Name: Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Leer de bereiding en karakterisatie van SDF-1α-chitosan-dextransulfaat nanodeeltjes voor biomateriaalonderzoek. Deze methode meet grootte, zeta-potentiaal en biologische activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies: HL671795, HL048743 en HL108630.

1. Bereiding van SDF-1α Glycan Nanodeeltjes Door de toepassing van in vivo afgifte, steriliseren alle containers, pipetten en tips gebruikt bij de bereiding. <ol><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen in ultrapuur water: 1% dextraansulfaat; 1 M NaOH (steriel gefiltreerd met een PES membraan); 0,1% chitosan in 0,2% ijsazijn (filter door 0,8 en 0,22 urn filters achtereenvolgens en pH op 5,5 met NaOH daarna); 0,1 M ZnSO 4; 15% mannitol; en 0,92 mg / ml SDF-1α (in porties bewaard bij 80 ° C en bij 4 ° C bewaard Ontdooide). </li><li> Steriliseren voorraad oplossingen door 0,22 pm filter membranen. Beoordelen endotoxine niveaus in de bereide oplossing met limulus amoebocyt lysaat (LAL) gel stollingstest. Zorg ervoor dat de niveaus zijn &lt;0,06 EU / ml. </li><li> Voeg 0,18 ml ultrapuur water om een ​​1,5 ml glazen flacon met een magnetische roerstaaf. Stel het roer snelheid van 800 rpm. Voeg 0,1 ml 1%dextransulfaat en roer gedurende 2 min. Voeg 0,08 mg SDF-1α (0.087 ml 0,92 mg / ml SDF-1α oplossing) en roer gedurende 20 min. </li><li> Voeg 0,33 ml 0,1% chitosan druppelsgewijs toe en roer gedurende 5 min. Verandering roer snelheid naar de maximale en voeg langzaam 0,1 ml 0,1 M ZnSO 4 met een 0,1 ml injectiespuit (meer dan 1 min). </li><li> Terug roer snelheid tot 800 rpm en roer gedurende 30 min. Voeg 0,4 ml 15% mannitol en roer gedurende 5 min. Breng het reactiemengsel tot een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Opmerking: De aanwezigheid van mannitol vergemakkelijkt de resuspensie van de deeltjes na centrifugeren. Afhankelijk van de dichtheid van de korrel kan mannitolconcentratie variëren van 0% tot 5%. Volledige resuspensie van de deeltjes na elke centrifugering cruciaal aggregaten in de uiteindelijke suspensie voorkomen. </li><li> Zuig supernatant en gebruik een pipet om de laatste druppel vloeistof langzaam te verwijderen. Voeg 0,2 ml 5% mannitol. Hang de pellet met een 0,5 ml, 29 G needle spuit. Voeg 1 ml 5% mannitol. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 15 min. </li><li> Herhaal stap 1.6. </li><li> Zuig de supernatant. Resuspendeer de pellet in 0,2 ml 5% mannitol. Bewaar de deeltjessuspensie bij 4 ° C. Opmerking: De deeltjessuspensie kan ook opgeslagen worden ingevroren bij -80 ° C of gevriesdroogd. Inclusief 5% mannitol in de suspensie is essentieel om aggregatie van de deeltjes na invriezen en ontdooien of na vriesdrogen en rehydratatie te voorkomen. Mannitol kan worden verwijderd door centrifugeren van de suspensie na de opslag. </li></ol> 2. Meting van de deeltjesgrootte en Zeta-Potentiaal De deeltjesgrootte en zeta potentieel worden geanalyseerd door middel van dynamische lichtverstrooiing en elektroforetische lichtverstrooiing, respectievelijk, met een deeltjesanalysator aangegeven Material List. <ol><li> Stel de volgende parameters voor de deeltjesgrootte meting: Accumulatie tijden: 70; Herhaal keer: 4; Temperatuur: 25 ° C;Oplosmiddel: water; Intensiteit aanpassing: auto. </li><li> Verdun het SDF-1α-DS-CS monster met water (10-voudige verdunning). Plaats 100 pl van het monster aan een wegwerpbare UV kuvet zoals een Eppendorf cuvet. Plaats de cuvet in de cel houder. Wacht