Name: In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Leer functionele karakterisering van colorectale zenuwuiteinden bij muizen met single-fiber elektrofysiologische opnamen. Deze methode helpt onderzoekers sensorische innervatie en pijnmechanismen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteund door NIH-subsidie R01 DK093525 (GFG). We waarderen de wetenschappelijke beoordeling en grammaticale bewerking van het manuscript door Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) zeer en danken Michael Burcham voor de hulp bij het voorbereiden van de figuren.

OPMERKING: Dit protocol werd beoordeeld en door de Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en gebruik goedgekeurd. 1. Voorbereiding van de Modified Krebs Solution en Test van de Drug Hoeveelheden <ol><li> Voeg 6 l gemodificeerde Krebs oplossing die bevat (in mM): NaCl 117,9, KCl 4,7, 25 NaHCO3 1.3 NaH 2PO 4, 1,2 MgSO4, 2,5 CaCl2, 11,1 D-glucose, 2 natrium butyraat, 20 natriumacetaat , 0,004 nifedipine (spontane spiersamentrekkingen te blokkeren), en 0,003 indomethacine (tot synthese van endogene prostaglandines te blokkeren). Gebruik ijskoud en warm Krebs oplossingen voor weefsel dissectie en single-fiber-opname, respectievelijk. </li><li> Bereid elke chemische oplossingen (bv, IS, capsaïcine, ATP) in porties op de gewenste concentraties. </li></ol> 2. Dissectie van de dikke darm-zenuwweefsel <ol><li> Verdoven en euthanize mannelijke muizen (6-8 weken oud, 20 - 30 g) inCO 2 kamer bij een stroomsnelheid die 10 verplaatst - 30% van het kamervolume per minuut totdat muizen stoppen met ademen volledig zoals aangegeven door het ontbreken van beweging van de borstkas. </li><li> Onmiddellijk na euthanasie, exsanguinate door opensnijden de thoracale kamer, perforeren het rechter atrium, en onderdompelen van de muis karkas in een ruime volume (-500 ml) ijskoude Krebs (4 ° C) oplossing geborreld met carbogeen (95% O 2 , 5% CO2). </li><li> Verwijder voorzichtig alle ingewanden, maar de dikke darm en de bekkenorganen. Doorsnijden van de muis in de helft over de T12 spinale segment iets boven de thoracale middenrif en de overdracht van de caudale helft tot een dissectie kamer met ijskoud, geborreld Krebs oplossing. </li><li> Onder een stereomicroscoop, verwijder de blaas en de voortplantingsorganen door doorsnijden op hun kruispunten om de plasbuis, en verwijder de afdalende / abdominale aorta totdat het splitst in bekkenslagaders. Bevrijd de PN of de LSN uit hun surrounding weefsels door stompe dissectie en volg de zenuwen van buiten het bekken tot de ventrale instappunt in de L6 en S1 wervelkolom (voor PN) of T13 en L1 wervelkolom (voor LSN). </li><li> Snijd de symfyse en rechts en links acetabular gewrichten, en verwijder de iliacale bot. Zorgvuldig gratis ofwel de PN of LSN op de bijgevoegde spieren en bindweefsel van dicht bij de dikke darm tot waar de zenuw komt in de wervelkolom. </li><li> Reseceren zorgvuldig de iliacale bot aan de distale colorectum bloot. Ontleden de distale dikke darm met de bijgevoegde PN of LSN in continuüm. </li><li> Breng de dikke darm met de zenuw verbonden aan het