Name: Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer hoe u bacteriële effector-eiwitten via elektroporatie in zoogdiercellen introduceert voor celbiologisch onderzoek. Deze methode minimaliseert cytotoxiciteit en maakt snelle visualisatie van eiwitlokalisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Aanzienlijke delen van dit werk werden uitgevoerd in het Environmental Molecular Sciences Laboratory, een DOE/BER nationaal wetenschappelijk gebruikersfaciliteit gelegen in het Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL wordt beheerd voor de DOE door Battelle onder Contract DE-AC05-76RLO1830.

1. Bereid in Advance <ol><li> Warm steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 ° C. </li><li> Warm Dulbecco&#39;s modificatie van Eagle&#39;s Medium (DMEM) en Minimaal Essentieel Medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C. Opmerking: Deze vertegenwoordigen een normale groei Media (NGM) voor RAW en HeLa-cellen respectievelijk. </li></ol> 2. Bereiding van Cellen <ol><li> Groeien RAW 264.7 cellen 70-90% confluentie in NGM. <ol><li> Handhaaf cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer. </li></ol></li><li> Groeien HeLa-cellen 70-90% confluentie in NGM. <ol><li> Handhaaf cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer. </li></ol></li><li> Voordat collectie, wassen celmonolaag keer met steriele PBS. </li><li> Verzamel pre-confluente cellen in een steriele conische buis. <ol><li> Zachtjes schrapen RAW cellenmet een rubberen politieman in PBS, met herhaalde pipetteren naar cel aggregaties verspreiden. </li><li> Los HeLa-cellen met 0,25% trypsine oplossing totdat visueel onderzoek toont dissociatie van cultuur oppervlak. Gebruik bijvoorbeeld 2 tot 3 ml van een T-75 kolf. Stel het volume daarom om ervoor te zorgen trypsine oplossing dekt gehele groei oppervlak. <ol><li> Schrik dissociatie met NGM dat 10% FBS. </li><li> Gebruik ten minste tweemaal het volume van NGM trypsine, met herhaalde pipetteren naar cel aggregaten te dispergeren. </li></ol></li></ol></li><li> Licht pellet cellen door centrifugeren bij 900 g gedurende 4 min. </li><li> Resuspendeer in hetzelfde volume als trypsine / demping oplossing met behulp van steriele PBS. </li><li> Tellen cellen met behulp van hemocytometer of deeltje teller. </li><li> Licht pellet cellen door centrifugeren bij 900 g gedurende 4 min. </li><li> Resuspendeer in voldoende volume PBS 5,5 x 10 6-6,0 x 10 6 cellen / ml. Opmerking: Zo zal één T-75 kolf approxim opleverenlijk 7,5 x 10 6 cellen 29. </li><li> Houd celsuspensie op ijs tot elektroporatie. </li></ol> 3. Voorbereiding voor Elektroporatie <ol><li> Pre-chill elektroporatie cuvetten (0,4 cm gap) op ijs. </li><li> Schakel elektroporatie apparaat en stel de spanning tot 0,3 kV. OPMERKING: capaciteit en weerstand waren niet aanpasbare instellingen op onze electroporator (vastgesteld op 10 uF en 600 Ω door de fabrikant). </li><li> Vul herstel platen met NGM en equilibreren bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C </li></ol> 4. Electroporatie <ol><li> Plaats 400 pl celsuspensie in vooraf gekoelde cuvet en voeg 20 ug geselecteerde eiwit cuvette (50 ug / ml). </li><li> Flick cuvet voorzichtig ~ 10 keer om te mixen zonder beschadiging van cellen. Opmerking: De cuvette kan ook meerdere keren worden omgekeerd om goed te mengen, maar niet pipet op en neer of vortex te voorkomen dat schade aan cellen. </li><li&gt; Droog buiten cuvet met een papieren handdoek of andere wisser om elektrische vonken in de electroporator voorkomen. </li><li> Electroporate monster bij 0,3 kV voor 1,5-1,7 msec. Opmerking: Dit was typisch voor deze studie. </li><li> Onmiddellijk na elektroporatie flick cuvet voorzichtig ~ 10 keer om grondig te mengen. </li></ol> 5. Het plateren van Cellen <ol><li> Store cuvet met geëlectroporeerd cellen op ijs tot klaar om te plaatsen in herstel platen. </li><li> Voor de meeste downstream-analyses, wassen cellen 1x met voorverwarmd NGM om vreemde effector eiwit te verwijderen. <ol><li> Verwijder cellen voor analyse en schorten in 3-5 ml van NGM. </li><li> Pellet cellen door centrifugeren bij 900 g gedurende 4 min. </li><li> Resuspendeer in voldoende volume van NGM voor de gewenste plaat grootte (bv 2 ml voor 35 mm schaal). </li></ol></li><li> Verwijder geschikte hoeveelheid cellen voor downstream analyse. <ol><li> Voorbeeld 1: de plaat in glazen bodem gerechten voor microscopie analyse. </li><li> Voorbeeld 2: plaat into celcultuur plastic voor eiwit analyse zoals affiniteit zuiveringen. </li></ol></li><li> Laat cellen herstellen in evenwicht platen in bevochtigde 95% lucht / 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur. </li></ol> 6. Microscopie Analyse 6.1) Fixatie / immunofluorescentiekleuring <ol><li> Was de cellen 1x met steriele PBS na 4 uur herstelperiode. </li><li> Fix