Name: Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer spiercellen isoleren en immortaliseren uit menselijke patiëntbiopten voor ziekteonderzoek. Deze methode biedt een onbeperkte bron van myogene cellen voor medicijnscreening en diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze publicatie wordt gefinancierd door Cure CMD, een Association Contre Les Myopathies (AFM)-subsidie (project 16297), en door de National Institutes of Health (subsienummers K08 AR059750, L40 AR057721 en 2R01NS047727).

OPMERKING: Protocollen voor het verzamelen van menselijk weefsel moet worden beoordeeld en door de Institutional IRB commissie goedgekeurd. Inzameling van afgedankte, de-geïdentificeerde menselijk weefsel is goedgekeurd door het ziekenhuis de Boston Children&#39;s en Brigham en Women&#39;s Hospital IRB Comités. De hieronder beschreven methoden zijn toegepast voor de isolatie van myogene cellen van de-geïdentificeerde, weggegooid weefsel. De beschreven methoden zijn geschikt voor weefsel vanuit ingestemd patiënt materiaal. 1. celisolatie <ol><li> Dissociatie van spierbiopsie en zuivering van myogene cellen <ol><li> Pre-wegen een 10 cm weefselkweek plaat in een weefselkweek bioveiligheid kap, en vervolgens opnieuw af te wegen de plaat met de spierbiopsie om de hoeveelheid weefsel te berekenen worden losgekoppeld. </li><li> Met behulp van steriele scalpels, gehakt spierweefsel fijn en voeg een paar druppels steriele 1x HBSS om weefsel niet uitdroogt. </li><li> Voeg elk van di 3,5 mlspase II en collagenase D per gram spierweefsel te worden verteerd. Pipetteer het gehakt weefsel en enzym oplossing door een steriele 25 ml pipet een paar keer. Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 15 min en verteren weefsel totdat de slurry gaat gemakkelijk hoewel een steriele 5 ml pipet. OPMERKING: Weefsel dissociatie wordt gewoonlijk bereikt door enzymatische digestie binnen 45-90 min. Verwijzen wij u naar het gedeelte &#39;Representatieve resultaten&#39; voor meer informatie. </li><li> Voeg 2 volumina steriel groeimedium gedissocieerde weefsel, filter door een 100 um zeef cel over een 50 ml conische buis en pellet cellen gedurende 10 min bij 329 xg (~ 1100 rpm), kamertemperatuur. Verwijzen wij u naar de Materialen Tafel voor media samenstelling. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 volume steriel kweekmedium en voeg 7 volumes rode bloedcellen lysisoplossing. Filtreer de oplossing door een 40 um cel zeef, pellet vervolgens thij cellen gedurende 10 min bij 329 xg, kamertemperatuur. </li><li> Tel de cellen in een hemocytometer en resuspendeer de cellen in 1 x HBSS met 0,5% BSA in een concentratie van 1 x 10 6 cellen / 100 ul. Vernietiging ~ 250.000 cellen in een enkele buis die wordt gebruikt als een negatieve (ongekleurd) controle. Vernietiging extra eenkleurige gekleurd controlebuizen voor propidium iodide en CD56, die voor het correct gating van CD56 positieve cellen door FACS-sortering. Verwijzen wij u naar het sorteren handleidingen cel of overleggen met FACS sortering kernfaciliteit deskundigen om de nodige controles te waarborgen zijn inbegrepen. </li><li> Vlekken op de cellen worden gesorteerd met 5 ui / 10 6 cellen van anti- CD56 antilichaam. Incubeer alle monsters (inclusief controles) op ijs gedurende 30 min. </li><li> Was monsters in 10 ml 1 x HBSS en pellet cellen gedurende 10 min bij 329 xg (~ 1100 rpm) in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C geroerd. </li><li> Voeg propidiumjodide in een eindconcentratie van 1 ug / ml van het monster naar zijn sorted voor uitsluiting van dode cellen. Zuiveren myogene CD56 positieve cellen van niet-myogene cellen met behulp van de fluorescentie-geactiveerde cel sorteerder. </li></ol></li><li> Dissociatie van huidbiopsie OPMERKING: dermale fibroblasten kunnen worden geïsoleerd uit een huid pons van patiënten wanneer spierbiopten niet beschikbaar zijn. Dermale fibroblasten kunnen worden gebruikt als biomateriaal voor vele studies, waaronder transductie met MyoD naar myogene cellen te genereren. Bovendien kan dermale fibroblasten worden gebruikt iPS cellen, die kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypes voor verdere studie te genereren. <ol><li> Vervoeren de huid biopsie naar het laboratorium in het transport medium. Nadat het monster is ontvangen, voert de primaire kweek zo spoedig mogelijk. Als de primaire cultuur niet kan worden vastgesteld op dezelfde dag, bewaar het monster bij kamertemperatuur gedurende de nacht. </li><li> Breng de huidbiopsie van een steriele 35 mm petrischaal in de laminaire stroming kap. </li><li> Spoel de huid biopsie in een petrischaal met steriele 1x PBS om bloed en vuil te verwijderen. Verwijder het vetweefsel met een steriele scalpel. </li><li> Voeg 2 ml collagenase oplossing en gehakt het weefsel met scalpel, incuberen bij 37 ° C gedurende 45 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte van het weefsel. </li><li> Breng het gedigereerde weefsel een 15 ml conische buis, spoel de petrischaal met 2 ml van fibroblast kweekmedium tweemaal en verzamel het medium in dezelfde buis. </li><li> Pellet cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en was het pellet met 