bad compartiment van het weefsel kamer. Verwijder overmatig bindweefsel door verdere dissectie, en open de dikke darm lengterichting langs de anti-mesenteriale grens. </li><li> Met mucosale zijde omhoog, speld de mesenteriale rand van de dikke darm grenzend aan de opname compartiment in de siliconen basis van de chamber en bevestig de antimesenteric lengte van de dikke darm een hark haken verbonden met een kracht actuator (in figuur 1 en gefotografeerd in figuur 2A). </li><li> Verleng de PN of LSN in de opname compartiment dat is verbonden met het bad compartiment door een muizenhol en poort. Leg de zenuwbaan naar een klein glazen spiegel in de opname-compartiment, die een hydrofiel oppervlak voor het lef om zich te houden aan geeft. Superfuse het bad compartiment met warm (30-32 ° C), geoxygeneerde Krebs oplossing en vul de opname compartiment met minerale olie. </li></ol> 3. Single-fiber Opname en lokalisatie van de Receptief veld <ol><li> Schuif nu voorzichtig de epineurium (zenuwschede) uit de PN of LSN onder de stereomicroscoop bij een sterke vergroting (50 - 60X). Met behulp van fijne tang, plagen de zenuwbaan naar 5-8 zenuwbanen van ~ 100 micrometer dik. </li><li> Plaats de platina-iridium verwijzingelektrode in contact met de Krebs oplossing in het weefsel kamer. Opeenvolgend plaats de afzonderlijke zenuwbanen naar de registratie-elektrode gemaakt van hetzelfde materiaal. </li><li> Gebruik een zachte kwast om AP&#39;s uit de colorectale afferentia roepen door zachtjes strelen op en neer de colorectale oppervlak. Zoek de zenuw bundel (s) die de dikke darm innerveren door detecteerbare AP (actiepotentiaal) opnames. OPMERKING: De PN en LSN ook innerveren de urineblaas en andere organen in het bekken. </li><li> Gebruik een paar van 30 G naald tips om verder te splitsen van de zenuwbaan in fijne fascicle filamenten van ~ 10 micrometer dikte en plaats een individueel filament op de registratie-elektrode. </li><li> Plaats de round-tip concentrische elektrode loodrecht op het slijmvliesoppervlak elektrisch exciteren afferente uiteinden op suprathreshold stimulusintensiteit (10 mA magnitude 0,5 msec @ 0,3 Hz), die een mm radius van stroomspreiding ~ 2 produceert. Beweeg de elektrode systematisch (~ 1,5 mm stappen) Langs de lengte en breedte van de afgeplatte colorectum receptieve eindes lokaliseren. </li><li> Wanneer een afferente einde is enthousiast, stel de elektrode positie naar de site van de activering (receptieve veld, RF) dat minimaal stimulusintensiteit (prikkeldrempel) vereist lokaliseren. Gooi eindes met een stimulus drempel&gt; 3 mA 19. </li><li> Bereken de geleidingssnelheid (CV) van 1) de afstand tussen de stimulerende elektrode in het receptieve veld (RF) en de opname onderzocht en 2) de geleidingsvertraging (bijvoorbeeld figuur 2B) tussen het stimulus artefact en het begin van de actiepotentiaal . CV (m / sec) = afstand (mm) / geleiding vertraging (msec). </li></ol> 4. Functionele indeling van mechanosensitieve Colorectale afferenten <ol><li> Na het lokaliseren van een RF door elektrische stimulatie, gelden de volgende drie mechanische stimuli aan de RF: <ol><li> Het gedrag van de indringende prikkel door op de punt van een Calibrated von Frey-achtige nylon monofilament (0,4 en 1 g kracht) loodrecht naar de RF op de afgeplatte colorectum. </li><li> Het gedrag van de streelde stimulans door zachtjes strelen de colorectale slijmvlies met een fijne nylon filament streng (10 mg kracht) om een ​​klein oppervlak shear stress op de RF te genereren. </li><li> Voer de omtreksrichting uitrekken met een computergestuurde krachtactuatorstelsel, waarbij een hellend stuk kracht levert (0-170 mN bij 5 mN / sec) in omtreksrichting langs de anti-mesenteriale rand van de dikke darm door de hark haken in stap 2.8 beschreven . </li></ol></li><li> Classificeren afferentia als serosal (alleen reageren op stomp indringende), mucosale (reageren op mucosale strelen en stomp indringende), gespierd (reageren op de omtrek stretch en stomp indringende) gespierd / mucosale (reageren op de omtrek stretch, mucosale strelen en stomp indringende), of MIA (niet reageert op elk van de drie mechanische stimuli). </li><li> Voor mesenteriale afferentia (alleen inLSN innervatie) die moeilijk om selectief geactiveerd door elektrische stimulatie, vinden hun open einde mechanisch strelen / sonderen van het mesenterium. </li><li> Voor stretch-gevoelige afferenten (spier en spier-mucosale genoemd) de drempelwaarde, die wordt gedefinieerd als de kracht die de eerste AP oproept in oplopende rek. </li><li> Voor serosal afferenten, registreren hun reacties op oplopende niveaus van punctata sonderen van het receptieve veld aangedreven door de computergestuurde krachtactuator. </li></ol> 5. Chemische Toepassing / Modulatie van receptieve Endings <ol><li> Het opnemen van een basislijn reactie op een mechanische stimulus (dwz, als reactie op oplopende stretch, punctate sonderen, of mucosale strelen). </li><li> De vacht van de onderste rand van een stuk slang (messing of roestvrij staal, 10 mm hoog en 4 x 4 mm 2 vierkante of 4 - 5 mm diameter) met vaseline en plaats deze op de receptieve veld op de dikke darm. </li><li> Verwijderende Krebs oplossing in de buis en het blootstellen ontvankelijk uitgang 3 - 5 min naar 170 pl van de oplossing die de te testen chemische stof (fen). </li><li> Bewaken van de respons van de afferente tijdens chemische toepassing (sommige afferentia zijn chemotherapie gevoelig). </li><li> Verwijder de chemische oplossing en slang aan de werking van de chemische beëindigen. Binnen 4-6 minuten, test de afferente reactie op dezelfde mechanische stimulus in de basislijnreactie. </li><li> Opnieuw de mechanische stimulus opnieuw na voldoende lange wash-out (&gt; 15 min). </li></ol> 6. Opnemen en Discriminerende AP spikes <ol><li> Digitaliseren van de elektrische signalen opgenomen van axonen bij 20 kHz en de gegevens opslaan op een computer. Bekijk het signaal on-line door een audio-monitor. </li><li> Analyseer de AP spikes off-line en discrimineren afzonderlijke eenheden op basis van hoofdsom analyse van individuele spike golfvormen 25 component. OPMERKING: Een plaat mag niet meer th bevatteneen twee gemakkelijk onderscheidbare actieve eenheden. </li></ol>

