld met PDCD4 of controle siRNA bepalen. qPCR is een voorkeursmethode voor het analyseren polysoom profielen, in tegenstelling tot standaard RT-PCR of Northern blotting, omdat het zorgt voor een kwantitatieve plaats semi-kwantitatieve analyse van mRNA distributie en voor het detecteren van subtiele veranderingen in translationele efficiency tussen behandelingen. Met deze techniek konden we aantonen dat de verdeling van de XIAP en Bcl-xL mRNA (uitgedrukt als percentage van totaal doelwit-mRNA in de gradient) was significant verschoven in zwaar polyribosomen (mRNAs met een groot aantal ribosomen verbonden hen) na PDCD4 neerhalen (figuur 1D, E), hetgeen wijst op een toename vertaling van deze mRNAs. Dit werd verder bevestigd door een toename XIAP en Bcl-xL eiwit niveaus maar niet in de steady-state-RNA (Figuur 1F, G). Belangrijk is dat de polysoom verdeling van de niet-IRES variant van XIAP onveranderd tussen behandelde en onbehandelde cellen (figuur 1C). Als alternatief zou translationele efficiëntie worden gepresenteerd als een verhouding van mRNA gehalte in polysomen (fracties meestal 5 tot 10) versus monosomes (gewoonlijk fracties 2-4) 14. Het gebruik van controles in de hele protocol is belangrijk bij het valideren van elke polysoom profileren resultaat, zoals pieken waargenomen uit metingen van de absorptie bij 254 nm kan niet op zichzelf worden toegeschreven aan ribosomaal RNA (detergents, zoals Triton X-100 sterk absorberen in dit gebied van het spectrum en kunnen 40 / 60S pieken bij de top van de gradiënt verduisteren). Blanco verlopen zonder lysaat en / of lysaat buffer moeten worden uitgevoerd om de relatieve bijdrage van de buffers aan de absorptie te bepalen op 254 nm. Artefact hogere orde structuren kan leiden tot foutieve interpretaties van polysomen waar er in feite geen (bijvoorbeeld &quot;pseudo-polysomen&quot; 20). Sekwestrerende magnesium (gebruikt in de procedure 80S ribosomen stabiliseren) met tweewaardige kationen chelator EDTA toegevoegd aan lysaten en de gradiënt buffer (20 mM gedurende 15 minuten) wordt de scheiding van het ribosoom veroorzaken in zijn samenstellende kleine (40S) en grote (60S ) subeenheden. Dus als absorptie pieken opgenomen bij 260 nm inderdaad polysomen, EDTA behandeling het profiel zodat een maximum wordt waargenomen boven in verloop dat overeenkomt met vrij mRNA en ribosomaal eenheden instorten (data niet getoond). Samenvallendmet-EDTA veroorzaakte ineenstorting van het profiel, alle van de specifieke doelen van qPCR geanalyseerd moet nu gevonden worden op de top van de helling. Het aantal ribosomen verbonden met een mRNA is niet altijd een indicatie van hoe efficiënt dat specifieke mRNA wordt vertaald. Inderdaad, er zijn specifieke contexten waarin actieve vertaling op polysomen raakt vastgelopen 21,22 die de lezer bewust van moet zijn. Bepalen of transcripten actief betrokken bij de vertaling werktuig worden uitgevoerd door a) het behandelen van het monster met puromycine, die in tegenstelling EDTA veroorzaakt &#39;run-off&#39; ribosomen die actief translokatie over een mRNA, of b) het behandelen van het monster met homoharringtonine die translocatie van alleen de eerste ribosoom bij de start codon remt, waardoor opnieuw &#39;run-off&#39; van een downstream translocerende ribosomen. Het gebruik van mRNA voor qPCR analyse is ook kritisch. De Selectie van transcripten die niet worden beïnvloed door verschillende behandelingsomstandigheden zoals sommige housekeeping genen (GAPDH, actine, tubuline, nucleoline), ribosomale mRNA (18S, Rpl13a) of in dit geval de niet-IRES variant van de XIAP IRES is belangrijk verifiëren of de behandeling het effect op de vertaling is specifiek of gegeneraliseerd. Deze mRNA kan worden gebruikt om de verdeling van de geanalyseerde mRNA zoals hier gedaan normaliseren (XIAP en Bcl-xL mRNA werden genormaliseerd tot GAPDH mRNA en uitgedrukt als percentage van het totale mRNA gehalte vertegenwoordigd door de som van mRNA gehalte in elke fractie ) of als alternatief, kan doelstellingen en controle mRNA&#39;s worden uitgedrukt in absolute