3 ml van fibroblast medium om de collagenase weer te verwijderen, vervolgens pellet cellen. Verwijzen wij u naar de Materialen Tafel voor media samenstelling. </li><li> Herhaal de stap 1.2.7 nog een keer. </li><li> Re-schorten de pellet in 5 ml fibroblast medium en plaat cellen op een T25 steriele weefselkweekkolf. Incubeer de kolf bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Evalueer de cultuur voor fibroblast aanhechting en groei in de komende 1-3 dagen. &lt;br /&gt; OPMERKING: Sommige kleine stukken weefsel kunnen zich ook hechten aan de plaat en fibroblasten migreren uit deze stukken weefsel. </li><li> Handhaaf de kweek onder dezelfde omstandigheden tot fibroblasten worden gekweekt tot ongeveer 80% confluentie. </li><li> Verzamel fibroblasten door trypsinisatie en overzetten naar kweekflessen vers voor extra uitbreiding. Voer trypsinisatie door het wassen van de kweken 3 keer in 1x PBS zonder Ca ++ en Mg ++. Voeg Trypsine-EDTA (zie Materialen tabel) naar de cellen (2 ml / T25 kolf) gedurende 2 min bij 37 ° C. </li><li> Splitsen vrijstaande cellen in extra flesjes. Als sommige stukken weefsel gehecht blijven aan de originele T25 flessen, voeg 5 ml vers kweekmedium naar deze kolf en meer fibroblasten zal voortdurend migreren uit. OPMERKING: De geëxpandeerde fibroblast cultuur te worden ingevroren als P1 en opgeslagen in vloeibare stikstof voor toekomstige experimenten. </li></ol></li></ol> 2. immortaliseren van Myogene Cellen <ol><li&gt; Plate 5000000 Phoenix ecotrope verpakkingscellen (PE) overnacht in een 10 cm steriele kweekplaat in DMEM en Medium 199 in een verhouding van 4: 1, aangevuld met 10% kalfsserum. </li><li> Feed cellen 30 min voor transfectie met 5 ml vers medium aangevuld met 10 mM cafeïne. </li><li> Homogeniseer een mengsel van 2 ug plasmide DNA uit een midi prep (CDK4 of hTERT plasmide) en PolyJet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min, zoals aanbevolen door de fabrikant. </li><li> Voeg de plasmide / PolyJet mengsel aan de PE-cellen &#39;s nachts. </li><li> Feed cellen met vers medium (DMEM Medium en 199 in een verhouding van 4: 1, aangevuld met 10% kalfsserum). Twaalf uur later, verzamel de virus supernatant en filtreer door een 0,45 urn poriegrootte. </li><li> Gebruik 1 ml supernatant verzameld overnacht de amfotrope verpakkingscellijn PA317 te infecteren en 5 verkrijgen van een stabiele virus-producerende cellijn na selectie met ofwel 0,5 mg / ml neomycine (G418) voor CDK4 of 0,5 mg / ml hygromycine voor hTERT. </li><li> Bereid te werken virale bovenstaande vloeistoffen door het kweken van de stabiele verpakking cellen tot bijna samenvloeien, dan is het oogsten van de bovendrijvende elke ochtend, avond en ochtend voor drie oogsten. </li><li> Filter de virale supernatanten en ofwel direct gebruik of verdelen ze in 1 ml porties en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik. Merk op dat virale supernatant verliest 50% infectie-efficiëntie met elkaar vries-dooi. Vergeet niet om te bleken te wassen voordat het teruggooien alles wat de virusdeeltjes heeft aangeraakt. OPMERKING: De stabiele PA317 virus-producerende cellijn kan worden ingevroren en gehandhaafd op -150 ° C voor permanente opslag (bevriezing medium is 10% DMSO; 90% Serum). </li><li> Plate-FACS gezuiverde myogene cellen (beschreven in stappen 1,1-1,9) bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / putje in 6-putjesplaten bekleed met 0,1% gelatine. Zorg ervoor dat cellen aan de plaat alvorens de virale infectie. </li><li> Voeg 400 ul gefilterd, freshly geproduceerd viraal supernatant of ingevroren monsters aan elke zes-well plaat &#39;s nachts (houd 2 putten als controles). </li><li> Verander medium door het voeren cellen met 2,5 ml / putje van vers spier medium (4: 1 Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) en Medium 199 aangevuld met 15% foetaal runderserum, 0,02 M HEPES-buffer, 1,4 mg / l vitamine B12 0,03 mg / l ZnSO4, 0,055 mg / l dexamethason, 2,5 g / l hepatocyt groeifactor en 10 ug / L basic fibroblast growth factor). Gooi de media en pipetten die de virusdeeltjes in een bleekmiddel container. Laat cellen in hetzelfde medium gedurende 3 dagen om te herstellen van infectie vervolgens behandelen selectie met behulp van 400 ug / ml neomycine (CDK4 infectie) of 300 ug / ml hygromycine (hTERT infectie). </li><li> Handhaaf cellen onder geneesmiddelselectie totdat de cellen in de controle schaal matrijs (1-2 weken). </li><li> Passage cellen voordat ze samenvloeiing (60-80% samenvloeiing; met behulp van 0,05% trypsine-EDTA), zelfs tijdens de selectiop de periode. Replate cellen in meerdere 10cm gerechten met vers myoblasten medium (zoals beschreven in 2.11) aangevuld met de selectie geneesmiddel. Handhaaf onsterfelijk geselecteerde cellen als een heterogene populatie of klonen een geheel homogene genetische achtergrond (zelfde insertie van het transgen in elke cel) te verkrijgen. </li><li> Voeren kloonselectie met behulp van de volgende stappen: <ol><li> Zaad de cellen bij lage dichtheid (bijvoorbeeld 300 tot 500 cellen in schalen van 10 cm) en te handhaven ongeveer twee weken tot kleine kolonies zijn gevormd (10-20 cellen). </li><li> Verwijder meeste van het medium op dit punt, waardoor er slechts een dunne film te voorkomen dat de cellen uitdrogen. </li><li> Plaats een klonen ring (met een uiteinde gedoopt in siliconen vacuüm vet) over elke gewenste kloon en voeg een paar druppels van trypsine / EDTA. </li><li> Oogst cellen zodra zij afgerond door zorgvuldig aspireren de cellen met behulp van een 1 ml tip of een Pasteur pipet en over te dragen naar de kleinste beschikbare multi- plaTE (96 of 48, 24 of 12 well platen). </li><li> Expand klonen zoals nodig om lokale confluentie voorkomen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flanigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).</li>