cellen in 100% methanol gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik voldoende methanol volledig bedekken cellen (bijvoorbeeld 2 ml van 35 mm schaal). </li><li> Was 3x met steriele PBS. </li><li> Permeabilize cellen met 0,4% Triton X-100 in PBS gedurende 15 min. Gebruik bijvoorbeeld 1 ml voor een diameter van 35 mm plaat. <ol><li> Pas lengte van permeabilisatie en sterkte van Triton X-100 volgens epitoop en locatie doelwiteiwit. Opmerking: De beste resultaten moet empirisch worden bepaald voor elk doel, maar de bovenstaande voorwaarden moet voldoende zijn voor de meeste c zijnytosolic doelen. </li></ol></li><li> Blokkeren met 5% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur bij KT. Gebruik bijvoorbeeld 1 ml voor een diameter van 35 mm plaat. </li><li> Was 3x met PBS. </li><li> Incubeer primair antilichaam in antilichaam binding oplossing (0,1% Triton X-100 en 1% BSA in PBS) overnacht bij 4 &#160; ° C met zachte wiegen. Gebruik bijvoorbeeld 0,5 ml voor een diameter van 35 mm plaat. <ol><li> Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor antilichaamverdunning. Opmerking: Zo werd de streptavidine bindende peptide tag (SBP-tag) antilichaam dat 1: 1000 verdunning, terwijl de PKN1 antilichaam werd gebruikt bij 1: 200 verdunning. </li></ol></li><li> Was 4x met PBS. </li><li> Incubeer passende fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam in antilichaam binding oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd, beschermd tegen licht. <ol><li> Gebruik bijvoorbeeld Alexa 488 en Alexa 647 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. <ol><li> Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor de mieribody verdunning. (Bijvoorbeeld ongeveer 1: 1000 van deze studie). </li></ol></li><li> Voeg andere vlekken indien nodig, bijvoorbeeld 5 uM Wheat germ agglutinnin (WGA) geconjugeerd met Alexa 647 of DAPI volgens de aanbevelingen van de fabrikant, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li></ol></li><li> Was 5x met PBS en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht tot klaar om de afbeelding. </li></ol> 6.2) confocale microscopie en beeldanalyse <ol><li> Afbeelding samples op een omgekeerde confocale microscoop met een 63x olie-immersie objectief. <ol><li> Afbeelding groene kanaal met behulp van de 488 nm lijn van een argon laser, met een bandbreedte emissie tussen 492-542 nm. </li><li> Afbeelding rode kanaal met behulp van een 633 nm diodelaser, met bandbreedte emissie tussen 640-718 nm. </li><li> Afbeelding blauwe kanaal met behulp van een 405 nm diodelaser, met bandbreedte emissie tussen 407-453 nm. </li><li> Zorg ervoor dat de meerdere kanalen z-stacks dekken het geheel van de cellulaire volume. </li></ol></li><li> Proces beelden met de juiste software voor beeldverwerking. </li></ol> 7. Affiniteitszuivering <ol><li> Was geëlectroporeerd cellen tweemaal met 4 ° C PBS na 4 uur herstelperiode. </li><li> Lyse met ~ 1,0 ml lysis buffer (1% Triton X-100 met protease inhibitor cocktail en fosfatase-inhibitor in PBS) op ijs. Gebruik remmers volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: Bijvoorbeeld, zowel de fosfatase en protease inhibitoren die in deze studie werden toegevoerd met 100x, maar andere formuleringen even goed werken. </li><li> Prompt schraap cellen met rubberen politieman en verzamelen in conische buizen. </li><li> Lyse door krachtige vortexen en geluidsgolven. Opmerking: Andere lysis methoden kunnen net zo goed werken, maar de efficiëntie moet empirisch worden bepaald met betrekking tot de geschiktheid van de test eisen. <ol><li> Ultrasone trillingen 3 x 30 sec met intermitterende vortexen. </li></ol></li><li> Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verzamelencelresten en onoplosbare aggregaten; sparen het supernatant. </li><li> Combineer gelijke volumes (-1,0 ml) geëlektroporeerd cellysaat met 50 pi agarose Streptavidin resin suspensie bij 4 ° C geïncubeerd met end-over-end rotatie. Opmerking: Deze hars vangt de geëlectroporeerd eiwit (en bijbehorende complexen) via haar streptavidine bindend peptide affiniteitsmerker. </li><li> Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. </li><li> Twee keer wassen met 40 bed volumes (~ 1 ml) PBS. </li><li> Voeg 30 ui 4x LDS laadbuffer (141 mM Tris base, 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blue G, 0,175 mM fenolrood, pH 8,5), 20 gl Dih 2 O en 1 pi 0,5 M tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP), die enige volume korrels blijven. </li><li> Verhit bij 95 ° C gedurende 10 min en afkoelen op ijs. </li><li> Spin&gt; 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 min. </li><li> Verzamel supernatant. </li><li> Voer een western blot met behulp van geschikte antilichamen Opmerking: Hijre, is anti-PKN1 primair antilichaam gebruikt. </li></ol>

