In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings

Het algemene doel van het volgende experiment is om functioneel de extrinsieke afferente zenuwuiteinden in het muis co rectum in vitro te karakteriseren. Dit wordt bereikt door de colorectal en de aangehechte bekken of lumbale Splunk nek zenuw in continuüm te verzamelen en het weefsel in een in vitro opnamekamer te plaatsen Als tweede stap wordt de bekken of lumbale Splunk nek zenuwtak gesplitst in fijne filamenten zodat elektrofysiologische opnames van individuele zenuwaxonen kunnen worden gemaakt. Vervolgens worden individuele colorectale zenuwuiteinden geïdentificeerd door onbevooroordeelde elektrische stimulatie van de receptieve velden en functioneel geclassificeerd op basis van de responsprofielen op drie verschillende mechanische stimuli.

Bovendien kunnen reacties op chemicaliën die op de zenuwuiteinden worden toegepast, worden getest door het receptieve veld te isoleren met een stuk messing buis en de oplossing te vervangen door de oplossing die het chemisch of het mengsel van chemicaliën bevat. De resultaten tonen aan dat muis colorectal wordt geïnnerveerd door vijf verschillende klassen van mechanogevoelige ens. Bovendien is ongeveer 25%van de colorectale ens mechanisch ongevoelig of stille nociceptoren.

Deze methode wordt door ons en anderen gebruikt om de sensorische innervatie van de colorectale te bestuderen. We zijn geïnteresseerd in deze onderzoeksbenadering omdat veel gastro-intestinale aandoeningen geassocieerd zijn met sensibilisatie of een verandering in de prikkelbaarheid van de sensorische innervatie. Onze interesse in het begrijpen van de mechanismen van sensibilisatie houdt verband met onze wens om therapeutische strategieën te helpen ontwikkelen die dan nuttig kunnen zijn om de pijn en het ongemak dat typisch geassocieerd is met deze gastro-intestinale aandoeningen, zoals het prikkelbare darm syndroom, te moduleren.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de weefseldissectie en de zenuwsplitsingsstappen erg moeilijk te beheersen zijn. De zenuwen innoveren. De distale colorectal kan gemakkelijk worden beschadigd tijdens de dissectie.

Daarom zijn een zorgvuldige dissectie en zenuwsplitsingsstappen echt cruciaal voor degenen die dit experiment willen repliceren. Direct na het euthanaseren van een muis, ontbloed het, snijd de borstkas open, perforeer het rechter atrium en dompel het muizenkarkas onder in ongeveer een halve liter ijskoud Creb-oplossing. Vervolgens verwijdert u voorzichtig alle viscera behalve de dikke darm en de bekkenorganen.

Snijd vervolgens het lichaam van de muis bij ongeveer T 12 iets boven het borstbeen en breng de coddle-helft van het lichaam over naar een dissectiekamer met ijskoud, bellen crebs oplossing. Verwijder onder een stereoscoop de blaas en de voortplantingsorganen door te transecteren op hun verbindingen met de urethra. Verwijder ook de aflopende aorta totdat deze zich splitst in de gewone iliacale slagaders.

Bevrijd nu de bekken of lumbale splank nek zenuwen van de omringende weefsels. Volg de zenuwen van buitenaf de iliacale kam tot aan hun ingang in de wervelkolom. De bekkenzenuwen komen binnen in de L zes en S een wervelkolom en de lumbale splank zenuwen komen binnen in T 13 en L een gedemonstreerd.

Hier is de dissectie van de linker- en rechterbekkenzenuwen. Snijd vervolgens de openbare synthese en de rechter en linker acetabulaire gewrichten. Verwijder vervolgens het iliacale bot Na het verwijderen van het iliacale, dissecteert u de distale colorectal met de aangehechte zenuw Vrij.

De aangehechte zenuw van het omringende spierweefsel en bindweefsel. De zenuw is vatbaar voor mechanische schade. We zijn bevrijd van zijn omringende weefsel, dus speciale zorg moet worden gegeven om het zenuw uittrekken of knijpen te voorkomen.

Breng vervolgens de colorectal met de aangehechte zenuw over naar de weefselkamer. Open de colorectal longitudinaal langs de anti mesenterische rand en plaats de colorectal mucosale zijde omhoog. Strek vervolgens de zenuw uit in het opnamecompartiment, dat door een muizengat en poort met het badcompartiment is verbonden.

Plaats de zenuwtak op een klein glas spiegel. De spiegel is hydrofiel en de zenuw zal eraan hechten. Plaats nu naast het opnamecompartiment de mesenterische rand van de colorectal vast.

Superfuseer nu een badcompartiment met warme geoxideerde Creb-oplossing en vul het opnamecompartiment met minerale olie om de opstelling te voltooien. Bevestig de anti-mesenterische lengte van de colorectal aan een haak van haken die is verbonden met een krachtactor onder de stereomicroscoop bij hoge vergroting. Schil voorzichtig de zenuwscheds van de geïsoleerde bekken of lumbale splank nek zenuw af met behulp van fijne pincetten.

Scheur de zenuwtak in vijf tot acht zenuwbundels die elk ongeveer 100 micron dik zijn. Plaats nu de referentie-elektrode in contact met de Krebs-oplossing in de weefselkamer. Plaats vervolgens de individuele zenuwbundels achtereenvolgens op de opname-elektrode om actiepotentialen van de colorectale ens te evokeren.

Strijk voorzichtig over het colorectale oppervlak met een zachte verfkwast. Identificeer zo het zenuwbundel of zenuwbundels dat de dikke darm innerveert. Gebruik nu een paar naaldtips van 30 gauge om het zenuwbundel verder te splitsen in filamenten van 10 micron dik en plaats een van de filamenten op de opname-elektrode.

Deze stap vereist een hoog niveau van oog-handcoördinatie en handigheid. Om vervolgens de afferente zenuwuiteinden elektrisch te stimuleren, plaatst u de ronde, getipte concentrische elektrode loodrecht op het mucosale oppervlak en stimuleert u met een supradrempelintensiteit. Dit produceert een stroomverspreiding over een straal van twee millimeter.

Om receptieve uiteinden te vinden, beweeg de elektrode systematisch in stappen van 1,5 millimeter langs de lengte en breedte van het afgeplatte co rectum. Wanneer een afferente uiteinden wordt gestimuleerd, pas dan de elektrodepositie en stimulusintensiteit aan om het receptieve veld te lokaliseren dat de minste stimulusintensiteit vereist om te reageren. Als de stimulusdrempel groter is dan drie milliamps, verwerp dat zenuwuiteinde en ga door met het bestuderen van een ander zenuw