<li>Mercuri, E., Muntoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophies.</a> Lancet. 381, 845-860 (2013).</li>
<li>Sharples, A. P., Stewart, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+models+of+skeletal+muscle+hypertrophy+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).</li>
<li>Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+skeletal+muscle+development+and+applications+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).</li>
<li>Miller, A. D., Buttimore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+retrovirus+packaging+cell+lines+to+avoid+recombination+leading+to+helper+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production.</a> Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).</li>
<li>Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+antigen+Leu-19+as+a+molecular+marker+of+regeneration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).</li>
<li>Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+natural+killer+%28NK%29+cell-associated+antigen+CD56%28Leu-19%29%2C+which+is+identical+to+the+140-kDa+isoform+of+N-CAM%2C+in+neural+and+skeletal+muscle+cells+and+tumors+derived+therefrom%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom.</a> Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).</li>
<li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li>
<li>Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+human+and+mouse+satellite+cells+really+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Are human and mouse satellite cells really the same.</a> J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).</li>
<li>Belles-Isles, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+selection+of+donor+myoblast+clones+for+muscular+dystrophy+therapy+using+cell+surface+expression+of+NCAM%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM.</a> Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).</li>
<li>Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+human+muscle-derived+cells+to+skeletal+muscle+regeneration+in+dystrophic+host+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice.</a> PLoS One. 6, e17454(2011).</li>
<li>Zhu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+human+myoblasts+is+overcome+by+human+telomerase+reverse+transcriptase+and+cyclin-dependent+kinase+4%3A+consequences+in+aging+muscle+and+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies.</a> Aging Cell. 6, 515-523 (2007).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).</li>
<li>Ludlow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+telomerase+enzyme+activity+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution.</a> Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).</li>
<li>Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+myogenic+cell+populations+obtained+via+the+preplate+technique%3A+potential+for+rapid+isolation+of+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells.</a> Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).</li>
<li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+converts+primary+dermal+fibroblasts%2C+chondroblasts%2C+smooth+muscle%2C+and+retinal+pigmented+epithelial+cells+into+striated+mononucleated+myoblasts+and+multinucleated+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).</li>
<li>Huard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+dermal+fibroblasts+expressing+MyoD1+in+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).</li>
<li>Lattanzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+myogenic+conversion+of+human+fibroblasts+by+adenoviral+vector-mediated+MyoD+gene+transfer.+An+alternative+strategy+for+ex+vivo+gene+therapy+of+primary+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies.</a> J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).</li>
<li>Park, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+modulates+Wnt+signalling+by+association+with+target+gene+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin.</a> Nature. 460, 66-72 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Cellen als een nuttige bron De isolatie en cultuur van myogene celpopulaties is zeer nuttig bij het ​​vaststellen van ziekte fenotypes of in vitro modellen van ziekte. De myogene beschreven celisolatie procedure maakt de isolatie van myoblasten en fibroblasten van skeletspieren specimens, die vervolgens kan worden vermeerderd, onderscheiden, of onmiddellijk geanalyseerd. Myoblasten structuur en functie kunnen worden beoordeeld via microscopisch onderzoek, evaluatie van celoverleving...