<ol><li>Naliboff, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+two+distinct+perceptual+alterations+in+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome.</a> Gut. 41, 505-512 (1997).</li>
<li>Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+visceral+and+cutaneous+hyperalgesia+by+local+rectal+anesthesia+in+irritable+bowel+syndrome+%28IBS%29+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients.</a> Pain. 105, 223-230 (2003).</li>
<li>Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarectal+lidocaine+is+an+effective+treatment+for+abdominal+pain+associated+with+diarrhea-predominant+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome.</a> Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).</li>
<li>Chey, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linaclotide+for+irritable+bowel+syndrome+with+constipation%3A+a+26-week%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial+to+evaluate+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+12-week%2C+randomized%2C+controlled+trial+with+a+4-week+randomized+withdrawal+period+to+evaluate+the+efficacy+and+safety+of+linaclotide+in+irritable+bowel+syndrome+with+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).</li>
<li>Busby, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+properties%2C+metabolism%2C+and+disposition+of+linaclotide%2C+a+novel+therapeutic+peptide+approved+for+the+treatment+of+irritable+bowel+syndrome+with+constipation+and+chronic+idiopathic+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).</li>
<li>Mei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intestinal chemosensitivity.</a> Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).</li>
<li>Mei, N., Lucchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+data+and+ideas+on+digestive+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Current data and ideas on digestive sensitivity.</a> J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).</li>
<li>Su, X., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat+are+polymodal+in+character%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character.</a> J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).</li>
<li>McMahon, S. B., Morrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+neurones+with+long+projections+activated+from+the+abdominal+viscera+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat.</a> J Physiol. 322, 1-20 (1982).</li>
<li>Cervero, F., Sann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+evoked+responses+of+afferent+fibres+innervating+the+guinea-pig%27s+ureter%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study.</a> J Physiol. 412, 245-266 (1989).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+properties+of+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+urinary+bladder+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat.</a> J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).</li>
<li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+unmyelinated+afferent+fibres+by+mechanical+stimuli+and+inflammation+of+the+urinary+bladder+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat.</a> J Physiol. 425, 545-562 (1990).</li>
<li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+unmyelinated+chemosensitive+nociceptor+in+the+acutely+inflamed+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder.</a> Agents Actions. 25, 219-221 (1988).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).</li>
<li>Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+insensitive+afferents+%28MIAs%29+in+cutaneous+nerves+of+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey.</a> Brain Res. 561, 252-261 (1991).</li>
<li>Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unresponsive+afferent+nerve+fibres+in+the+sural+nerve+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat.</a> J Physiol. 435, 229-242 (1991).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irritable+bowel+syndrome%3A+methods%2C+mechanisms%2C+and+pathophysiology.+Neural+and+neuro-immune+mechanisms+of+visceral+hypersensitivity+in+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sensitization+of+mechanosensitive+and+-insensitive+afferents+in+mice+with+persistent+colorectal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+colorectal+afferent+function+associated+with+TNBS-induced+visceral+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).</li>
<li>Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+stretch-sensitive+pelvic+nerve+afferents+innervating+mouse+distal+colon+and+rectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).</li>
<li>Jolliffe, I. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJolliffe%2C+IT+%22Principal+component+analysis%22">Principal component analysis</a>. , 2nd, Springer. New York, NY. (2002).</li>
<li>La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+hypertonicity+and+acidity+modulate+colorectal+afferents+and+induce+persistent+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).</li>
<li>Christianson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plasticity+and+modulation+of+visceral+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">plasticity and modulation of visceral afferents.</a> Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).</li>
<li>Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+genetic+and+pharmacological+inhibition+of+TRPV1+and+P2X3+attenuates+colorectal+hypersensitivity+and+afferent+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).</li>
<li>Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystitis+increases+colorectal+afferent+sensitivity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).</li>
<li>Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+P2X+receptor+contributions+to+colon+mechanosensitivity+and+hypersensitivity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse.</a> Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+visceral+hypersensitivity+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+family+receptor+%CE%B1-3+in+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De in vitro colorectum zenuw bereiding beschreven blijkt een krachtige aanpak om neurale codering functies van individuele colorectale afferenten, die mooi aanvulling andere niet-functionele benaderingen (bijvoorbeeld cellulaire, moleculaire en histologische studies) op viscerale sensorische neuronen (bestuderen zie beoordeling 27 voor details). Neuronale mechanismen die bijdragen aan nociceptie en langdurige colorectale overgevoeligheid zijn geopenbaard en farmacologische manipulaties zijn ...