waarden en afzonderlijk weergegeven. qPCR analyse van de invoer lysaten (gewoonlijk 10% van het totale volume) is een stap die voor de controle van specifiek mRNA. Idealiter dient het mRNA gehalte van een specifiek transcript in de input lysaat vergelijkbaar met de som van mRNA gehalte in alle 10 fracties geanalyseerd worden. EindelijkEen optionele stap om te controleren voor de fenol: chloroform-extractie wordt iedere polysoom fractie piek bij een in vitro getranscribeerd reporter mRNA (zoals CAT, chlooramfenicol acetyltransferase), die vervolgens zullen worden gekwantificeerd door qPCR en kan zelfs worden gebruikt voor het normaliseren gegevens 14. Zoals bij elke techniek, de polysoom profilering presenteert een aantal beperkingen. Het feit dat gewoonlijk minimaal 10 fracties (subtielere verschuivingen in translatie efficiëntie noodzakelijk kunnen 20 of meer) worden verzameld om mooie polysoom distributies maakt deze stap beperkt, in die zin dat slechts een maximum van 4 monsters kunnen worden tegelijkertijd geanalyseerd kunnen gemakkelijk hanteren RNA extractie en qPCR analyse van 40 monsters en 4 invoerregelaars tegelijk. De steekproefomvang kan gemakkelijk oplopen met hoeveel afschriften moeten worden geanalyseerd en hoeveel qPCR repliceert te doen, en dit kan kostbaar zijn. Een andere beperking van een qPCR-gebaseerde polysomale profilering van eenNALYSE is dat het alleen kan worden uitgevoerd op een kandidaat benadering (waarbij de transcripten te analyseren tevoren niet bekend) en kan niet worden toegepast genoom-brede analyse van de vertaling. Echter, aan het begin van de 21 ste eeuw, begonnen de onderzoekers om hun polysomale RNA ondervragen op een genomische niveau met behulp van DNA microarrays 15 en meer recent met de next-generation sequencing 16,17. In deze krachtige benadering wordt polysomale profilering uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol, behalve dat in plaats van het uitvoeren van qPCR analyse van individuele fracties, monosomes fracties (gewoonlijk fractie 2-4) en Polysomen fracties (gewoonlijk fracties) worden samengevoegd en variaties in wereldwijde vertaling geanalyseerde door DNA microarray of hele genoom RNA sequencing. Vandaar dat met deze aanpak, is het mogelijk om te beoordelen alle mRNA&#39;s waarvan de distributie verschuift van polysomen naar monosomes (afname in vertaling) of vice-versa (toename in vertaling) op een specifieke traktatiement. Validatie en kwantificatie van mRNA polysomen verdeling kan gedaan worden met qPCR. Een nog krachtiger gebruik van het polysomale profilering principe ribosoom profilering. Verder hoge doorvoer uitbreiding van deze techniek werd onlangs dat maakt gelijktijdige controle van honderden polysoom fracties 23. Dit verschaft een duidelijk voordeel bij sonderen translationele efficiëntie van mutant verzamelingen of grootschalige RNAi screens. Ribosoom profilering is een techniek die gebruik maakt van next generation sequencing om RNA-fragmenten beschermd door ribosomen (ribosoom voetafdrukken) betrokken bij de eiwitsynthese 24,25 in kaart. In deze techniek kan ribosoom translocatie worden geremd met cycloheximide (reversibel) of emetine (irreversibele) gevolgd door cellysis en RNase digestie een populatie van ribosoom voetafdrukken opleveren. Ribosomen zijn verrijkt, totaal RNA wordt geïsoleerd en verontreinigende ribosomale en mitochondriale ribosomale RNA wordt verwijderd.RNA voetafdrukken van ongeveer 26-28 nucleotiden zijn geïsoleerde, reverse getranscribeerd, omgezet in een cDNA-bibliotheek en de sequentie 26. In tegenstelling tot standaard polysoom profilering, deze aanpak niet alleen identificeert specifieke mRNA&#39;s die translationeel worden gereguleerd, maar levert ook mRNA-specifieke informatie op codon resolutie, zoals de exacte bezetting en de dichtheid van ribosomen langs een specifieke transcript. Dit is vooral van belang voor mRNA&#39;s met specifieke vormen van vertalingen, zoals IRES-herbergen mRNA&#39;s, omdat het meer informatie over waar op het transcript ribosoom-recruitment plaatsvindt kon geven.