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
One of the authors names was corrected from:
Stacy C. Cossette
to:
Stacy A. Cossette

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Moleculaire diagnostiek is in de afgelopen 20 jaar drastisch geëvolueerd. Genomisch DNA wordt nu routinematig geïsoleerd uit sputum of wangswab, terwijl het in het verleden een bloedtest vereiste. Met de huidige snelle doorlooptijd en gemak van gensequentie worden veel ziektemutaties routinematig geïdentificeerd zonder dat aanvullende tests nodig zijn. In het geval van diagnostiek van spierziekten hebben de identificatie van tientallen nieuwe genen in het afgelopen decennium, verantwoordelijk voor spierdystrofie of myopathie, de manieren waarop deze ziekten worden gediagnosticeerd drastisch veranderd 1,2. Momenteel zijn er tientallen genen geïdentificeerd als oorzaken van spierdystrofie en aangeboren myopathie, hoewel de mechanismen waarmee veel van deze genen ziekte veroorzaken nog onduidelijk zijn. In het bijzonder vormen zeldzame ziekten een uitdaging vanwege de kleine omvang van de patiëntenpopulaties. Voor deze gevallen, evenals voor meer voorkomende ziekten, is het genereren van stabiele tools die studies naar het mechanisme van pathogenese en screening van therapeutische geneesmiddelen vergemakkelijken zeer wenselijk. 
Ondanks dramatische vooruitgang in DNA-diagnostiek worden spierbiopsieën nog steeds uitgevoerd om de primaire diagnose vast te stellen bij veel patiënten bij wie een primaire metabole of spierziekte wordt vermoed. Wanneer een spierbiopsie noodzakelijk is, biedt deze de mogelijkheid voor aanvullende diagnostische en onderzoeksweefselverzameling met minimaal extra morbiditeitsrisico voor de patiënt. Aangezien er een aantal toepassingen zijn voor elk weefselmonster, is het zeer wenselijk om technieken voor primaire celcultuur te ontwikkelen met behulp van chirurgisch weefsel die eenvoudig, efficiënt zijn en minimale hoeveelheden weefsel vereisen. Een goede triage van spier- of huidbiopsieën is vereist om de isolatie van primaire cellen uit weefsel te maximaliseren en langetermijnopslag van levend materiaal. Bovendien belooft stamcelonderzoek en geneesmiddelenscreening veel voor de ontwikkeling van therapieën voor vele ziekten met behulp van cel-gebaseerde assays 3,4.
We beschrijven hier methoden voor primaire celafscheiding uit humane spier- of huidbiopsieën. Daarnaast voegen we een protocol toe voor immortalisatie van myogene cellen, wat nuttig is voor het genereren van grote aantallen cellen van een individu. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor downstream toepassingen, zoals aangepaste geneesmiddelenscreenings, die anders onhaalbaar zijn met het relatief kleine aantal cellen verkregen uit primair weefsel.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuur biosafety hood</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Model SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge, zoals Beckman Model</td><td>Beckman Coulter</td><td>Model Allegra 6R</td><td>Als celsortering wordt uitgevoerd, wordt een centrifuge met koeling bij voorkeur</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>Model Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Weefselcultuur incubator, verbonden met een CO2 bron</td><td>Forma Scientific</td><td>Serie II</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Model Aria</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia voor isolatie van primaire myoblasten uit weefsel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>Bereid een sok oplossing van 2.4U/ml in DMEM</td></tr><tr><td>Collageenase D</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>Bereid een stam oplossing van 10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x steriele Hank&rsquo;s Balanced Saline Oplossing (HBSS), calcium en magnesium vrij</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, fractie V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>Bereid een steriele oplossing van 1X HBSS 0,5% BSA voor FACS-sortering</td></tr><tr><td>Steriele groeimedium voor myoblasten: Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle&rsquo;s Medium (DMEM) met hoge glucose (4,5 g) aangevuld met 30% foetaal bovien serum</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Bevat L- glutamine</td></tr><tr><td>RBC lysis oplossing</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Jodide stam 10mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Bereid de stam oplossing door de poeder in steriele gedistilleerd water te verdunnen</td></tr><tr><td>Anti-menselijke CD56 antilichaam voor flow cytometrie</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>APC-geconjugeerd antilichaam, andere labels zijn beschikbaar</td></tr><tr><td>Reagentia voor immortalisatie van primaire myoblasten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecotropic packaging cell line PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Amphotropisch packaging cell line PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Varkenshuid gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Bereid een stam oplossing van 0,1% gelatine in water. Bekleed de schaal met de oplossing bij 37&deg;C gedurende een uur. Verwijder de oplossing en voeg medium toe.</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>pBabe plasmiden bevattend mCDK4 en hTERT</td><td>niet commercieel verkrijgbaar</td><td></td><td>Stadler et al, 2013</td></tr><tr><td>Qiagen plasmid midiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies</td><td>Medium 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>Meng 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>Myoblast groeimedium: 4:1 Dulbecco&rsquo;s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) en Medium 199 aangevuld met 15% foetaal bovien serum; 0,02 M HEPES buffer; 1,4 mg/L vitamine B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L dexamethason, 2,5 &mu;g/L hepatocyte groeifactor en 10 &mu;g/L beta fibroblast groeifactor.</td><td>Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethason); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).</td><td>Bereid media en stam oplossing Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60&micro;g/ml); Dex (55&micro;g/µl) apart voor gemakkelijker gebruik. HGF stam oplossing (5&micro;g/ml) en FGF (20&micro;g/ml) moeten vers elke week worden toegevoegd bij de uiteindelijke werkconcentratie.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Myosine zware ketting antilichaam voor immunokleuring</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>MF20</td><td>Clone MF20</td></tr><tr><td>Desmin Antilichaam voor immunokleuring</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Clone D33</td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia voor primaire huid fibroblast isolatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transport medium: RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 0,2% penicilline/streptomycine</td><td>RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Huid primaire fibroblast cultuur medium: RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline/streptomycine</td><td>Foetaal bovien serum: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase oplossing: Collageenase type 2 (100 mg) opgehangen in 12,5 ml van fibroblast cultuur medium en filter-gesteriliseerde</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 1X Fosfaat Buffer Saline (PBS) calcium en magnesium vrij</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Materialen voor isolatie van primaire myoblasten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml en 15 ml steriele conische buizen</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))</td><td></td></tr><tr><td>Steriele scalpels</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Steriele 5, 10, en 25 ml pipetten</td><td>Bellco glass</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)</td><td>Herbruikbare pipetten worden gewassen, katoen gedopt en autoclaved