Pijn en overgevoeligheid zijn de belangrijkste klachten van patiënten met functionele gastro-intestinale aandoeningen, waaronder prikkelbare darmsyndroom (IBS), die bestaan ​​geen zichtbare pathobiological oorzaak of weefselschade. Bijvoorbeeld, IBS-patiënten vertonen overgevoeligheid, waaronder verhoogde respons op rectale ballondilatatie en verhoogde gevoeligheid tijdens normale darmfunctie, evenals overgevoeligheid somatische verwijzing (dwz tederheid palpatie van de buik) 1. Omdat targeting colorectale afferentia heeft bewezen effectief bij het ​​verlichten van pijn en overgevoeligheid bij IBS-patiënten (bijvoorbeeld intra-rectale instillatie van lokale anesthetica 2,3; orale inname van de guanylaatcyclase-C-agonist linaclotide 4-6) te zijn, een beter begrip van de afferente innervatie van de dikke darm is belangrijk. Visceraal afferente zenuwbanen, met inbegrip van colorectale afferenten, Kunnen reageren op chemische / voedselrijke en thermische modaliteiten (bijvoorbeeld 7-9). Echter, visceraal afferente zenuwbanen reageren op mechanische stimuli (dwz mechanosensitieve afferentia) zijn de meest grondig bestudeerd omdat mechanische stimuli (bv luminaal buik, stretch) zijn degenen die in het algemeen leiden tot bewuste sensaties, met inbegrip van ongemak en pijn 10-16. Daarnaast worden de ingewanden ook geïnnerveerd door het mechanisch ongevoelig afferenten (MIA), algemeen bekend als stille of slapen nociceptoren 17. Onder normale fysiologische omstandigheden, hoeft MIA niet reageren op mechanische stimulatie of hebben een zeer hoge respons drempels 18, maar kan actief worden en het verwerven van mechanische gevoeligheid in pathofysiologische omstandigheden en bij te dragen tot overgevoeligheid. Met behulp van de in vitro voorbereiding en de hier beschreven protocol, we ontwikkeld en gebruikt een elektrische prikkel strategie naar zee<html> RCH voor receptieve eindes, waardoor onpartijdige identificatie van zowel mechanosensitieve en MIA eindes in de dikke darm 19. De colorectale innervatie is afgeleid van lumbale splanchnisch (LSN) en bekkenzenuwstimulatie (PN) paden, en omvat colorectale afferentia die kunnen worden onderverdeeld in vijf mechanosensitieve klassen (serosal, mucosale, gespierd, gespierde-mucosale, mesenteriale) en een MIA klasse 20. Gebruik van deze in vitro bereiding, vonden we dat colorectale MIA verkregen mechanische gevoeligheid (gevoelig) na korte blootstelling hun receptieve velden een inflammatoire soep (IS), die 71% van MIA in de PN route en 23% van MIA in het LSN route gesensibiliseerde 19. We hebben ook gedocumenteerd langdurige sensibilisatie (tot 28 dagen) van MIA in de context van langdurige gedrags- viscerale hypersensitiviteit (dwz bij muizen die intracolonische behandelingen met zymosan 21 of 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; Onder mechanosensitieve afferenten, gespierd en gespierd-mucosale afferentia zijn de enige klassen die tonisch coderen omtrek stuk van de dikke darm (dat wil zeggen, zijn stretch-gevoelig) en bevordelijk de codering van schadelijke colorectale uitzetting 23,24. Met behulp van een computer-gestuurde krachtactuator, pasten wij een standaard, homogene en reproduceerbare opgevoerd rek in de omtreksrichting van de afgeplatte colorectaal weefsel en verder onderverdeeld stretch-gevoelige afferente een lage drempel en hoge drempel 23. Bovendien, het tijdsverloop van sensibilisatie van stretch -gevoelige afferentia na intracolonische zymosan 21 of 22 TNBS behandeling is het begin, persistentie en / of herstel van gedrags- viscerale hypersensitiviteit, suggereert een rol van stretch-gevoelige colorectale afferenten in viscerale pijn en overgevoeligheid.