tot de intensiteit aanpassing aan &quot;Optimum&quot; (~ 10.000 cps) bereikt. Start data-acquisitie. </li><li> Nadat de meting is voltooid, registreren de cumulanten resultaten van diameter (nm) en polydispersiteit index. Gemiddeld verkregen uit elk van de 4 herhaalde metingen resultaten en bepaal de standaardafwijking. </li><li> Lading 500 pl van de 10-voudig verdunde deeltjesmonster een stroomcel voor zetapotentiaal meting. Stel de volgende parameters voor het meten: Accumulatie tijden: 10; Herhaal tijden: 5; Temperatuur: 25 ° C; Oplosmiddel: water; Intensiteit aanpassing: auto. Noteer de resultaten van de zeta-potentiaal (mV). Het gemiddelde van de resultaten van elk van de 5 herhaalde metingen resultaat, en bereken de standaard deviation. </li></ol> 3. Kwantificering van SDF-1α in de Deeltjes <ol><li> Verdun vrije vorm SDF-1α concentraties van 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, en 0,05 mg / ml in 1,3 x Laemmli monsterbuffer. Verdun 6 pl SDF-1α-DS-CS monsters met 40 gl 1,3 x Laemmli monsterbuffer. (Bereid 4x Laemmli stock buffer die 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glycerol, 0,05 mg / ml broomfenolblauw, en 8% 2-mercaptoethanol. Verdeel de stockoplossing in kleine porties en bewaar bij -20 ° C voor eenmalig gebruik.) </li><li> Verwarm de monsters bij 100 ° C gedurende 10 min. Vortex de monsters tweemaal (elk gedurende 10 seconden bij maximale snelheid) gedurende 10 min opwarmtijd om de deeltjes volledig dissociëren. Koel de monsters tot kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 0,5-1 min het water condensaat naar beneden te brengen. Weer vortex goed te mengen. Opmerking: Op dit punt moet de monsteroplossing helder zonder zichtbare neerslag aanwezig. </li><li> Load 10 &amp;# 181; l monster / goed op een 4-20% SDS-gel. Run elektroforese bij 200 V gedurende 20 minuten. Vlekken op de gel met Coomassieblauw eiwit vlek. </li><li> Onderzoeken het eiwit band dichtheid van SDF-1α met behulp van een moleculaire imager en densitometry analyse software. Bereken de hoeveelheid SDF-1α in de deeltjes tegen een standaardkromme geconstrueerd met gratis SDF-1α standaarden. </li></ol> 4. In vitro afgifte assay <ol><li> Mix SDF-1α glycan deeltjes met Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (D-PBS) bij een 1: 1 verhouding (v / v). </li><li> Verdeel de deeltjessuspensie in 0,05 ml porties in 1,5 ml buizen. Plaats de monsters naar de bodem van de buizen. Voorkomen dat er luchtbellen of het oppervlak van de vloeistof te storen. Dicht de top van de buizen met Parafilm. OPMERKING: Daarbij zal de vloeistof onderin blijven tijdens de daaropvolgende boven naar beneden draaien op de buis mixer. </li><li> Draai de buizen op 37 &amp;# 176; C op een roterende Micro-Tube Mixer. Verwijder aliquots uit de buizen bij de aangegeven tijden en onmiddellijk gecentrifugeerd de monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Scheid de supernatanten en pellets, en los het pellet met 0,05 ml D-PBS. Bewaar de monsters bij -20 ° C. Nadat alle monsters verzameld, onderzoekt de supernatanten en pellets op een SDS-gel zoals hierboven beschreven. </li></ol> 5. Migratie Assay Deze test meet de chemotactische activiteit van SDF-1α. Interactie van SDF-1α met zijn receptor (CXCR4) op het celoppervlak veroorzaakt migratie van de cel naar de SDF-1α gradiënt. In deze assay worden de cellen geplaatst in een bovenste put (gescheiden door een semipermeabel membraan van een lagere well) en SDF-1α oplossing in een lagere put. <ol><li> Verdun SDF-1α (vrij of deeltjes gebonden vorm) migratie buffer (RPMI-1640 medium dat 0,5% bovine serum albumine) in een 3-fold seriële verdunning tot eindconcentraties van 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 en 0,05 ng / ml. </li><li> Voeg 0,6 ml van de verdunde SDF-1α oplossing of migratie buffer alleen (negatieve controle) aan een putje in de 24-well plaat. Voeg 0,57 ml migratie buffer tot een goed (input cel controle). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. Plaats een permeabele celkweek insert zoals Transwell (poriegrootte 5 urn, 6,5 mm) bovenop de onderste put. Load 0,1 ml Jurkat-cellen (5 x 10 5) in de Transwell voegen. Laad 0,03 ml cellen rechtstreeks aan de ingang celcontrole goed. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur in een 5% CO2 incubator. </li><li> Verwijder de Transwell inzetstukken. Breng de cellen die zijn gemigreerd naar de onderste putjes van een 4 ml polystyreen buis. Tel de gemigreerde cellen met een flowcytometer. </li><li> Bereken migratie als percentage van het aantal invoercel (celaantal in de invoercel controleputje x 100/30) na aftrekken van de getallen in negative controles (cellen gemigreerd naar de putjes die alleen migratie buffer). </li></ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).</li>
<li>Yue, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+affects+cellular+uptake+and+intracellular+trafficking+of+chitosan-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).</li>
<li>Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+as+a+therapeutic+stem+cell+homing+factor+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction.</a> Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).</li>
<li>Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-derived+factor-1%2FCXCR4+signaling%3A+indispensable+role+in+homing+and+engraftment+of+hematopoietic+stem+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).</li>
<li>Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha-heparin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex.</a> J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).</li>
<li>Amara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1alpha+associates+with+heparan+sulfates+through+the+first+beta-strand+of+the+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).</li>
<li>Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate%2Fheparin+oligosaccharides+protect+stromal+cell-derived+factor-1+%28SDF-1%29%2FCXCL12+against+proteolysis+induced+by+CD26%2Fdipeptidyl+peptidase+IV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV.</a> J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).</li>
<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
<li>McCall, R. L., Sirianni, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA+nanoparticles+formed+by+single-+or+double-emulsion+with+vitamin+E-TPGS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS.</a> J Vis Exp. (82), 51015(2013).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Zoals hierboven vermeld, worden de DS-CS nanodeeltjes gevormd door ladingsneutralisatie tussen polyanion (DS) en polykation (CS) moleculen. Omdat de lading interactie optreedt gemakkelijk tijdens de moleculaire botsing, de concentratie van de polymeeroplossingen en de roersnelheid tijdens mengen kritisch voor de grootte van de resulterende deeltjes. Een algemene trend is dat meer verdund DS en CS oplossingen 15 en hogere roersnelheid resultaat in kleinere deeltjes. De formulering ...

