Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme
8 januari 2015
Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.
Het algemene doel van de volgende experimenten is om de verspreiding en complexe toxiciteit van PreOn-achtige eiwitten te onderzoeken met behulp van het metazoaanse modelorganisme C elegans. Dit wordt bereikt door het intra- en intercellulaire transport van blaasjes die het PreOn-achtige eiwit bevatten te volgen met behulp van time-lapse fluorescentiemicroscopie. Vervolgens worden weefselspecifieke vouwensensoren en ubikwitisch tot expressie gebrachte stress.
Reporters gebruikt om celautonome en niet-celautonome effecten op cellulaire fitheid te evalueren. Vervolgens wordt een genoombreed RNAi-screen uitgevoerd om nieuwe modificatoren van PreOn-geïnduceerde toxiciteit te identificeren. Het screen wordt uitgevoerd in vloeibare cultuur met gebruik van thrashing als afleeswaarde voor toxiciteit.
Ten slotte wordt worm tracker, een plugin voor image J, gebruikt om de beweging van C elegans in combinatie te kwantificeren. Deze methoden maken het mogelijk om genetische paden te onderscheiden die betrokken zijn bij de intercellulaire beweging van PreOn-achtige eiwitten en hun niet-celautonome toxiciteit. Na het voorbereiden van gesynchroniseerde zee-elegans controle en PreOn-domein transgene lijnen en 10% agros pads, volgens het bijbehorende tekstprotocol, pipet drie microliter van 100 nanogram polystyreenkralen en drie microliter van vier millimolair limassol in de agros pad.
Gebruik een platinadraad om wormen op de gewenste leeftijd van een plaat in de oplossing te brengen en gebruik een dekglas om de wormen te bedekken om de wormen op subcellulair niveau af te beelden. Plaats een dia in de dia-houder van een confocale microscoop en gebruik een 63 x of 100 x 1.4 NA olie-objectief. Open vervolgens METAMORPH en selecteer multidimensionale acquisitie.
En onder het hoofdtabblad, vink de vakjes aan voor time lapse en voer tijdschriften uit. Onder het tabblad opslaan, selecteer of maak de mapmap voor het opslaan van bestanden en geef een naam aan het bestand. Onder het tabblad golflengte, gebruik Yoko quad rood of een equivalent van MRFP-beeldvorming en pas de belichting aan tussen 100 en 300 milliseconden en de cameraversterking tussen 100 en 300. Vervolgens, onder het tabblad time lapse, stel de tijdsinterval in op één seconde, duur op vijf minuten en het aantal tijdstippen op 301.
Onder het tabblad tijdschriften. Selecteer voor het tijdschrift een FC-set, Z-houder en een FC-terugkeer naar Z-houder voor type selecteer speciaal twee keer en voor het beginpunt, selecteer start van tijdstip en einde van tijdstip. Wanneer de setup klaar is, drukt u op verwerven. Volgend deze procedure, kunnen andere methoden zoals deeltjestraceringstoepassingen worden gebruikt om de dynamische eigenschappen van dis cus te meten.
Na het synchroniseren van priondomein transgene en while-type nematoden en het kopiëren van de inger RNAI-bibliotheekplaten volgens het tekstprotocol, incubeer gedupliceerde RNAi-platen bij 37 graden Celsius en 300 RPM om HT one 15 E coli-bacteriën met de lege vector L 4 4 4 0 als controle te gebruiken. Kweek het afzonderlijk in een kweekbuis en gebruik vervolgens een multikanaals pipette om 65 microliter van de kweek in een kwart van de putjes van 2 96. Welplaten met een geautomatiseerde werkstation met een multikanaals hoofd gedispenseerd.
10 microliter van vijf, millimolair van verdunde IPTG in elk putje van de RNAi-bacteriën en controleplaten. Verzegeld ze opnieuw voordat je ze gedurende drie uur incubeert terwijl de bacteriën incuberen. Meng gesynchroniseerde wilde type controle en transgene L een larven en M negen buffer goed en pipet vijf tot 10 microliter op een glazen microscoop.
Tel de wormen op de dia en bereken het aantal wormen per microliter. Na de drie uur durende bacteriële incubatie, verwijder de platen uit de incubator en laat ze komen tot kamertemperatuur om warmtestress van de wormen te voorkomen. Vervolgens supplementeer de M negen buffer met IPTG cholesterol en antibiotica volgens het tekstprotocol.