<table><tbody><tr><td>Leica MZ16 stereomicroscoop</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica IC D camera</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versterker</td><td>World Precision instruments, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Low-noise differentiële versterker</td></tr><tr><td>Weefselkamer met twee compartimenten</td><td>Op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Data-acquisitie, analoog signaal invoer/uitvoer</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Softwarepakket dat werkt met de Power1401</td></tr><tr><td>Audio monitor</td><td>Natus</td><td>Am 8</td><td></td></tr><tr><td>Vierkante pulsstimulator</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>Voor het afgeven van elektrische stimuli</td></tr><tr><td>Foto-elektrische isolatie-eenheid</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Stimulusisolatie om ruis te verminderen</td></tr><tr><td>Concentrische bipolaire micro-elektrode</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>Voor het afgeven van elektrische stimuli</td></tr><tr><td>Dual-mode hefboomsysteem</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Serie 300C</td><td>Voor het afgeven van mechanische stimuli</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Pincet met fijne uiteinden</td></tr></tbody></table>

in vitro functionele karakterisering van de muis colorectale afferent endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Deze video toont in detail een in vitro single-fiber elektrofysiologische opname protocol met behulp van een muis colorectum-zenuw voorbereiding. De aanpak maakt het mogelijk onpartijdige identificatie en functionele karakterisatie van individuele colorectale afferenten. Extracellulaire opnames van gekweekte actiepotentialen (AP&#39;s) die afkomstig zijn van één of enkele afferente (dwz één vezel) receptieve velden (RFs) in de dikke darm zijn gemaakt van geplaagd zenuwvezel bundels. De dikke darm is verwijderd met ofwel het bekken (PN) of lumbale splanchnisch (LSN) zenuw bevestigd en lengterichting geopend. Het weefsel wordt in een opname kamer, vastgemaakt vlak en geperfuseerd met geoxygeneerde Krebs oplossing. Focal elektrische stimulatie wordt gebruikt om de colorectale afferente uitgangen, die verder worden getest door drie verschillende mechanische stimuli lokaliseren (blunt sonderen, mucosale strelen en omtrek rek) functioneel categoriseren afferente in vijf mechanosensitieve klassen. Endings reageren op geen van deze mechanische stimuli zijn gecategoriseerd als mechanisch-ongevoelige afferentia (MIA). Zowel mechanosensitieve en MIA kan worden beoordeeld sensibilisatie (bijv verbeterde respons, verminderde drempel en / of verwerving van mechanische gevoeligheid) van plaatselijke blootstelling van RFs voor chemicaliën (bijvoorbeeld inflammatoire soep (IS), capsaïcine, adenosine trifosfaat (ATP)). We beschrijven de apparatuur en de dikke darm-zenuw opname voorbereiding, de oogst van colorectum met aangehechte PN of LSN, identificatie van RFs in de dikke darm, single-fiber opname van zenuw bundels, en gelokaliseerde toepassing van chemicaliën om de RF. Bovendien worden problemen van het preparaat en gestandaardiseerde mechanische stimulatie besproken.

De opstelling wordt in figuur 1. Het omvat een op maat gemaakte weefsel kamer die de dikke darm in een siliconen beklede bad compartiment en de bijgevoegde zenuw in een aangrenzende minerale olie gevulde compartiment herbergt. De twee compartimenten kamer werd gefreesd uit een massief blok van acrylaat met een CNC machine; de onderkant van beide compartimenten werd vervolgens bekleed met stevige siliconen om eenvoudig pin naar beneden van het colorectaal weefsel mogelijk te maken. Extracellulaire AP&#39...

Deze video toont een protocol voor het uitvoeren van elektrofysiologische opnames van enkele vezels op een in vitro muis colorectum-zenuwpreparaat.

In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om extrinsieke afferente zenuwuiteinden in het rectum van de muis in vitro functioneel te karakteriseren. Dit wordt bereikt door de colorectale zenuwen en de daaraan verbonden bekken- of lumbale splanchnicuszenuw in continuüm te oogsten en het weefsel in een in vitro registratiekamer te plaatsen. In een tweede stap wordt de stam van de bekken- of lumbale splanchnicuszenuw gesplitst in fijne filamenten, zodat enkelvoudige vezel-elektrofysiologische registraties van individuele zenuwaxonen kunnen worden gemaakt. Vervolgens worden individuele colorectale zenuwuiteinden geïdentificeerd door onbevooroordeelde elektrische stimulatie van de receptieve velden en functioneel geclassificeerd op basis van de responsprofielen op drie verschillende mechanische stimuli.Daarnaast kunnen reacties op chemicaliën die inwerken op de zenuwuiteinden worden getest door het receptieve veld te isoleren met een stuk messing buis en de oplossing te vervangen door een oplossing die de chemische stof of een mengsel van chemicaliën bevat. De resultaten tonen aan dat de colorectale regio van de muis wordt geïnnerveerd door vijf verschillende klassen mechanogevoel

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the protocol for performing colonoscope-guided pinch biopsy in the mouse. This technique helps visually analyze the colon lumen and collect tissue samples for detailed studies.

Colonoscopic Guided Pinch Biopsy in a Mouse Model: A Technique to Visualize and Extract Tissue Samples from Mouse Colon

In this video, we describe a surgical procedure to generate mouse proximal colon loop or pcLoop segment followed by intraluminal injection of fluorescent markers into the segment to study the intestinal epithelial permeability.