Dextran sulfaat (DS) en chitosan (CS) zijn polysachariden met meerdere gesubstitueerde negatief geladen sulfaatgroepen (DS) of positief geladen aminogroepen (gedeacetyleerd CS). Wanneer gemengd in een waterige oplossing de twee polysacchariden vormen polyelectrolytcomplexen elektrostatische interacties. De resulterende complexen kunnen grote aggregaten die worden fase gescheiden van de waterige oplossing (neerslag) of kleine deeltjes die in water dispergeerbaar (colloïden) vormen. De specifieke voorwaarden die bijdragen aan deze uitkomsten zijn uitgebreid bestudeerd, en zijn samengevat en geïllustreerd in detail in een recente beoordeling 1. Onder deze omstandigheden zijn de tegengesteld geladen polymeren moeten 1) significant verschillend molecuulgewicht twee basisvereisten voor het produceren water dispergeerbare deeltjes; en 2) worden gemengd in een niet-stoichiometrische verhouding. Deze voorwaarden zullen de kosten-neutrale gecomplexeerd polymere segmenten gegenereerd door lading toestaanneutralisatie te scheiden en vormen de kern van het deeltje, en de overmaat polymeer aan de buitenmantel 1 vormen. De glycan deeltjes beschreven in dit protocol zijn bedoeld voor pulmonale levering, en zijn ontworpen netto te zijn negatief geladen, en van nanometer afmetingen. De negatieve oppervlakte lading vermindert de kans op cellulaire opname van de deeltjes 2,3. Deeltjes van nanometer dimensie van de doorgang door het distale luchtwegen. Om dit doel te bereiken, de hoeveelheid DS in dit preparaat dan CS (gewichtsverhouding 3: 1); en hoog molecuulgewicht DS (gewichtsgemiddelde MW 500.000) en lage molecuulgewicht CS (MW 50-190 kDa, 75-85% gedeacetyleerd) gebruikt. SDF-1α is een stamcel homing factor, die de homing-functie via haar chemotactische activiteit uitoefent. SDF-1α speelt een belangrijke rol bij homing en onderhoud van hematopoietische stamcellen in het beenmerg, en rekrutering van progeNitor cellen naar de perifere weefsels voor letsel reparatie 4,5. SDF-1α een heparine-bindingsplaats in de eiwitsequentie, waardoor het eiwit bindt aan heparine / heparansulfaat, vorm dimeren, worden beschermd tegen protease (CD26 / DPPIV) inactivering en interactie met doelcellen via celoppervlak receptoren 6-8. DS soortgelijke structuureigenschappen als heparine / heparansulfaat; dus de binding van SDF-1α DS zou vergelijkbaar met die van de natuurlijke polymere liganden. In de onderstaande voorschriften beschrijven we de bereiding van SDF-1α-DS-CS nanodeeltjes. De procedures vormen één van de formuleringen die eerder zijn onderzocht 9. Het protocol is oorspronkelijk aangepast van een onderzoek van VEGF-DS-CS nanodeeltjes 10. Een kleinschalige bereiding wordt beschreven, die gemakkelijk kan worden opgeschaald met dezelfde voorraad oplossingen en voorbereiding voorwaarden. Na bereiding worden de deeltjes gekarakteriseerd by behandeling van hun grootte, zeta potentieel, omvang van SDF-1α oprichting, in vitro release tijd, en de activiteit van de opgenomen SDF-1α.

<table><tbody><tr><td>Dextransulfaat</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan, laag moleculair gewicht&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfaat heptahydraat</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure water&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha;</td><td>Bereid volgens referentie 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter, PES membraan 0.22&nbsp;&#956;m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische microroerstaven (2&nbsp;x&nbsp;7&nbsp;mm)</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Glazen vial Kit; SUN-SRi</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano C Deeltjesanalysator&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue Safe Proteïne Stain</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Imager VersaDoc MP 4000 Systeem</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Permeabele Steunen</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaat gebufferde zoutoplossing&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus kit</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding en karakterisering van sdf-1α-chitosan-dextransulfaat nanodeeltjes

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) en dextransulfaat (DS) zijn geladen polysachariden (glycanen), die polyelektrolytcomplex-gebaseerde nanodeeltjes vormen wanneer ze onder geschikte omstandigheden worden gemengd. De glycanen nanodeeltjes zijn nuttige dragers voor eiwitfactoren, die de in vivo levering van de eiwitten vergemakkelijken en hun retentie in het beoogde weefsel ondersteunen. De glycanen polyelektrolytcomplexen zijn ook ideaal voor eiwitlevering, omdat de incorporatie wordt uitgevoerd in waterige oplossing, wat de kans op inactivering van de eiwitten vermindert. Eiwitten met een heparine-bindende plaats hechten zich gemakkelijk aan dextransulfaat en worden op hun beurt door de binding gestabiliseerd. Deze deeltjes zijn ook minder ontstekingsverwekkend en toxisch wanneer ze in vivo worden toegediend. In het hieronder beschreven protocol wordt SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), een stamcel-homing factor, eerst gemengd en geïncubeerd met dextransulfaat. Chitosan wordt toegevoegd aan het mengsel om polyelektrolytcomplexen te vormen, gevolgd door zinksulfaat om de complexen met zinkbruggen te stabiliseren. De resulterende SDF-1α-DS-CS-deeltjes worden gemeten op grootte (diameter) en oppervlaktelading (zetapotentiaal). De hoeveelheid van het geïncorporeerde SDF-1α wordt bepaald, gevolgd door metingen van zijn in vitro afgiftesnelheid en zijn chemotactische activiteit in een deeltjesgebonden vorm.