Regulering van eiwitsynthese (translatie) is een belangrijk cellulair proces dat nauw verbonden is met cellulaire overleving. Gezien het feit dat de vertaling verbruikt meer dan 50% van de energie cel, is het niet verwonderlijk dat de vertaling goed is geregeld en dat verstoringen in de vertaling niet goed verdragen. Omgekeerd, zijn vele afwijkende cellulaire processen vereisen dat de vertaling machines en vertaling uitgang (dwz proteoom) moeten worden aangepast. Dit is vaak het geval in diverse stressrespons en ziektetoestanden en is waarschijnlijk het best geïllustreerd in kanker. Een belangrijk voordeel van translationele controle het vermogen van cellen om snel herprogrammeren het eiwit output in respons op verschillende externe en interne triggers, waardoor fine tuning mechanisme tips het evenwicht tussen celoverleving en dood 1. Twee aspecten van translationeel controle zijn bijzonder interessant; begrip van de aard van de regulerende mechanism (s) en controle-elementen die het mogelijk maakt specifieke translatie en identificatie van specifieke mRNA&#39;s en hun eiwitproducten die deelnemen aan de cellulaire respons op de specifieke trigger die selectief vertaling opgewekt in de eerste plaats. Polysoom profilering is een techniek die effectieve studie van beide processen mogelijk maakt. De algemene doelstelling van de polysoom profilering techniek is om te studeren en te kwantificeren De vertaling staat van specifieke mRNA&#39;s onder verschillende cellulaire condities. Het principe van de techniek is het mRNA translatie vangen door &#39;&#39; bevriezen &#39;&#39; actief vertalen van ribosomen op verschillende transcripties en scheiden de resulterende polyribosomen door ultracentrifugatie op een sucrose gradiënt, waardoor een onderscheid tussen zeer vertaalde transcripts (door meerdere ribosomen gebonden) en slecht vertaald die (één of twee ribosomen gebonden). In dit protocol, het antibioticum cycloheximide dat bindt aan de60S ribosomale subunit en blokkeert de afgifte van gedeacetyleerde tRNA van het ribosoom E site 2, wordt gebruikt om ribosoom translocatie te remmen en kraam ribosomen vertalen mRNA. Echter, andere blokkerende middelen zoals emetine dat ook blokkeert translatie verlenging 3, kan worden gebruikt. Anders dan de western blotting en 35S-methionine labeling technieken die de uiteindelijke uitvoer van het vertaalproces meten polysoom profilering heeft het voordeel meten ribosomen associatie met actief-vertaald mRNA, waardoor een meer gedetailleerde studie van vertaalmechanismen onder verschillende omstandigheden. Derhalve kan de methode gemakkelijk worden aangepast om specifiek bestuderen verschillende modi vertaling 4-6, eiwitten factoren betrokken bij regulatie vertaling 7-9, stress omstandigheden die eiwitsynthese 1,10,11 of de effecten van mRNA structuren zoals IRES of stroomopwaarts open reading frames op eiwit synthESIS 12-14. Tegenwoordig polysoom profileren toepassingen zelfs ruimer met het gebruik van DNA microarrays 15 of next-generation sequencing 16,17 tot polysomen-geassocieerde mRNA te analyseren.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automated gradient maker</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Density gradient fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Bestaande uit: buis doorsteeksysteem,&nbsp; peristaltische pomp, UA-6 Detector met 254 en 280 nm filters en Foxy R1 Fractiecollector</td></tr><tr><td>WinDaq data acquisition software</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td></tr><tr><td>Pollyallomer ultracentrifugebuisjes (voor SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrije 2-ml centrifugebuisjes (dolfijnen neus)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrije 2-ml centrifugebuisjes (platte bodem)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (nucleases-vrij)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. Opnieuw opgelost in DMSO en bewaar bij -80C voor langdurige opslag. Let op: TOXIC! Kan irritatie van de luchtwegen en de huid veroorzaken. Draag een masker bij het wegen.