Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Het algemene doel van het volgende experiment is om dynamische klemmen in vitro uit te voeren in corticale neuronen met behulp van de vrij beschikbare softwaretoolbox, LCG. Dit wordt bereikt door het voorbereiden van plakjes van de somatosensorische cortex van een rat voor patch clamp-opnames van de parametal-cellen. Als tweede stap wordt een reeks geautomatiseerde elektrofysiologische protocollen toegepast op de opgenomen cel, wat een standaard karakterisering van de cel biedt die nuttig zal zijn voor latere analyses en vergelijkingen tussen celtypen.

Vervolgens wordt de injectie van exciterende en remmende synaptische gebeurtenissen gesimuleerd. Om de hoge geleidingstoestand na te bootsen die door de neocorticale neuronen in vivo wordt ervaren, laten de resultaten zien hoe achtergrondsynaptische injectie de versterking van de corticale cellen moduleert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de mogelijkheid om experimentele opnames in te bedden in meer gecompliceerde werkstromen door bijvoorbeeld het resultaat van één experimenteel protocol te gebruiken als de invoer voor een ander protocol.

Deze methode kan helpen bij het standaardiseren van elektrofysiologische protocollen, het versnellen van gegevensanalyse en heeft de weg gebaand voor gegevensdeling tussen laboratoria. Hoewel deze methode oorspronkelijk werd ontwikkeld voor groothandel patch CLA-opnames in vitro, kan deze ook gemakkelijk worden gebruikt voor andere experimentele bereidingen en protocollen, zoals in vivo patch, CLA-opnames of acceler-opnames met micro naar arrays de race. Nadat de rattenhersenen zijn verwijderd, gooit u het cerebellum weg en scheidt u de twee hemisferen langs de middenlijn met een scalpel, verwijdert u overtollig vocht uit een van de hemisferen en plakt u deze op een schuine platform met een druppel superlijm.

Voeg vervolgens snel een paar druppels CSF toe bovenop de hersenen en breng deze over naar de Vibram-kamer. Verwijder de eerste 2,5 tot drie millimeter van het hersenweefsel met een mes. Pas daarna de snijsnelheid en frequentie aan om de schade aan het oppervlak van de snede te beperken.

Stel vervolgens de dikte in op 300 micrometer en begin met snijden. Zodra het mes voorbij de cortex is gegaan, gebruikt u een scheermesje of een gebogen naald om een snede te maken boven de hippocampus en aan de randen van het corticale gebied van belang. Breng daarna de plakjes over naar een multi-well incubatiekamer op 36 graden Celsius.

Plaats in deze procedure een plakje in de opnamekamer met de 40 x vergrotingslens. Zoek naar gezonde cellen in laag vijf en 600 tot 1000 micrometer. Onder het oppervlak van de hersenen hebben deze cellen meestal een lagere contrast, een gladde uitstraling en zijn ze niet opgezwollen.

Zodra een gezonde cel is gevonden, laadt u een derde van de micropijp met intracellulaire oplossing. Plaats het vervolgens in de hoofdtrap in het vooraf geconfigureerde Linux-besturingssysteem. Start een opdracht.

Shell voegt zijn prompt toe. Typ deze opdracht om ervoor te zorgen dat de data-acquisitiekaart de versterker niet aanstuurt. Breng vervolgens 30 tot 50 millibar positieve druk aan door de zuiger van de spuit in te drukken, die is verbonden met de pijphouderbevestiging.

Plaats vervolgens de pijp ongeveer 100 micrometer boven de snede en beweeg de pijp naar de doelcel met behulp van de benaderingsmodus van de microm manipulator. Pas daarna de pijpoffset op de elektrofysiologieversterker aan en genereer een 10 millivolt testpuls in spanningsklemmodus. Gebruik de opdracht LCG SEAL test om de pijpweerstand te controleren en verminder vervolgens de druk tot 10 tot 30 millibar door de zuiger van de spuit terug te trekken.

Benader voorzichtig de cel en controleer de vorming van een kuiltje door het beeld op de videocameramonitor te observeren. Controleer tegelijkertijd een toename in weerstand veroorzaakt door de testpuls door de huidige golfvorm op het scherm te bekijken. Wanneer er een toename in pijpweerstand en de vorming van een kuiltje op de cel is, laat u onmiddellijk de druk los en brengt u voorzichtige negatieve druk aan op de pijp om de vorming van de afdichting te helpen.

Tegelijkertijd verlaagt u geleidelijk het houdpotentieel tot negatief 70 millivolt. Breng zachte zuiging aan om de celmembraan te scheuren en de gehele celconfiguratie tot stand te brengen. Kenmerk vervolgens de cel in termen van zijn elektrische eigenschappen.

Gebruik de opdracht LCGE-code. Hier is de gemiddelde actiepotentiaal van een gepatchte laag vijf parametal-neuron met een drempel van negatief 50,5 millivolt. Deze figuur toont de meting van passieve reacties op de hyperpolariserende stromen.

De identificatie van de basisactieve eigenschappen van de cel onthult dat de cel een regelmatig spikende neuron is, en er is minimale aanpassing om gesimuleerde exciterende, post-synaptische potentiaalveranderingen in de map te injecteren waar de volgende experiment wordt opgeslagen door deze opdracht in te typen bij de opdrachtprompt van de shell. In plaats van te werken op conventionele hardwarebesturingen van de versterker. Om brugbalancering en capacitieve compensatie toe te passen, schat de elektrodekerne die nodig is om de actieve elektrodecompensatie uit te voeren door deze opdracht uit te geven.

De volledige kernel is de som van twee componenten, een snelle elektrodekernel en een langzamere membraankernel die aanleiding geeft tot de exponentiële staart die wordt waargenomen in de volledige kernel. De eerste vormt een niet-parametrisch model van de pijp. Bij stroominjectie om membraan- en elektrodekernen te scheiden, zal de LCG-kernelopdracht de gebruiker vragen naar het aantal punten dat de snelle elektrodekern samenstelt. Selecteer vervolgens een nummer zodat de elektrodekern het einde van de exponentiële vervalstaart bedekt.

Voer vervolgens het dynamische klempoging uit met behulp van deze opdracht. Visualiseer tenslotte de resultaten. Hier is de recreatie van in vivo-achtige activiteit met behulp van dynamische klemmen.

Rode en blauwe sporen vertegenwoordigen respectievelijk de simulatie van exciterende en remmende synapsen. En hier zijn de spanningssporen opgenomen van een L vijf parametal-neuron, die werd onderworpen aan een bombardement van exciterende of remmende post-synaptische stromen. De