De grootte en zetapotentiaal van de bereide SDF-1α-DS-CS deeltjes worden bepaald met een deeltjesanalysator. Figuur 1 toont de analyse van de maat opmeten. Uit de cumulanten resultaten verkregen uit vier herhaalde metingen, het gemiddelde hydrodynamische diameter van het SDF-1α-DS-CS deeltjes 661 ± 8.2 (nm) en de polydispersiteit is 0,23 ± 0,02. Het resultaat van de zeta potentieel meting wordt getoond in figuur 2. Van de vijf herhaalde metingen, het zeta potentieel van de SDF-1α-DS-CS ...

Het doel van dit protocol is om SDF-1α, een stamcel-home-factor, te integreren in dextransulfaat-chitosan nanodeeltjes. De resulterende deeltjes worden gemeten op hun grootte en zetapotentiaal, evenals de inhoud, activiteit en in vitro afgiftesnelheid van SDF-1α uit de nanodeeltjes.

Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het prepareren en karakteriseren van SDF-1α-chias en dextraansulfaat-nanodeeltjes. De preparatie van de nanodeeltjes wordt bereikt door eerst de stamcel-homingfactor stromal cell-derived factor one alpha of SDF-1α te mengen met dextraansulfaat om binding aan het negatief geladen glycaan mogelijk te maken. Als tweede stap wordt ozan, een positief geladen glycaan, aan het mengsel toegevoegd, waardoor een polyelektrolytcomplex met dextraansulfaat wordt gevormd.Vervolgens wordt zinksulfaat toegevoegd om de complexen met zinkbruggen te stabiliseren. Het resulterende deeltje heeft een dichte kern omringd door een negatief geladen schil. De deeltjes worden vervolgens gemeten op grootte en zetapotentiaal, evenals op het gehalte en de activiteit van SDF-1α in de nanodeeltjes. Het belangrijkste voordeel van de SDF-1α glycan-nanodeeltjes is dat het ingesloten SDF-1α volledig actief is zonder uit de deeltjes te worden vrijgegeven.Daarom zouden de deeltjes nuttig kunnen zijn als stationair hermine-signaal bij stamceltherapie. Begin met het bereiden van stamoplossingen zoals beschreven in het tekstprotocol en steriliseer deze via 0,22 micron filtermembranen. Beoordeel de endotoxinegehaltes in de bereide oplossing met een ulu amoeba cyte lysate gel clot assay.Zorg ervoor dat de waarden lager zijn dan 0,06 endotoxine-eenheden per milliliter. Voeg vervolgens 0,18 milliliter ultrapuur water toe aan een glazen vial van 1,5 milliliter met een magnetische roerstaaf. Stel de roersnelheid in op 800 RPM, voeg daarna 0,1 milliliter 1% dextraansulfaat toe en roer gedurende twee minuten.Voeg 0,08 mg SD F1 alfa toe en roer gedurende 20 minuten. Voeg druppelwijs 0,33 mL 0,1%tizen toe en roer gedurende vijf minuten. Zet de roersnelheid op maximaal en voeg langzaam 0,1 mL zinksulfaat toe met een gastichte spuit.Zet de roersnelheid terug naar 800 RPM en roer gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 0,4 milliliters 15% mannitol toe en roer na vijf minuten. Breng het reactiemengsel over naar een 1,5 milliliter centrifugebuis en centrifugeer bij 16 000 Gs en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Aspirer na centrifugatie het supernatant en gebruik een pipet om de laatste druppel vloeistof te verwijderen. Voeg langzaam 0,2 milliliters 5% mannitol toe en resuspendeer de pellet met een spuit voorzien van een 0,5 milliliter 29 gauge naald. Voeg vervolgens nog een milliliter 5% mannitol toe alvoren opnieuw te centrifugeren.Een