isolatie en immortaliseren van patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for disease modeling

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

De generatie van patiëntspecifieke cellijnen vertegenwoordigt een onschatbaar hulpmiddel voor diagnostisch of translationeel onderzoek, en deze cellen kunnen worden verzameld uit huid of spierbiopsieweefsel dat beschikbaar is tijdens de diagnostische evaluatie van de patiënt. In dit protocol beschrijven we een techniek voor het isoleren van levende cellen uit kleine hoeveelheden spier- of huidweefsel voor primaire celkweek. Daarnaast bieden we een techniek voor de immortalisering van myogene cellijnen en fibroblastencellijnen van primaire cellen. Eenmaal dat cellijnen geïmmortaliseerd zijn, kan substantiële uitbreiding van patiënt-afgeleide cellen worden bereikt. Geïmmortaliseerde cellen zijn geschikt voor vele downstream toepassingen, inclusief geneesmiddelenscreening en in vitro correctie van de genetische mutatie. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbaar hulpmiddel om patiënt-afgeleide cellen te genereren en te bewaren voor downstream toepassingen.

Figuur 1 toont een aantal van de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij de primaire weefsel dissociatie: het exacte bedrag van weefsel wordt afgewogen in een steriele weefselkweek petrischaal (Figuur 1A, B). Het weefsel wordt vervolgens fijngemaakt met steriele scalpels, tot een weefsel suspensie wordt verkregen (Figuur 1C, D). Na toevoeging van verteringsenzymen, wordt primaire spierweefsel dissociatie gewoonlijk bereikt door enzymatische digestie binnen 45-90 mi...