Generation of Mouse Proximal Colon Loop Model: A Surgical Procedure to Generate Proximal Colon Loop and Measure Intestinal Permeability by Detection of Fluorescent Markers in Serum Following Intraluminal Injection

This video demonstrates a method to record the activity of colonic afferent nerves in an ex-vivo rat colon, cannulated at both ends and infused with saline to increase intraluminal pressure. As pressure increases, the nerve signal rises, indicating its stimulation.

Electrophysiological Recording from Colonic Afferent Nerves in an Ex Vivo Rat Colon

This video shows the process of recording electrical signals from mesenteric afferent nerves in a dissected mouse jejunal segment to study the effects of tissue pressure and movement changes on afferent nerve activity.

Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in an Ex Vivo Mouse Jejunum Segment

Source: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates calcium imaging to visualize and analyze the activity of enteric neurons and glia in mouse Colonic Myenteric plexus preparations.

Calcium Imaging of Enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus

We demonstreren een celkweekprotocol voor de directe studie van neuronale en gliale componenten van het enterische zenuwstelsel. Een gemengde neuron/glia-kweek op dekglasjes wordt bereid uit de myenterische plexus van een volwasen muis, waardoor het mogelijk is om de functie van afzonderlijke neuronen en gliacellen te onderzoeken door middel van elektrofysiologie, immunohistochemie, enz.

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

In de afgelopen jaren zijn nieuwe generatie endoscopen ontpopt als belangrijk diagnostisch onderzoek hulpmiddelen voor het evalueren van muizen colitis en colorectale tumoren. We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor endoscopische beoordeling van ontsteking en colorectale tumoren in muizen, evenals een nieuw scoresysteem dat decimale identifiers gebruikt om de endoscopische ernst van colitis en colorectale tumoren documenteren.

Flexibele colonoscopie in Muizen aan de ernst van colitis en Colorectale Tumoren Evalueer behulp van een gevalideerde Endoscopische Scoring System

We beschrijven methoden voor longitudinaal bewaken van de werkzaamheid van therapieën voor de behandeling van colonische pathologieën bij muizen met behulp van een star endoscoop. Dit protocol kan gemakkelijk worden gebruikt voor de karakterisering van de therapeutische respons van een individuele tumor in levende muizen en ook voor het monitoren van mogelijke ziekterecidieven.

Niet-invasieve evaluatie van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor Intestinale Pathologieën gebruik van een serieel Endoscopische Imaging van levende muizen

Dit artikel beschrijft een video-imagingtechniek en hoogwaardige ruimte-tijdelijke mapping om veranderingen in de neurale regulatie van colonische motiliteit bij volwassen muizen te identificeren. Subtiele effecten op gastro-intestinale (GI) functie kunnen worden gedetecteerd met behulp van deze aanpak in geïsoleerde weefselpreparaten om ons begrip van GI-ziekte te bevorderen.

Video Imaging en Maps Spatiotemporal om gastro-intestinale motiliteit analyseren in Muizen

Mesenterische afferente zenuwen dragen informatie over van het maagdarmkanaal naar de hersenen over normale homeostase en ook over pathofysiologie. De activiteit van de gastro-intestinale afferente zenuw kan worden beoordeeld door geïsoleerde darmsegmenten met aangehechte afferente zenuwen in een organenbad te monteren, de zenuw te isoleren en zowel basale als gestimuleerde activiteit te beoordelen.

In Vitro Registratie van Mesenteriale afferente zenuw activiteit in het Muis jejunale en Colonic Segmenten

Abnormale sensorische functie ten grondslag ligt aan viscerale pijn en andere symptomen van functionele en inflammatoire darmziekten. Een protocol voor het elektrofysiologische opname van de Colon afferent zenuwen in een ex vivo -voorbereiding van het rat-colorectum wordt hier gepresenteerd.

In Vitro Karakterisering van de elektrofysiologische eigenschappen van Colon Afferent vezels in ratten

Leer functionele karakterisering van colorectale zenuwuiteinden bij muizen met single-fiber elektrofysiologische opnamen. Deze methode helpt onderzoekers sensorische innervatie en pijnmechanismen te bestuderen.

In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings

Meer video's verkennen