tweede keer bij 16 000 GS gedurende 15 minuten. Na herhaling van het centrifugatieproces van de Resus-suspensie wordt het supernatant weggezogen en wordt het bezinksel resuspendeerd in 0,2 milliliters van 5% mannitol. De deeltjesgrootte en het zetapotentieel worden respectievelijk geanalyseerd via dynamische lichtverstrooiing en elektroforetische lichtverstrooiing.Select eerst een werkprocedure uit de SOP-lijst, waarin de parameters voor de meting van de deeltjesgrootte via dynamische lichtverstrooiing staan. Verdun, zoals beschreven in het tekstprotocol, het SD F1 alpha-deeltjesmonster met water. Laad vervolgens 100 µL van het monster in een wegwerp-UV Q Vet, zoals een Einor Q Vet.Plaats de Q vet in de celhouder en wacht tot de intensiteitsaanpassing optimaal is voordat u begint met de gegevensverwerving. Noteer na voltooiing van de meting de cumulatieve resultaten van de diameter en de polydispersiteitsindex. Bereken het gemiddelde van de resultaten verkregen uit elk van de vier herhaalde metingen en bepaal de standaarddeviatie voor de meting van het zetapotentieel via elektroforetische lichtverstrooiing.Laad 500 µL van het tienvoudig verdunde partikelmonster in de flowcel. Selecteer een operationele procedure uit de lijst met SOP's voor zétapotentiaal, die de parameters voor de meting bevat zoals vermeld in het tekstprotocol. Noteer de resultaten van de zétapotentiaal.Bereken vervolgens het gemiddelde van de resultaten van de vijf herhaalde metingen en bepaal de standaarddeviatie. Verhit de verdunde monsters van vrij en partikelgebonden SD F1 alpha in laly-monsterbuffer bij 100 °C gedurende 10 minuten. Vortex de monsters twee keer tijdens het verhitten van 10 minuten om de partikels volledig te dissociëren. Laat de monsters twee minuten afkoelen tot kamertemperatuur en centrifugeer vervolgens bij 10.000 G gedurende 0,5 tot 1 minuut om het watercondensaat naar beneden te brengen. Vortex opnieuw om goed te mengen.Op dit punt moet de monsteroplossing helder zijn, zonder zichtbaar precipitaat. Laad vervolgens 10 µL monster per put op een 4 tot 20% natriumdodecylsulfaat (SDS) gel. Voer de elektroforese uit bij 200 V gedurende 20 minuten voordat de gel wordt gekleurd met Coomassie-blauw eiwitkleuring.Onderzoek de bandendichtheid van het eiwit SDF-1α met behulp van een moleculaire imager en software voor densitometrische analyse. Bereken de hoeveelheid SDF-1α in de partikels aan de hand van een standaardcurve die is opgesteld met vrije SDF-1α-standaarden om de in vitro release-assay uit te voeren. Meng SDF-1α-glycaanpartikels met docosfosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (DPBS) in een verhouding van 1:1. Verdeel de partikelsuspensie in aliquots van 0,05 ml in 1,5 ml buisjes.Breng de monsters aan op de bodem van de buisjes. Vermijd het introduceren van luchtbellen of het verstoren van het vloeistofoppervlak. Sluit de bovenkant van de buisjes af met parafilm.Roteer de buisjes vervolgens bij 37 °C op een roterende microbuisjesmixer. Neem op de aangegeven tijdstippen aliquoten uit de buisjes en centrifugeer de monsters onmiddellijk 10 minuten bij 16.000 Gs bij vier °C. Scheid na centrifugatie de supernatanten en de pellets.Resuspendeer vervolgens het pellet in 0,05 milliliters DPBS. Nadat alle monsters zijn verzameld, worden