En voeg het geschikte volume van PreOn-domein transgene wormoplossing toe aan een eindconcentratie van 15 wormen per microliter mix om gelijkmatig te verdelen. Vervolgens geeft u 50 microliter in elk putje van de RNAi-platen en de putjes van een van de lege vector controleplaten. Geef wilde type wormoplossing in de tweede controleplaat.
Laat vervolgens alle platen onafgesloten om aëratie toe te staan en om te voorkomen dat de vloeibare kweek uitdroogt door vier tot vijf platen samen te stapelen, ze te omwikkelen met een vochtige papieren handdoek gevolgd door aluminiumfolie. Incubeer de platen bij 20 graden Celsius en 200 RPM gedurende vier dagen. Gebruik voor de platen een Falcon four M 60-camera verbonden met een computer met een monitor om visueel te screenen op verhoogde thrashing vergeleken met controle behandelde PreOn-domein transgene dieren.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een geautomatiseerd werkstation voor vloeistofbehartiging om de wormen in de R RNAi-platen te verdelen, is dat het de variabiliteit en het aantal wormen per putje aanzienlijk vermindert. Om een mobiliteitstest op vaste platen uit te voeren en kandidaat-RNAi-klonen te valideren, kweek RNAi-bacteriën overnacht volgens het tekstprotocol. Gebruik vervolgens een millimolair IPTG om de expressie van DS RNA gedurende drie uur te induceren.
Gebruik 150 microliter van elke RNAi-bacterieklonen om eerder voorbereide NGM-platen te zaaien die zich verspreiden in een dunne laag. Laat de bacteriën twee dagen drogen bij kamertemperatuur in het donker onder een stereomicroscoop. Bepaal de hoeveelheid gesynchroniseerde wormen en suspensie zoals eerder beschreven en voeg 25 tot 30 L een larven toe aan elke experimentele plaat.
Incubeer de nematoden bij 20 graden Celsius gedurende vier dagen tot de wormen zijn. De tweede dag van volwassenheid om wormmobiliteit te kwantificeren, zet de camera en de eenvoudige PCI-beeldvormingssoftware aan. Klik op het camerapictogram om aanpassing van de beeldvormingscondities mogelijk te maken.
Stel vervolgens de beeldvormingscondities in zoals hieronder. Stel de versterking in op nul lichtmodus naar hoge snelheid index naar é
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit onderzoek onderzoekt de prion-achtige propagatie van eiwitaggregaten met gebruik van de nematode C. elegans als modelsysteem. Het onderzoek richt zich op het monitoren van de verspreiding van eiwitten en het beoordelen van de daarmee gepaard gaande toxiciteit van PreOn-achtige eiwitten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurodegeneratieve ziekten
- Proteïneaggregatie
- Modelorganismen
Achtergrond
- Prion-achtige propagatie is betrokken bij diverse neurodegeneratieve ziekten.
- C. elegans dient als een effectief model voor het bestuderen van proteïnedynamiek.
- Inzicht in de verspreiding van eiwitten kan leiden tot een beter begrip van cellulaire toxiciteit.
- Het monitoren van vesikeltransport is cruciaal voor het evalueren van het gedrag van eiwitten.
Doel van de studie
- Om de verspreiding van PreOn-achtige eiwitten te onderzoeken.
- Om de toxiciteit die geassocieerd is met deze eiwitten te onderzoeken.
- Om modifiers van PreOn-geïnduceerde toxiciteit te identificeren via RNAi-screening.
Gebruikte methoden
- Time-lapse fluorescentiemicroscopie om vesikeltransport te monitoren.
- Weefselspecifieke vouwingssensoren om eiwitvouwing te evalueren.
- Alom expresserende stressreporters om de cellulaire fitheid te beoordelen.
- Genoombrede RNAi-screening om nieuwe toxiciteitsmodificatoren te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van intra- en intercellulair transport van eiwitten.
- Identificatie van cel-autonome en niet-cel-autonome effecten op de fitness.
- Er zijn nieuwe modifiers van PreOn-geïnduceerde toxiciteit ontdekt.
- De Thrasher-readout in vloeibare cultuur gaf inzicht in de toxiciteitsniveaus.
Conclusies
- De studie vergroot het inzicht in eiwitaggregatie bij neurodegeneratie.
- C. elegans is een waardevol model voor het bestuderen van prion-achtige fenomenen.
