Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Het algemene doel van het volgende experiment is om in vitro dynamic clamp uit te voeren in corticale neuronen met behulp van de freely available software toolbox, LCG. Dit wordt bereikt door coupes van de somatosensorische cortex van ratten voor te bereiden voor patch clamp-registraties van de parametale cellen. Als tweede stap wordt een reeks geautomatiseerde elektrofysiologische protocollen toegepast op de geregistreerde cel, wat een standaardkarakterisering van de cel oplevert die nuttig zal zijn voor daaropvolgende analyses en vergelijkingen tussen celtypen.

Vervolgens wordt de injectie van excitatoire en inhibitoire synaptische gebeurtenissen gesimuleerd. Om de toestand van hoge conductantie te recreëren die neocorticale neuronen in vivo ervaren, laten de resultaten zien hoe achtergrondsynaptische injectie de gain van de corticale cellen moduleert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is de mogelijkheid om experimentele opnames in complexere workflows in te bedden door bijvoorbeeld het resultaat van het ene experimentele protocol te gebruiken als input voor een ander protocol.

Deze methode kan helpen bij het standaardiseren van elektrofysiologische protocollen, de data-analyse versnellen en de weg vrijmaken voor het delen van gegevens tussen laboratoria. Hoewel deze methode oorspronkelijk is ontwikkeld voor whole-cell patch CLA-registraties in vitro, kan deze ook gemakkelijk worden gebruikt voor andere experimentele preparaten en protocollen, zoals in vivo patch, CLA-registraties of acceler-registraties met micro-arrays. Verwijder na het extraheren van de rattenhersenen het cerebellum en scheid de twee hemisferen langs de middellijn met een scalpel; verwijder overtollig vocht van een van de hemisferen en plak deze met een druppel secondelijm op een hellend platform.

Voeg vervolgens snel een paar druppels CSF toe over de hersenen en breng deze over naar de Vibram-kamer. Verwijder de eerste 2,5 tot drie millimeter van het hersenweefsel met een mesje. Pas daarna de snijsnelheid en frequentie aan om schade aan het snijvlak te beperken.

Stel vervolgens de dikte in op 300 micrometers en begin met het snijden. Zodra het mesje voorbij de cortex is, gebruikt u een scheermesje of een gebogen naald om een inkeping boven de hippocampus en aan de randen van het corticale gebied van belang te maken. Breng de coupes daarna over naar een multi-well incubatiekamer bij 36 graden Celsius.

Plaats bij deze procedure een slice in de registratiekamer met de 40x vergrotinglens. Zoek naar gezonde cellen in laag vijf en 600 tot 1000 micrometers onder het breinoppervlak; deze cellen hebben gewoonlijk een lager contrast, een glad uiterlijk en zijn niet gezwollen.

Zodra er een gezonde cel is gevonden, vult men een derde van de micropipet met intracellulaire oplossing. Plaats deze vervolgens in de headstage in het vooraf geconfigureerde Linux-besturingssysteem. Start een commando.

De shell voegt zijn prompt toe. Typ dit commando om er zeker van te zijn dat de data-acquisitiekaart de versterker niet aanstuurt. Breng vervolgens 30 tot 50 millibar positieve druk aan door op de zuiger van de spuit te drukken, die verbonden is met de pipethouder.

Plaats vervolgens de pipet ongeveer 100 µm boven de slice en beweeg de pipet naar de doelcel met behulp van de approach-modus van de micromanipulator. Pas daarna de offset van de pipet aan op de elektrofysiologische versterker en geef een testpuls van 10 mV af in voltage-clamp-modus. Gebruik het commando LCG SEAL test om de weerstand van de pipet te monitoren en verlaag vervolgens de druk naar 10 tot 30 mbar door de zuiger van de spuit naar achteren te trekken.

Benader de cel voorzichtig en controleer op de vorming van een kuiltje door het beeld op de videocameramonitor te observeren. Monitor tegelijkertijd een toename in de weerstand die wordt opgewekt door de testpuls door de stroomgolfvorm op de monitor in de gaten te houden. Wanneer er een toename in de pipetweerstand optreedt en er een kuiltje op de cel wordt gevormd, laat dan onmiddellijk de druk los en breng een lichte negatieve druk aan op de pipet om de vorming van de seal te ondersteunen.

Verlaag ondertussen geleidelijk de rustpotentiaal naar negatief 70 millivolt. Pas een lichte zuigkracht toe om het celmembraan te laten scheuren en de whole-cell configuratie te vestigen. Karakteriseer vervolgens de cel op basis van de elektrische eigenschappen.

Gebruik van de LCGE-code. Hier is het gemiddelde actiepotentiaal van een gepatchte neuron in laag vijf van de parametale cortex met een drempelwaarde van -50,5 millivolt. Deze figuur toont de meting van passieve responsen op hyperpolariserende stromen.

De identificatie van de basisactieve eigenschappen van de cel onthult dat de cel een regular spiking neuron is, en dat er minimale adaptatie is bij het injecteren van gesimuleerde excitatoire postsynaptische potentialen. Wijzig de map waarin het volgende experiment wordt opgeslagen door dit commando in de shell-opdrachtprompt te typen, in plaats van de conventionele hardwarebediening van de versterker te gebruiken. Om bridge-balancering en capaciteitscompensatie toe te passen, schat de benodigde elektrodekernel voor het uitvoeren van de actieve elektrodecompensatie door dit commando uit te voeren.

De volledige kernel is de som van twee componenten: een snelle elektrodekernel en een tragere membraankernel die verantwoordelijk is voor de exponentiële staart die in de volledige kernel wordt waargenomen. De eerste vormt een niet-parametrisch model van de pipet. Bij het injecteren van stroom om de membraan- en elektrodekernels te scheiden, zal het LCG-kernelcommando de gebruiker vragen om het aantal punten dat de snelle elektrodekernel samenstelt. Selecteer vervolgens een getal zodanig dat de elektrodekernel het einde van de exponentiële vervalstaart beslaat.

Voer vervolgens het dynamische klemexperiment uit met dit commando. Visualiseer ten slotte de resultaten. Hier volgt de reproductie van in vivo-achtige activiteit met behulp van een dynamische klem.

De rode en blauwe lijnen representeren respectievelijk de simulatie van excitatoire en inhibitoire synapsen. Hier zijn de voltagesporen opgenomen van een L5 parametaal neuron, dat werd blootgesteld aan een bombardement van excitatoire of inhibitoire postsynaptische stromen. De overeenkomstige excitatoire, inhibitoire en totale stroom die in de cel werd geïnjecteerd, worden in de grafiek getoond.

De rasterplot van de spikes die over 20 trials zijn gegenereerd, laat zien dat het neuron extreem betrouwbaar en nauwkeurig kan reageren op dezelfde input. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dynamische lamp-experimenten kunt uitvoeren met behulp van de vrij beschikbare software toolbox LCG. Deze procedure kan worden uitgebreid naar andere closed-loop protocollen om een breed scala aan onderwerpen te onderzoeken, variërend van neurale exciteerbaarheid tot complexe netwerkinteracties.