<ol><li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+injection+kit%3A+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li>
<li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+secretion+machines%3A+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li>
<li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li>
<li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li>
<li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li>
<li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li>
<li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disabling+surveillance%3A+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li>
<li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+GEFs%3A+a+common+theme+for+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+effector+protein%2C+VopQ%2C+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li>
<li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li>
<li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li>
<li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li>
<li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly%28ADP-ribose%29+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li>
<li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease%3A+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li>
<li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+antibodies%2C+DNA%2C+and+other+macromolecules+into+cells%3A+a+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li>
<li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Engineering+and+Biotechnology+News%22%5BJournal%5D)">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li>
<li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li>
<li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li>
<li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li>
<li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li>
<li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+Basic+principles%2C+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li>
<li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+electroporation%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry+and+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li>
<li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li>
<li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GtgE%2C+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li>
<li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li>
<li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li>
<li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+PKN1%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology+%2F+Editorial+Board%2C+Juan+S.+Bonifacino+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li>
<li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science+%2F+Editorial+Board%2C+John+E.+Coligan+...+%5Bet+al%5D%22%5BJournal%5D)">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Afgescheiden effectoren van pathogene bacteriën geëvolueerd functioneren in de gastheercel worden en daardoor is het nuttig om te bestuderen in situ in de gastheer. Invoering van specifieke effectoren van belang in gastheercellen kan de desbetreffende pathogeen-gastheer interacties worden bestudeerd isolatie zonder interferentie van andere bacteriële eiwitten. Het doel was om elektroporatie staand als middel om bacteriële effector eiwitten te introduceren in eukaryote gastheercellen, waardoor sommige van de uit...

