Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Het algemene doel van het volgende experiment is om gezuiverde spiercellen te isoleren uit menselijke patiënt spierbiopsieën en deze te immortaliseren voor downstream studies. Dit wordt bereikt door eerst het verzamelde weefsel te wegen, te hakken en te verteren om de mononucleaire cellen te dissociëren. Als tweede stap worden de myogene cellen gezuiverd van niet-myogene cellen door middel van facten.

Vervolgens worden myogene cellen geïnfecteerd met zowel CDK vier als H turt om geïmmortaliseerde cellen te genereren. De resultaten tonen aan dat uit patiënten afkomstige levende spiercellen kunnen worden uitgebreid voor meerdere passages en gedifferentieerd op basis van celfusie-assays, de aanwezigheid van trillende myobuizen en de expressie van myogene markers. De implicaties van deze techniek gaan verder dan de diagnose van spierziekten omdat het potentieel een onbeperkt aantal myogene cellen kan leveren voor geneesmiddelenonderzoek of andere downstream-toepassingen waarbij een hoog aantal cellen vereist is.

Ik zal de procedure demonstreren samen met Jerome Robbin, een postdoctoraal medewerker van het laboratorium van Dr. Woody Wright in Dallas. Begin met het dissociëren van de spierbiopsie om de myogene cellen te zuiveren. Eerst in een bioveiligheidskap voor weefselkweek, meet u de massa van de spierbiopsie op.

Vervolgens gebruikt u in een schotel van 10 centimeter steriele scalpels om het weefsel in fijn gehakte stukken te snijden. Voeg een paar druppels van een X-H-B-S-S toe zodat het weefsel niet uitdroogt per gram weefsel. Voeg 3,5 milliliter discs pasta twee en 3,5 milliliter collageenase D-oplossingen toe.

Meng vervolgens de cellen met een 25 milliliter pipet en breng de plaat om de 15 minuten in een incubator. Meng de cellen met een vijf milliliter pipet binnen 90 minuten. Er moet een volledige weefseldissociatie zijn.

Zodra het weefsel is gedissocieerd, voegt u twee volumes groeimedium toe en filtert u het door een 100 micron zeef. Verzamel het filtraat in een 50 milliliter buis. Pelet de cellen uit het filtraat bij 329 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Vervolgens resuspendeert u de cellen in HBSS met 0,5%BS, A, en telt u ze. Pas het volume aan om 1 miljoen cellen per 100 microliter te krijgen. Zet een aliquot van 250.000 cellen opzij als een ongekleurde controle en zet twee soortgelijke aliquoten opzij voor enkele kleurcontroles.

Deze zijn allemaal vereist voor de fax-analyse. Kleur vervolgens de cellen met vijf microliter anti CD 56-antilichaam per miljoen cellen en incubeer alle monsters gedurende een half uur op ijs. Was vervolgens de monsters snel met 10 milliliter HBSS.

Pellet vervolgens de cellen zoals eerder, maar bij vier graden Celsius. Nadat de cellen zijn gepellet, gooit u het supernatant weg en resuspendeert u het cellenpellet in een X-H-B-S-S bij 5 miljoen cellen per milliliter. Voeg vervolgens propidiumjodide toe tot een uiteindelijke concentratie van één microgram per milliliter. Zuiver nu de myogene CD 56-positieve cellen van de niet-myogene cellen met behulp van facten volgens de zuiveringsplaat.

De myogene cellen worden in een hoeveelheid van 50.000 per putje in zes-putjes platen gekweekt, bedekt met 0,1% gelatine, totdat ze gehecht zijn, en vervolgens geïnfecteerd met virus voor cellijn immortalisatie. In het tekstprotocol is er een aanvullende beoordeling van hoe dermale fibroblasten worden gezuiverd en gekweekt, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid phoenix tropic-cellen voor na het incuberen van de phoenix tropic-cellen 's nachts met de plasmide PolyJet-mengsel.

Voed de cellen met vers medium, bestaande uit vier delen DME M1, deel van medium, 1 99 en 10% kalfsserum. Bereid ook inotrope verpakking voor. PA drie 17-cellen in een zes-putjes plaat met ongeveer 400.000 PA drie 17-cellen per putje.

12 uur later, verzamelt u het virusbevattende supernatant boven de Phoenix tropic-cellen en laat u het door een 0,45 micron filter lopen. Gebruik vervolgens een milliliter van het supernatant om de PA drie 17-cellen te infecteren en deze 's nachts te kweken. Selecteer de volgende dag een virusproducerende cellijn uit de PA drie 17-cellen door antibiotica aan te brengen bij 0,5 milligram per milliliter in het medium wanneer de cellen bijna confluerend zijn, en verzamel het supernatant van de cellen drie keer met tussenpozen van 12 uur.

Filter de verzamelingen na elke oogst. Het filtraat is het werkende virale supernatant. Verdeel het in een milliliter. Aliquots.

Bewaar een paar aliquots voor onmiddellijk gebruik. De extra aliquots kunnen worden bewaard bij min 80 graden Celsius, maar zullen 50% efficiëntie verliezen bij elke bevriezing/ontdooicyclus. Houd er rekening mee dat tijdens het hele proces apparatuur die de virale deeltjes heeft aangeraakt, moet worden gebleekt voordat het in de prullenbak wordt gegooid.

Om de stabiele PA drie 17 virusproducerende cellijn permanent op te slaan, bevriest u de cellen in 10%DMSO 90%serum en bewaart u ze bij min 150 graden Celsius voor elke put van gezuiverde fax-cellen. Voeg in een zes-putjes plaat 400 microliter vers geproduceerd viraan supernatant toe. Laat twee putjes zonder virus achter als controles.

Incubeer de plaat 's nachts en verander de volgende dag het medium in elke put naar 2,5 milliliter vers spiermedium. Zorg ervoor dat u het medium en de pipetten die virale deeltjes bevatten, in de bleekcontainer gooit. Laat de cellen drie dagen in het verse spiermedium incuberen.

Selecteer vervolgens de cellen op antibioticaresistentie met behulp van 400 microgram neomycine per milliliter voor CDK vier-infectie, of 300 microgram hygromycine per milliliter voor humane telomerase. Reverse transcriptase-infectie gedurende een week of twee. Houd de cellen onder de selectieve omstandigheden totdat de cellen en de controlepotten allemaal dood zijn.

Passeer altijd de cellen voordat ze confluerend worden, zelfs tijdens selectie wanneer ze 60