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om gezuiverde spiercellen te isoleren uit spierbiopten van menselijke patiënten en deze te immortaliseren voor downstream studies. Dit wordt bereikt door het verzamelde weefsel eerst te wegen, fijn te malen en te verteren om de mononucleaire cellen te dissociëren. In een tweede stap worden de myogene cellen gescheiden van niet-myogene cellen middels FACS.Vervolgens worden myogene cellen geïnfecteerd met zowel CDK4 als H-tERT om geïmmortaliseerde cellen te genereren. De resultaten tonen aan dat levende spiercellen afkomstig van patiënten over meerdere passages kunnen worden uitgebreid en gedifferentieerd, gebaseerd op celfusie-assays, de aanwezigheid van samentrekkende myotubes en de expressie van myogene markers. De implicaties van deze techniek reiken verder dan de diagnose van spierziekten, omdat het potentieel een onbeperkt aantal myogene cellen kan leveren voor drugscreening of andere downstream-applicaties waarbij een groot aantal cellen vereist is.Ik zal de procedure demonstreren samen met Jerome Robbin, een postdoctoraal onderzoeker uit het laboratorium van Dr. Woody Wright in Dallas. Begin met het dissocieren van het spierbiopt om de myogene cellen te zuiveren. Noteer eerst in een steriele weefkweekkast de massa van het spierbiopt.Hak het weefsel vervolgens in een schaal van 10 centimeter met steriele scalpels in fijngehakte stukjes. Voeg per gram weefsel een paar druppels 1X HBSS toe zodat het weefsel niet uitdroogt. Voeg 3,5 milliliter van disc paste twee en 3,5 milliliter collagenase D-oplossingen toe.Meng vervolgens de cellen met een pipet van 25 milliliter en plaats de plaat elke 15 minuten in een incubator. Meng de cellen binnen 90 minuten met een pipet van vijf milliliter. Er moet sprake zijn van een volledige weefseldissociatie.Zodra het weefsel is gedissocieerd, voegt u twee volumes groeimedium toe en filtert u dit door een zeef van 100 micron. Verzamel het filtraat in een buis van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen uit het filtraat om een pellet te vormen bij 329 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Resuspendeer de cellen vervolgens in HBSS met 0,5% BS, A en tel ze. Pas het volume aan om 1 miljoen cellen per 100 µL te verkrijgen. Zet een aliquot van 250.000 cellen apart als ongekleurde controle en zet twee soortgelijke aliquoten apart als enkelvoudige kleurcontroles.Deze zijn allemaal vereist voor de fax-analyse. Kleur de cellen nu met vijf µL anti CD 56-antilichaam per miljoen cellen en incubeer alle monsters een half uur op ijs. Was de monsters vervolgens snel met 10 mL HBSS.Pellet daarna de cellen zoals voorheen, maar bij vier graden Celsius. Nadat de cellen zijn gepellet, wordt het supernatant weggegooid en het celpellet resuspendeerd in één X-H-B-S-S op 5 miljoen cellen per milliliter. Voeg vervolgens propidiumjodide toe tot een eindconcentratie van één microgram per milliliter. Zuiver nu de myogene CD 56-positieve cellen van de niet-myogene cellen met behulp van FACS, volgens het zuiveringsprotocol.Zaai de myogene cellen uit in zes-wellplaten die zijn gecoat met 0,1% gelatine, met een dichtheid van 50.000 cellen per well. Kweek de cellen totdat ze zijn gehecht en infecteer ze vervolgens met het virus voor de immortalisatie van de cellijn. In het tekstprotocol staat een aanvullende beschrijving van hoe dermale fibroblasten te zuiveren en te kweken, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid de phoenix tropic-cellen voor nadat de phoenix tropic-cellen gedurende de nacht zijn geïncubeerd met het PolyJet-plasmide mengsel.Voed de cellen met vers medium, bestaande uit vier delen DME M1, één deel medium 199 en 10% kalfserum. Bereid daarnaast isotrope verpakking voor. Zaai PA3-17 cellen in een zeswellplaat met ongeveer 400.000 PA3-17 cellen per well.Verzamel na 12 uur het virushoudende supernatant van de Phoenix tropic-cellen en filtreer dit door een filter van 0,45 micron. Gebruik vervolgens één milliliter van het supernatant om de PA three 17-cellen te infecteren en kweek deze een nacht lang. Selecteer de volgende dag een virusproducerende cellijn uit de PA three 17-cellen door antibiotica in een concentratie van 0,5 milligram per milliliter aan het medium toe te voegen wanneer de cellen