Vele Gram-negatieve bacteriën gebruiken gespecialiseerde secretie systemen virulentie gerelateerde eiwitten (hierna effectoren) direct te injecteren in gastheercellen 1-5. Deze effectoren hebben een breed scala van biologische functies, waaronder: onderdrukking van de immuniteit van de gastheer, het cytoskelet veranderingen, wijziging van het intracellulair verkeer en signalering, transcriptionele veranderingen, en gastheer proteasoom veranderingen 6-9. De functies van bepaalde effectoren zijn bekend, maar de gastheer doelstellingen en biochemische werking (en) van vele anderen nog worden bepaald. Bij het vergelijken van wild-type en recombinante bacteriële infecties geldige benadering intracellulaire effector virulentiemechanismen bestuderen, is het vaak voordelig om een ​​individuele effector introduceren in de gastheercel. Aldus eenvoudige werkwijzen voor het inbrengen en karakteriseren bacteriële effector eiwitten in het kader van gastheercellen is zeer gewenst. Vereenvoudiging van de experimentele analyse wiste één effector is kritisch als andere effectoren kunnen tegengestelde of overbodige functies hebben. Om deze vereenvoudiging te bereiken, hebben de onderzoekers eerder geïntroduceerde macromoleculen in cellen door vele verschillende methoden, waaronder virale transductie 10, micro-injectie 11, schraap het laden van 12,13, celfusie met chemisch geïnduceerde micro-injectie 14, merkgebonden eiwit &quot;transfectie&quot; reagentia 15, calciumfosfaat neerslag 16 en elektroporatie 17-20. De ingevoerde moleculen variëren van nucleïnezuren zoals DNA, RNA, en RNAi soorten eiwitten, cellen ondoordringbare kleurstoffen en antilichamen voor intracellulaire doelwitten 21,22. Sommige methoden hebben beperkingen waaronder het type macromolecuul dat kan worden ingevoerd, en inzonderheid downstream analyses kunnen worden beperkt door hoge cellulaire toxiciteit, schadelijke werkingsmechanismen, lage werkzaamheid, of introductie efficiency. Transfectie, een often gebruikte methode voor het tot expressie brengen van bacteriële genen in zoogdiercellen, lijdt ook de beperking dat enkele relevante gastheercel soorten, zoals macrofagen en primaire cellen, bijzonder resistenter voor transfectie. Naast dit, is het moeilijk om de niveaus van bacteriële eiwit geproduceerd bij inbrengen van vreemd DNA controle. Veel werk elektroporatie van nucleïnezuren in zowel bacteriële en zoogdiercellen als gemeenschappelijk laboratoriumtechniek vastgesteld; echter, er voortdurend onderzoek naar de beste methoden voor het leveren van eiwitten in cellen onder fysiologische omstandigheden. Rapporten over proteïne transfectie zijn veelbelovend, maar vereisen dure reagentia en optimalisatie. De wens mogelijk toxische bacteriële effectoren introduceren in diverse cel targets met minimale kosten leidde ons naar elektroporatie beschouwen als een methode voor het bestuderen van deze eiwitten in vivo. Eiwit elektroporatie 23-25 ​​is een ontmoetinghod om eiwitten te introduceren in levende cellen via electropermeabilization, ook wel elektro-transfectie of elektro-injectie 26. Deze techniek maakt gebruik van hoge intensiteit elektrische pulsen poriën in celmembranen te maken. Deze omkeerbare poriën laten macromoleculen die normaal gesproken worden uitgesloten van intracellulaire ruimte om de cel in te voeren. Na verwijdering van het externe elektrische veld, kan het membraan opnieuw verzegelt, waardoor de cel moleculen die doorheen de poriën 27,28 behouden. Een standaard electroporator werd in dit onderzoek om bacteriële effectoren consequent voeren in zowel muizen macrofaag-achtige cellen en humane epitheelcellen. De werkwijze is snel, efficiënt en goedkoop, zonder noemenswaardige daling van cellulaire levensvatbaarheid. De geïntroduceerde eiwitten kunnen worden gevisualiseerd immunofluorescentie microscopie of voor functionele bepalingen. Dit is aangetoond met groen fluorescent proteïne (GFP) als een niet-toxische standaard, entwee Salmonella effector-eiwitten, SspH1 en GtgE. Wij stellen eiwit elektroporatie als een extra instrument in het repertoire voor de studie van bacteriële virulentie eiwitten en hun functies in eukaryote gastheercellen.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA-oplossing</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>0.4 cm Gap-elektroporatiecuvettes voor eenmalig gebruik</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>100% Methanol</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td>Ontvlambaar, giftig</td></tr><tr><td>Rund serumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Celtellingsapparaat - Hemocytometer of Coulterteller</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model Z1</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuurincubator</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td>Bevochtigde 95% lucht/5% CO2 atmosfeer bij 37 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Celcultuurplastic</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td>Celcultuurflacons/platen, pipetten, buisjes, rubberen schraper</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modificatie van Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td>Opwarmen tot 37 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>E. coli Pulser</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie confocale microscoop&nbsp;</td><td>Ziess</td><td>Model&nbsp; LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glazen bodemschotels voor microscopie</td><td>Wilco Wells</td><td>HBSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>HALT Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Pierce</td><td>78430</td><td>Corrosiefd, giftig</td></tr><tr><td>HeLa-cellijn</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>LDS 4X Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Minimaal essentieel medium (MEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>10-010</td><td>Opwarmen tot 37 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Andere fluorescente kleurstoffen (WGA, DAPI) in combinatie met een anti-fade reagens</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7-cellijn</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Primair antilichaam tegen doelwit van belang</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam geconjugeerd aan fluorofoor</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td>Afkoelen tot 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td>Opwarmen tot 37 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Streptavidine agarose resin suspensie&nbsp;</td><td>Pierce</td><td>20353</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge voor op tafel geschikt voor het accepteren van conische buisjes (zwenkbuisjes bij voorkeur)</td><td>Elk</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td>Corrosiefd, giftig</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8585</td><td>Irritatief, giftig</td></tr></tbody></table>

elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

De studie van eiwit interacties in de context van levende cellen kritische informatie over lokalisatie, dynamiek en interactie partners genereren. Deze informatie is bijzonder waardevol in de context van gastheer-pathogeen interacties. Veel pathogenen eiwitten functioneren in gastheercellen verschillende wijze zoals mogelijk vermijden dat het gastheerimmuunsysteem en overleving binnen het intracellulaire omgeving. Om deze pathogeen-eiwit gastheer-cel interacties te bestuderen, zijn verschillende benaderingen vaak gebruikt, zoals: in vivo infectie met een stam die een getagde of mutant eiwit, of de introductie van pathogeen genen via transfectie of transductie. Elk van deze benaderingen heeft voordelen en nadelen. We zochten een middel om exogene eiwitten direct invoeren in cellen. Elektroporatie wordt vaak gebruikt om nucleïnezuren in cellen te introduceren, maar is minder vaak toegepast om proteïnen hoewel de biofysische basis is precies hetzelfde.Een standaard electroporator werd gebruikt om de affiniteit gelabelde bacteriële effectoren introduceren in zoogdiercellen. Human epitheliale en muis macrofaagcellen werden gekweekt door de traditionele methoden, vrijstaand, en geplaatst in 0,4 cm kloof elektroporatie cuvetten met een exogene bacterieel pathogeen eiwit van belang (bijvoorbeeld Salmonella Typhimurium GtgE). Na elektroporatie (0,3 kV) en een korte (4 uur) herstelperiode, werd intracellulaire eiwit geverifieerd door fluorescent labelen van het eiwit via zijn affiniteitsmerker en onderzoeken van ruimtelijke en temporele verdeling van confocale microscopie. De geëlektroporeerde eiwit werd ook aangetoond functioneel in de cel en in staat correcte subcellulaire handel en eiwit-eiwit interactie te zijn. Terwijl de exogene eiwitten neiging ophopen op het oppervlak van de cellen, de geëlektroporeerde monsters hadden sterk verhoogde intracellulaire effector concentratie ten opzichte van alleen incubatie. Het protocol is eenvoudig en snel genoeg om te worden gedaan in aparallel mode, waardoor voor high-throughput karakterisering van pathogeen eiwitten in gastheercellen waaronder subcellulaire targeting en functie van virulentie-eiwitten.

Als eerste proof of concept werd gezuiverd groen fluorescerend eiwit met succes in zoogdiercellen via elektroporatie. GFP, bij benadering 27 kD een molecuulgewicht eiwit wordt gewoonlijk ingebracht in zoogdiercellen (gewoonlijk uitgedrukt uit plasmide DNA) als moleculaire biologie hulpmiddel zonder significante cellulaire toxiciteit. HeLa-cellen werden geïncubeerd (Figuur 1A) of elektroporatie (Figuur 1B) met 25 ug / ml GFP, gevolgd door immunofluorescentie confocale microscopie te cont...