</td></tr><tr><td>Natriumchloride (nucleases-vrij)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (nucleases-vrij)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nucleases-vrij)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Let op: TOXIC! Kan irritatie van de luchtwegen en de huid veroorzaken</td></tr><tr><td>Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase inactivatie oplossing</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (met IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Let op: TOXIC! Kan irritatie van de luchtwegen, evenals irritatie en corrosie van de huid veroorzaken</td></tr></tbody></table>

beoordeling van selectieve mrna vertaling in zoogdiercellen door polysoom profiling

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulatie van de eiwitsynthese is een belangrijk controlepunt in cellulaire respons op stress. In het bijzonder werden discreet RNA regulerende elementen getoond om selectieve translatie van specifieke mRNA&#39;s die coderen voor eiwitten typisch benodigd voor een bepaalde stressrespons. Identificatie van deze mRNAs, evenals de karakterisering van regulerende mechanismen die selectieve vertaling is bij het front van moleculaire biologie enige tijd. Polysoom profilering is een hoeksteen methode in deze studies. Het doel van polysoom profilering is om mRNA translatie vangen door het immobiliseren actief vertalen van ribosomen op verschillende transcripties en scheiden de resulterende polyribosomen door ultracentrifugatie op een sucrose gradiënt, waardoor een onderscheid tussen zeer vertaalde transcripts en slecht vertaald Ones. Deze kunnen vervolgens verder worden gekarakteriseerd door traditionele biochemische en moleculair biologische methoden. Belangrijker nog, een combinatie van polysome profilering met high throughput genomische benadering zorgt voor een grootschalige analyse van translationele regulatie.

We hebben recent beschreven een nieuwe rol van de tumor suppressor PDCD4 als een selectieve remmer vertaling van IRES-herbergen mRNAs coderend apoptotische remmers XIAP en Bcl-xL 12. Polysoom profilering was een belangrijke techniek om de specifieke rol van PDCD4 in IRES-gemedieerde translatie tonen. HEK293 cellen werden transient getransfecteerd om endogene niveaus van PDCD4 (Figuur 1A) afbreken en vervolgens onderworpen aan profiel analyse polysoom. We observeerden dat het verminderen van niveaus PDCD4 geen ongunstige wereldwijde cellulaire translatie, zoals beoordeeld door gebrek van veranderingen in het polysoom profiel bij vergelijking siCTRL en siPDCD4 behandelde cellen (Figuur 1B). Evenzo polysoom distributie van niet-IRES variant van XIAP 19 onveranderd tussen behandelde en onbehandelde cellen (figuur 1C). Daarentegen polysoom verdeling van de twee IRES-herbergen mRNAs, XIAP en Bcl-xL werd significant veranderd. Aangezien PDCD4 de verdeling van deze twee mRNA wordt verschoven in zwaar ribopolysomes (figuur 1D, E). Aangezien dit niet wordt gekenmerkt door veranderingen in steady-state niveaus van XIAP en Bcl-xL mRNA (Figuur 1F) Deze resultaten demonstreren verbeterde vertaling van XIAP en Bcl-xL in cellen met verminderde PDCD4 niveaus, die verder werd bevestigd door Western blotting (Figuur 1G). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figuur 1:. Polysoom profilering identificeert PDCD4 als selectieve remmer van XIAP en Bcl-xL vertaling (A) HEK293 cellen werden behandeld met siRNA PDCD4 of control (CTRL), niet-targeting siRNA, gelyseerd en onderworpen aan Western blot analyse met anti-PDCD4 en anti-nucleoline antilichamen verifiëren mate van PDCD4 Knock-down. (B) PDCD4 werd neergeslagen als in (A) encellysaten werden onderworpen aan profilering polysoom. Vertegenwoordiger polysoom profiel wordt weergegeven in het bovenste paneel; verdeling van de XIAP niet-IRES (C), Bcl-xL (D), en XIAP IRES (E) mRNAs opzichte van die van GAPDH wordt weergegeven als het percentage van de totale mRNA (% mRNA) in elke fractie. (F) Steady -State mRNA niveaus werden gemeten met RT-qPCR in PDCD4 siRNA of besturing (CTRL) siRNA behandelde cellen. (G) De lysaten van (A) werden ook onderworpen aan Western blot analyse met anti-XIAP, anti-Bcl-xL, en anti-nucleoline antilichamen. (NB. De gegevens in figuur 1 werden oorspronkelijk gepubliceerd in 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om onderscheid te maken tussen sterk en zwak vertaalde mRNA's door de immobilisatie en scheiding van polyribosomen. Dit wordt bereikt door eerst cycloheximide aan de cellen toe te voegen om de ribosoomtranslocatie en RNA-translatie te remmen. In een tweede stap worden lysaten van de behandelde cellen op een sucrosegradiënt geladen en geultracentrifugeerd om de opgeslagen polyribosomen op basis van hun massa's te scheiden.Vervolgens wordt de gradiënt verdeeld in gelijke fracties om in de laatste stap de sterk en zwak vertaalde transcripten te scheiden. R-T-Q-P-C-R wordt gebruikt om de aanwezigheid van de mRNA's van belang binnen elke fractie aan te tonen. Uiteindelijk kan ribosoomprofilering worden gebruikt om veranderingen in zowel de globale als de specifieke translatie van mRNA als reactie op verschillende fysiologische en pathofysiologische stressfactoren te detecteren.PolyOne-profilering kan kernvragen beantwoorden in de moleculaire biologie en celbiologie, zoals welke mRNA's worden geselecteerd en vertaald tijdens S-stress, en hoe dit cellen in staat stelt zich aan deze omstandigheden aan te passen. De demonstratie van deze procedure wordt uitgevoerd door een promovendus in het laboratorium. Om een automatische gradiëntmaker te gebruiken voor het bereiden van een sucrosegradiënt, begint u met het inschakelen van de gradiëntmaker en het waterpas stellen van de plaat die de gradiënten zal bevatten; zodra de plaat waterpas staat, klikt u op voltooid.Om vervolgens het gradiëntprogramma te selecteren, opent u het grad-menu en selecteert u 'list'. Klik op SW 41 en scrol vervolgens door de lijst totdat het programma '10 to 50%gradient 11 steps' in beeld is en druk op 'Use'. Plaats daarna een SW 41 conische ultracentrifugebuis in het markeerblok en gebruik de meegeleverde fijne buismarkeerpen om een lijn op de buis te trekken langs de bovenste trede van het blok.Plaats de buisjes in een passend rek op een stabiel oppervlak en bevestig vervolgens de twee meegeleverde canules aan twee spuiten van 10 milliliter. Pipetteer warm gedestilleerd water met RNAs in activeringsoplossing een paar keer op en neer om de spuiten te spoelen. Vul na het verwijderen van alle resten water een van de spuiten met 10% sucrose plus cyclo heide en breng de canule aan in de bodem van de ultracentrifugebuis.Dispense de oplossing voorzichtig totdat deze net voorbij de markering op de buis komt. Let er hierbij op dat er geen luchtbellen ontstaan. Vul vervolgens de andere spuit met 50% sucrose plus cyclo heide en veeg eventueel overtollige vloeistof van de buis af met een doekje.Gebruik de canule om de 50% sucrose-oplossing voorzichtig in de buis aan te brengen. Stop wanneer de oplossing ter hoogte van de markering staat en verwijder de canule vervolgens snel en soepel. De 10% sucrose-oplossing moet stijgen tot er een meniscus aan de bovenkant van de buis wordt