- De bevindingen kunnen leiden tot nieuwe therapeutische doelwitten voor neurodegeneratieve ziekten.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze studie vestigt een metazoaal model in C. elegans om de verspreiding van prion-achtige eiwitten en de daarmee gepaard gaande toxiciteit te onderzoeken, waarmee een kritieke opening in het onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten wordt opgevuld. Door directe monitoring van fluorescentie-gemerkte priondomeinen in levende dieren mogelijk te maken en genetische screens te faciliteren, ondersteunt deze benadering de validatie van targets en het mechanistisch verminderen van risico's voor therapeutische ontwikkeling. Het model biedt een ziekte-relevant systeem voor het evalueren van intercellulaire transmissie en de verstoring van proteostase, wat bijdraagt aan vroege ontdekkingsbeslissingen voor eiwitaggregatiestoornissen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar therapeutische hypothesen met betrekking tot prion-achtige verspreiding van eiwitten en mechanismen van cellulaire toxiciteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van intra- en intercellulair transport van eiwitaggregaten in een levend systeem.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de identificatie van genetische modifiers die de toxiciteit beïnvloeden, wat bijdraagt aan de betrouwbaarheid van targets en portfolio-triage voor neurodegeneratieve indicaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gevalideerd biologisch systeem voor het voorbereiden van gestandaardiseerde assays om vesikeltransport en stressresponsen te monitoren.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput RNAi-screening in vloeibare cultuur mogelijk, met 'thrashing' als kwantitatieve, reproduceerbare readout voor toxiciteit.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor screening van grote genetische bibliotheken, met een aangetoonde capaciteit om volledige RNAi-bibliotheken binnen zes weken te screenen met behulp van geautomatiseerde workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Toont de relevantie voor ziektebeelden aan door de expressie van prion-achtige eiwitten te koppelen aan oxidatieve stressresponsen en verstoring van de proteostase in verschillende weefsels.
- Translationele continuïteit: Verbindt bevindingen uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via meetbare fenotypes, zoals motiliteitsdefecten en aggregatiekinetiek.
- Risicogestuurde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door modifiers te kwantificeren die toxiciteit onderdrukken, waardoor het voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets wordt verbeterd.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot leadidentificatie, ter ondersteuning van hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden in programma's voor neurodegeneratieve ziekten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over de intercellulaire beweging van prion-achtige eiwitten en hun niet-celautonome effecten op de cellulaire fitness.
- Screening: Maakt assays gereed via time-lapse fluorescentiemicroscopie en kwantificering van de motiliteit op basis van een worm-tracker, wat reproduceerbare kwantitatieve resultaten garandeert.
- Analytiek: Genereert meetbare read-outs, waaronder vesikeltransportdynamiek, thrashing-gedrag en activatie van stress-reporters voor vergelijkende conditionele analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door geobserveerde niet-celautonome effecten op proteostase en oxidatieve stress, relevant voor ziekte-modellering.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor genetische en farmacologische screening, waarbij variabiliteit wordt verminderd door geautomatiseerde vloeistofhandtering en gestandaardiseerde imaging-protocollen.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanismen van prion-achtige verspreiding en de daarmee samenhangende toxiciteit te verduidelijken.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gesynchroniseerde wormpreparatie, gecontroleerde omgevingscondities en geautomatiseerde motiliteitsmeting.
- Strategische waarde: Verhoogt de kapitaalefficiëntie door snelle screening van genetische modifiers mogelijk te maken en biologische risico's in een laat stadium te verminderen door vroege mechanistische inzichten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets door suppressors van toxiciteit te identificeren die motiliteitstypen herstellen, wat bijdraagt aan beslissingen over verdere ontwikkeling.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van C. elegans, fluorescentiemicroscopie en RNAi-screeningsmethodieken.
- Afhankelijk van confocale microscopie met passende objectieven (63x of 100x, 1.4 NA olie) en beeldverwerkingssoftware (METAMORPH, Worm Tracker-plugin).
- Vereist standaardisatie tussen teams voor gesynchroniseerde wormpreparatie, condities voor vloeistofculturen en de uitvoering van motiliteitsassays.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het extrapoleren van bevindingen van C. elegans naar zoogdiersystemen, met name met betrekking tot de conservering van prion-achtige mechanismen.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak voor handmatige verificatie van de output van de worm tracker om foutieve tracks door achtergrondartifacten te elimineren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Monitoring Transcellular Spreading of Prion-like Proteins by In Vivo Time-lapse Imaging
3:31
Genome-wide Screen for Suppression of Prion-induced Toxicity in C. elegans
6:22
Confirmation of Preliminary Screen Hits
9:57
Results: Analyzing the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins
12:29
Conclusion