bijna confluent zijn; oogst het supernatant van de cellen drie keer met intervallen van 12 uur.Filter de collecties na elke oogst. Het filtraat is het werkbare virale supernatant. Verdeel dit in aliquots van één milliliter.Zet enkele aliquots apart voor onmiddellijk gebruik. De extra aliquots kunnen worden bewaard bij -80 °C, maar verliezen 50% efficiëntie bij elke vries-dooi-cyclus. Houd er rekening mee dat gedurende het hele proces apparatuur die in contact is geweest met de virale deeltjes met bleek moet worden gewassen voordat deze in de afvalbak wordt geworpen.Om de stabiele PA drie 17 virus-producerende cellijn permanent te bewaren, worden de cellen ingevroren in 10% DMSO en 90% serum en bewaard bij -150 °C. Voeg aan elke put met gezuiverde cellen in een six-well plaat 400 µL vers geproduceerd viraal supernatant toe. Laat twee putten zonder virus als controles.Incubeer de plaat een nacht en vervang de volgende dag het medium in elke well door 2,5 milliliters vers spiermedium. Zorg ervoor dat het medium en de pipetten die virale deeltjes bevatten, in de bleekcontainer worden weggegooid. Laat de cellen drie dagen incuberen in het verse spiermedium.Selecteer vervolgens de cellen op antibioticaresistentie met 400 µg neomycine per ml voor CDK4-infectie, of 300 µg hygromycine per ml voor menselijke telomerase-reversetranscriptase-infectie gedurende één tot twee weken. Houd de cellen onder selectieve condities tot alle cellen in de controleputjes zijn afgestorven.Subcultiveer de cellen altijd voordat ze confluent worden; zelfs tijdens de selectie, wanneer ze een confluentie van 60 tot 80% bereiken, gebruikt u een 0,05% tripsine-EDTA-oplossing om de cellen te oogsten en over te zaaien. Zaai de cellen uit in petrischalen van 10 centimeter met vers myoblastmedium met antibiotica. Zaai de cellen in eerste instantie uit bij een zeer lage dichtheid van 3 tot 500 cellen per schaal van 10 centimeter.Houd de cellen in deze schalen gedurende ongeveer twee weken aan tot er kleine kolonies van 10 tot 20 cellen gevormd zijn en deze kleine kolonies duidelijk zichtbaar zijn. Verwijder het grootste deel van het medium en laat slechts een dunne laag medium achter om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Doop nu één zijde van een cloneringsring in siliconenvacuümvet en plaats de ring over een gewenste kloon.Teken een aparte ring rond elke gewenste kloon in elke ring. Voeg een paar druppels trypsin-EDTA-oplossing toe. Wanneer de cellen afgerond worden, gebruik dan een microscoop om elke celbal voorzichtig op te zuigen in een 200 µL pipetpunt.Breng de celbolletjes over naar putjes van de kleinste beschikbare multi-wellplaat. Breid vervolgens elke kloon naar behoefte uit om confluentie te voorkomen. Met behulp van het beschreven protocol werden myogene cellen geïsoleerd samen met fibroblasten, adipogene cellen en mogelijk immuuncellen, en vervolgens gezuiverd via FACS.De cellen werden vervolgens geïmortaliseerd zoals beschreven met behulp van virussen die cycline-afhankelijke kinase vier, CDK4, en menselijk telomerase reverse transcriptase, hTERT, tot expressie brengen. Het was cruciaal om de schalen bij elke stap onder confluency te houden, aangezien de cellen anders in het differentieprogramma konden treden en myotubes konden vormen. Bij het vergelijken van de vorming en contractie van myotubes in niet-geïmortaliseerde controlecellen en de geïmortaliseerde cellen werden geen verschillen waargenomen.De immobiliteit van de cellijn werd bevestigd door de telomeerlengte en de telomeeractiviteit te meten. De immobiliteit was ook duidelijk zichtbaar in de celgroeicurves. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u primaire spiercellen uit een biopsie van een patiënt kunt dissociëren.Immortaliseer de primaire myoblast en isoleer en selecteer geïmmortaliseerde myogene klonen. Vergeet niet dat het werken met virussen het gebruik van een specifieke weefselkweekkap en een beveiligd ventilatiesysteem vereist. Daarnaast moet alles dat betrokken is bij de virusmanipulatie, zoals pipetten, tips, schaaltjes, spuiten en filters, worden behandeld met bleekmiddel om ongewenste contaminatie te voorkomen.Virale deeltjes kunnen gevaarlijk zijn en daarom moeten er altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