gevormd. Kantel daarna de ultracentrifugeebuis lichtjes om eventuele luchtbellen te verplaatsen en breng de dop aan; gebruik een micropipet om eventueel overtollige vloeistof uit het reservoir van de dop te verwijderen.Plaats de buisjes op de gradiëntmaker en druk vervolgens op de startknop. Let op dat de plaat onder de opgegeven hoek zal kantelen. Wacht vijf seconden, waarna de rotaties om de gradiënt te vormen zullen beginnen.Na ongeveer twee minuten zal het apparaat piepen om aan te geven dat de gradiëntvorming is voltooid. Verplaats de buisjes voorzichtig naar een rek en verwijder snel de doppen met een opwaartse beweging om te voorkomen dat de gradiënt wordt verstoord. Laad vervolgens voorzichtig 260 units van het eerder bereide cellysaat op elke sucrosegradiënt en centrifugeer de buisjes gedurende anderhalf uur bij 260.343 ×g en vier graden Celsius in een ultracentrifuge.Om het instrument voor het gradiëntfractioneringssysteem in te stellen, begint u met het inschakelen van de spectrofotometer. Selecteer vervolgens twee keer het map-icoon en daarna twee keer de retourpijl om terug te keren naar het startscherm en om de fractiecollector in te stellen op de PolyZone-methode, zodat het ventiel van de fractiecollector op afval is ingesteld. Klik op de pijl die naar het prullenbak-icoon wijst en plaats vervolgens een MIA-kolf van 250 milliliter met gedestilleerd water onder de afvalopvangbuis.Select nu de volgende instellingen op de chartrecorder: de gevoeligheidsknop op 'lamp and optics', het ruisfilter op 1,5, de piekseparator op 'uit' en de papsnelheid op 30 centimeter per uur. Zet de baseline-instelknop bovenop de spectrofotometerunit op de maximale stand. Plaats vervolgens de spuit en de cilinder in de pomp en gebruik de meegeleverde schroeven en inbussleutel om deze vast te zetten.Gebruik het rev-commando op hoge snelheid om de spuit te vullen met de chase-oplossing. Plaats vervolgens de pomp in de rechtopstaande positie en gebruik het forward-commando om de lucht door de slang te drijven. Plaats daarna een ultracentrifugebuis gevuld met RNAs-vrij water in de houder en doorboor de buis vervolgens met de canule totdat de twee zwarte markeringen zichtbaar zijn.Het doseergat bevindt zich tussen de twee markeringen. Start de spuitenpomp in de handmatige voorwaartse stand met 6,0 milliliters per minuut. Wanneer de spoeloplossing een derde van de buis vult, schakel dan over naar de variabele snelheid met een debiet van 1,0 milliliters per minuut.Draai nu aan de knop voor de baseline-aanpassing van de spectrofotometer totdat de spanning in de grafiek op nul staat. Er zal water uit de afvoerslang in de el Mya-kolf beginnen te lopen. Stel vervolgens de gewenste gevoeligheid in op 1,0 au.Wanneer de gevoeligheid is ingesteld, drukt u op de baseline-knop en draait u aan de offset-draaiknop van de recorder om de nullijninstelling af te stellen op het 10%-merk op de chartrecorder. Zodra een stabiele nullijn is bereikt, zet u de pompschakelaar en de draaiknop voor de chartsnelheid uit. Wanneer de pomp is uitgeschakeld, zet u deze in de rev-stand om de spoelvloeistof terug te winnen totdat deze het eerste merk op de punctiecanule bereikt.Verwijder vervolgens de centrifugebuis, verdrijf eventuele luchtbellen in de canule met een kleine hoeveelheid spoeloplossing en verwijder eventueel restwater dat uit de doorstroomcel is gelekt bij het fractioneren van de gradiënt. Plaats daarna de centrifugebuis met de sucrosegradiënt in de houder en doorboor de buis met de canule. Plaats vervolgens tien microcentrifugebuisjes van twee milliliter in de posities twee tot en met 11 van het fractieopvangrek en een afvalbuisje in positie één, zodanig dat de doppen niet omhoogsteken.Zet de bedieningsknop van de pomp op handmatig en