Electroporatie werd gebruikt om gezuiverde bacteriële virulentie-effectoreiwitten direct in levende eukaryote cellen te insereeren. De lokalisatie van eiwitten werd bewaakt door confocale immunofluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt studies mogelijk over transport, functie en eiwit-eiwit-interacties met behulp van actieve exogene eiwitten, waardoor de noodzaak voor heterologe expressie in eukaryote cellen wordt vermeden.

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om exogene, potentieel cytotoxische eiwitten, zoals bacteriële effectoren, in zoogdiercellen te introduceren om hun effecten en functie te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst zoogdiercellen te kweken onder standaard kweekcondities om geschikte gastheercellen te verkrijgen waarin het gezuiverde eiwit van belang kan worden geïntroduceerd. Als tweede stap wordt er electroporatie van de gekweekte gastheercellen uitgevoerd in aanwezigheid van een gezuiverde bacteriële effector, waardoor het eiwit de gastheercellen kan binnendringen en ermee kan interageren.Vervolgens wordt visualisatie of een andere functionele assay uitgevoerd om de subcellulaire lokalisatie en de functionaliteit van het effectorproteïne te beoordelen. De resultaten op basis van confocale microscopie, immunochemische methoden of andere analysetechnieken tonen de lokalisatie van de functionele bacteriële effectoren op hun verwachte subcellulaire locaties en de binding aan hun bekende interactiepartners. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals transsectie of transductie, is dat dit protocol een snelle, eenvoudige en goedk

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Mycobacteriële pathogene strategieën blijven slecht begrepen. De langzame groei van de meeste soorten, de ondoordringbare karakter van de cel-wand, en de gevaren van het werken met pathogenen maken mycobacteriën moeilijk om te studeren en zijn grotendeels verantwoordelijk voor onze slechte begrip van deze organismen. In deze video laten we zien de techniek van elektroporatie, die onderwerpen cellen gaat om een ​​korte hoge elektrische impuls om de toegang van het DNA. Het is de meest gebruikte...

Elektroporatie van mycobacteriën

Source: Stefan, A., et al., The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for transforming Escherichia coli with a plasmid carrying an antibiotic resistance gene, including cell preparation, electroporation, recovery, and selection of transformants.

Preparation and Transformation of Bacteria Using High-Voltage Electroporation

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of an inducible expression system to identify where the bacterial effector protein CaeB disrupts the host apoptotic cascade. It outlines the steps for transfecting CaeB-expressing cells with a tetracycline-responsive system to induce pro-apoptotic gene expression in order to identify the point of...

Transfection of an Inducible Gene Expression System into Cells Expressing a Bacterial Effector Protein

In this video, we demonstrate the introduction of bacterial effector proteins into mammalian cells by electroporation. The intracellular localization of the bacterial effector proteins is detected by confocal microscopy following staining with specific fluorophore-conjugated antibodies.

Introduction of Bacterial Effector Proteins into Mammalian Cells by Electroporation

Elektroporatie is een algemeen gebruikte werkwijze voor het introduceren van DNA in bacteriën in een proces dat transformatie. Traditionele protocollen voor de bereiding van elektrocompetente cellen tijdrovend en arbeidsintensief. Dit artikel beschrijft een alternatieve, snelle en efficiënte werkwijze voor de bereiding van elektrocompetente cellen thans werkzaam sommige laboratoria.

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation is een effectieve aanpak te leveren van genen van belangen in cellen. Door deze aanpak in vivo toe te passen op de neuronen van volwassen muis achterwortelganglia ganglion (DRG), beschrijven we een model voor het bestuderen van axon regeneratie in vivo.

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.

Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Elektroporatie van plasmide-DNA in skeletspieren is een haalbare methode om genexpressie te moduleren zonder de spiercontractiliteit bij muizen in gevaar te brengen.

Elektroporatie van plasmide-DNA in de skeletspieren van de muis

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

Leer hoe u bacteriële effector-eiwitten via elektroporatie in zoogdiercellen introduceert voor celbiologisch onderzoek. Deze methode minimaliseert cytotoxiciteit en maakt snelle visualisatie van eiwitlokalisatie mogelijk.

Elektroporatie van functionele bacteriële effectoren in zoogdiercellen

Meer video's verkennen