isolation-immortalization-patient-derived-cell-lines-from-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Dit protocol maakt gebruik van elektroporatie om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren en tot expressie te brengen in muisspiervezels. Na herstel na elektroporatie worden de vezels geïsoleerd. Individuele vezels worden vervolgens geïmaged met behulp van hoge resolutie confocale microscopie om de spierstructuur te visualiseren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

Hier beschrijven we een methodologie om een ​​pure bevolking van menselijke myoblasten te verkrijgen uit volwassen spierweefsel. Deze cellen worden gebruikt om in vitro skeletspierdifferentiatie te bestuderen en in het bijzonder om eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering te bestuderen.

Isolatie van Menselijke Myoblasten, Beoordeling van Myogene Differentiatie, en Opslag Met Calcium Ingangsmeting

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel.  hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.

Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Dit protocol beschrijft de omzetting van huidfibbroblasten in myoblasten en hun differentiatie in myotubes. De cellijnen zijn afgeleid van patiënten met neuromusculaire aandoeningen en kunnen worden gebruikt om pathologische mechanismen te onderzoeken en therapeutische strategieën te testen.

Directe herprogrammering van menselijke fibroblasten in myoblasten om therapieën voor neuromusculaire aandoeningen te onderzoeken

Dit protocol beschrijft de isolatie van spierstamcellen en fibro-adipogene voorlopers uit individuele skeletspieren bij muizen. Het protocol omvat enkelvoudige spierdissectie, stamcelisolatie door fluorescentie-geactiveerde celsortering, zuiverheidsbeoordeling door immunofluorescentiekleuring en kwantitatieve meting van S-fase-invoer door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-incorporatietest.

Isolatie van rustige stamcelpopulaties van individuele skeletspieren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Leer spiercellen isoleren en immortaliseren uit menselijke patiëntbiopten voor ziekteonderzoek. Deze methode biedt een onbeperkte bron van myogene cellen voor medicijnscreening en diagnostische toepassingen.

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

Meer video's verkennen