stel de stroomsnelheid van de spuitenpomp in op 6,0 milliliters per minuut. Druk vervolgens op play op de fractiecollector zodra de arm het eerste buisje bereikt. Druk op de pauzeknop om de arm te positioneren en om het doseerklepje van de fracties te openen.Gebruik vervolgens het forward-commando om de pomp te starten en houd de pen van de chart recorder in de gaten. Zodra de pen naar boven begint uit te wijken, wat aangeeft dat het monster door de flowcel stroomt, wordt de afvalbuis snel vervangen door buis nummer één. Zodra de eerste druppel is opgevangen, worden de commando's snel omgeschakeld naar remote start, stop en een variabele snelheid van 1,0 milliliters per minuut, waarna op play wordt gedrukt zodat de interface van de fractiecollector elke minuut fracties van één milliliter kan verzamelen.Druk ten slotte op stop zodra de blauwe spoeloplossing de laatste buis binnenkomt. PolyZone-profilering is een cruciale techniek om de specifieke betrokkenheid van PD CD4 bij IRA-gemedieerde translatie aan te tonen. In dit experiment werden HEC 2 93-cellen bijvoorbeeld transient getransfecteerd om de endogene niveaus van PDC D four te verlagen, waarna ze werden onderworpen aan PolyZone-profielanalyse.Het verlagen van de PDC D four-niveaus beïnvloedde de globale translatie van het gen niet, zoals geconcludeerd uit het uitblijven van veranderingen in het PolyZone-profiel. Bij het vergelijken van SI-controlecellen en met IPD CD four behandelde cellen bleek de polysoomdistributie van een niet-IRAs-variant van XIAP ongewijzigd tussen de behandelde en onbehandelde cellen. In tegenstelling hiermee was de polysoomdistributie van de twee IS-bevattende mRNA's XIAP en BCL XL significant veranderd.In de afwezigheid van PD CD4 verschoof de distributie van deze twee mRNA's naar zware ribosomen. Aangezien dit niet gepaard ging met veranderingen in de steady-state niveaus van XIAP- en BCL XL-mRNA, tonen deze resultaten de verhoogde translatie van XIAP en BCL XL aan in cellen met verlaagde PDC D vier-niveaus, wat verder werd bevestigd via Western blotting. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe mRNA-translatie kan worden gemeten door een sucrosegradiënt voor te bereiden en polysomen te scheiden via ultracentrifugatie.

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vertalen van Ribosoom Afiniteitszuivering (TRAP) kan de celtype-specifieke translatie van mRNA vastleggen. Hier rapporteren we het eerste TRAP-protocol dat zich richt op de isolatie van mRNA in zeldzame celpopulaties van Drosophila-embryo's.

TRAP-rc, vertalen Ribosoom Affiniteitszuivering van Rare Cell Populaties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.

Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van Polysoom profilering op het hart van de geïsoleerde geperfundeerd muis. We worden methoden beschreven voor perfusie van het hart, Polysoom, profilering en analyse van de fracties van de Polysoom met betrekking tot mRNAs, miRNAs en de Polysoom Proteoom.

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Hier beschrijven we de immunopreciatie van riosomen en bijbehorend RNA uit geselecteerde populaties volwassen mannelijke muizenkiemcellen met behulp van het RiboTag-systeem. Strategische veredeling en zorgvuldige immunoneerslag resulteren in schone, reproduceerbare resultaten die informeren over het vertalen van de kiemcel en inzicht geven in de mechanismen van gemuteerde fenotypes.

RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Leer polysome profiling voor selectieve mRNA-translatie in zoogdiercellen met sucrosegradiënt-ultracentrifugatie. Deze methode identificeert mRNA's onder stress en onthult celbiologische aanpassingsmechanismen.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Meer video's verkennen