Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes

Het algemene doel van het volgende experiment is om SD F1 Alpha Chias en dextransulfaat nanodeeltjes te bereiden en te karakteriseren. De bereiding van de nanodeeltjes wordt bereikt door eerst de stamcelhomingfactor stromaal cel-afgeleid factor één alfa of S df één alfa met dextransulfaat te mengen om binding aan het negatief geladen glycaan mogelijk te maken. Als tweede stap wordt ozan, een positief geladen glycaan, aan het mengsel toegevoegd en vormt een poly-elektrolytcomplex met dextransulfaat.

Vervolgens wordt zinksulfaat toegevoegd om de complexen te stabiliseren met zinkbruggen. Het resulterende deeltje heeft een dichte kern omringd door een negatief geladen schaal. De deeltjes worden vervolgens gemeten op hun grootte en zetapotentiaal, evenals het gehalte en de activiteit van S df één alfa in de nanodeeltjes. Het belangrijkste voordeel van de SDF één alfa glycaan nanodeeltjes is dat het opgenomen SDF één alfa volledig actief is zonder dat het vrijkomt van de deeltjes.

Daarom kunnen de deeltjes nuttig zijn om als stationair hermine signaal te dienen in stamceltherapie. Om te beginnen bereid stockoplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol en steriliseer ze door middel van 0,22 micron filtermembranen. Beoordeel de endotoxineniveaus in de bereide oplossing met ulu amoebacyte lysate gel klonteringstest.

Zorg ervoor dat de niveaus minder dan 0,06 endotoxine-eenheden per milliliter zijn. Voeg vervolgens 0,18 milliliters ultrapuur water toe aan een glasvial van 1,5 milliliter met een magnetische roerder. Stel de roersnelheid in op 800 RPM, voeg dan 0,1 milliliter 1%dextransulfaat toe en roer na twee minuten.

Voeg 0,08 milligram SD F1 alfa toe en roer gedurende 20 minuten. Voeg druppelsgewijs 0,33 milliliter 0,1%tizen toe en roer gedurende vijf minuten. Verander de roersnelheid naar de maximum en voeg langzaam 0,1 milliliter zinksulfaat toe met een gasdichte spuit.

Breng de roersnelheid terug naar 800 RPM en roer gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 0,4 milliliter 15%mannitol toe en roer na vijf minuten. Breng het reactiemengsel over in een 1,5 milliliter fugebuis en centrifugeer bij 16.000 Gs en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Na de centrifugatie zuigt u de supernatant af en gebruikt u een pipet om de laatste druppel vloeistof te verwijderen. Voeg langzaam 0,2 milliliter 5%mannitol toe en suspendeer het pellet met een 0,5 milliliter 29 gauge naaldspuit. Voeg vervolgens nog eens een milliliter 5%manitol toe voordat u centrifugeert.

Voor de tweede keer bij 16.000 GS gedurende 15 minuten. Na het herhalen van het Resus suspensie centrifugatieproces zuigt u de supernatant af en suspendeert u het pellet in 0,2 milliliter 5%mannitol. De deeltjesgrootte en zetapotentiaal worden geanalyseerd door dynamisch lichtverstrooiing en respectievelijk elektroforetisch lichtverstrooiing.

Om te beginnen, selecteert u een werkwijze uit de SOP-lijst, die parameters bevat voor deeltjesgroottemeting door dynamisch lichtverstrooiing. Zoals vermeld in het tekstprotocol, verdunt u het SD F1 alfa deeltjesmonster met water. Laad vervolgens 100 microliters van het monster op een wegwerp UV Q Vet, zoals een Einor Q Vet.

Plaats de Q vet in de cellhouder en wacht tot de intensiteitsaanpassing optimaal is voordat u met de gegevensverzameling begint. Nadat de meting voltooid is, noteert u de cumulatieve resultaten van diameter en polydispersiteitsindex. Bereken het gemiddelde van de resultaten verkregen uit elk van de vier herhaalde metingen en bereken de standaardafwijking voor de meting van zetapotentiaal door elektroforetisch lichtverstrooiing.

Laad 500 microliters van het tienvoudig verdunde deeltjesmonster op de flowcel. Selecteer een werkwijze uit de Zeta potentiaal SOP-lijst, die parameters bevat voor de meting zoals vermeld in het tekstprotocol. Noteer de resultaten van het zetapotentiaal.

Bereken vervolgens het gemiddelde van de resultaten verkregen uit elk van de vijf herhaalde metingen en bereken de standaardafwijking. Verwarm de verdunde monsters van vrije en deeltjesgebonden SD F1 alfa in laly monsterbuffer bij 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Vorm de monsters twee keer tijdens de 10 minuten verwarming om de deeltjes volledig te dissociëren. Nadat de monsters zijn afgekoeld tot kamertemperatuur gedurende twee minuten, centrifugeer ze bij 10.000 Gs gedurende 0,5 tot één minuut om het watercondensaat terug te brengen. Vorm opnieuw een vortex om goed te mengen.

Op dit punt zou de monstersoplossing helder moeten zijn zonder zichtbare neerslag. Laad vervolgens 10 microliters monster per putje op een vier tot 20%natrium ESAL sulfaat of SDS-gel. Voer elektroforese uit bij 200 volt gedurende 20 minuten voordat u de gel kleurt met kumasi blauw eiwitkleurstof.

Onderzoek de eiwitbanddichtheid van SD F1 alfa met behulp van een moleculaire beeldvormer en densitometrieanalysesoftware. Bereken de hoeveelheid S DF één alfa in de deeltjes ten opzichte van een standaardcurve die is geconstrueerd met vrije SDF één alfa standaarden om de in vitro release test uit te voeren. Meng SD F1 alfa glycaan deeltjes met docos fosfaatbufferoplossing zonder calcium en magnesium of DPBS in een één-op-één verhouding. Verdeel de deeltjessuspensie in 0,05 milliliter aliquoten in 1,5 milliliter buisjes.

Laad de monsters op de bodem van de buisjes. Vermijd het inbrengen van luchtbelletjes of het verstoren van het oppervlak van de vloeistof. Sluit de bovenkant van de buisjes af met paraform.

Roteer vervolgens de buisjes bij 37 graden Celsius op een roterende microbuisjesmixer. Verwijder aliquoten uit de buisjes op de aangegeven tijdstippen en centrifugeer de monsters onmiddellijk bij 16.000 Gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius na centrifugatie. Scheid de supernatanten en pelletjes.

Reconstitueer vervolgens het pelletje met