de supernatanten en pellets geanalyseerd op een SDS-gel. Zoals eerder vermeld, meet deze assay de chemotactische activiteit van S df.Eén interactie van SDF-1α met zijn receptor veroorzaakt migratie van de cel naar de SDF-1α-gradiënt. Verdun ter beginne de vrije of aan deeltjes gebonden vorm van SDF-1α met migratiebuffer in een drievoudige seriële verdunning tot de eindconcentraties die in het tekstprotocol worden vermeld. Voeg 0,6 milliliter van de verdunde SDF-1α-oplossing toe aan een putje in de 24-wells plaat voor de negatieve controle.Doe hetzelfde voor alleen de migratiebuffer en voeg vervolgens 0,57 milliliter migratiebuffer toe aan een putje voor de input-celcontrole. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Plaats daarna een permeabel celkweekinzetstuk, zoals een transwell, bovenop het onderste putje en breng 0,1 milliliter jerk hat-cellen aan in het transwell-inzetstuk.Laad vervolgens 0,03 milliliter cellen direct in de input cell control well. Incubeer de plaat gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in een incubator met 5% koolstofdioxide. Verwijder na incubatie de cellendifferentiatie-inserts.Breng de cellen die naar de onderste putjes zijn gemigreerd over naar een polystyreenbuis van vier milliliter. Tel de gemigreerde cellen met een flowcytometer. Bereken tot slot de migratie als een percentage van het aantal inputcellen na aftrek van de aantallen in de negatieve controles.Hier wordt de analyse van de deeltjesgroottemeting van SD F1 alpha dextran sulfaat ozan getoond. Het CUMUL-resultaat laat zien dat de hydrodynamische diameter van het deeltje 671 nanometers is en de polydispersiteit 0,24 bedraagt. Dit screenshot toont een van de vijf herhaalde metingen van het zetapotentieel van de SD F1 alpha DExT strand sulfaat ozan deeltjes.Het zetapotentieel is minus 24,7 millivolt. De hoeveelheid S df one alpha in de S df one alpha dextransulfaat ozan-partikels wordt geschat via SDS-gelelektroforese. Hier wordt een met kumasi gekleurde SDS-gel getoond waarin SD F1 alpha-standaarden, een dextransulfaat kaizan-controle-nanopartikel en SD F1 alpha dextransulfaat kaizan-nanopartikelmonsters zijn geladen.Een standaardcurve wordt opgesteld op basis van de dichtheidsanalyse van de SDF-1α standaardbanden. De berekening vanuit de standaardcurve geeft aan dat de SDF-1α concentratie in het SDF-1α nanodeeltjesmonster 0,03 mg/mL is. Om de in vitro afgiftesnelheid van SDF-1α uit de nanodeeltjes te bepalen, werd de hoeveelheid vrijgekomen SDF-1α in het supernatant en de hoeveelheid aan deeltjesgebonden SDF-1α in de pellets bepaald door middel van Coomassie-kleuring van een SDS-gel, gevolgd door densitometrische analyse. De activiteit van de deeltjesgebonden SDF-1α wordt gemeten met een migratie-assay en vergeleken met die van vrij SDF-1α, zoals hier getoond.Het partikelgebonden SDF-1α induceerde dezelfde mate van migratie als vrij SDF-1α bij alle gemeten concentraties. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de formulering van de glycaan-eiwitpartikels kan worden aangepast. Afhankelijk van de specifieke toepassing kunnen andere eiwitten worden ingebouwd en kunnen verschillende formuleringen worden gebruikt om de partikelgrootte te variëren.We hopen dat deze video de basistechnieken heeft gedemonstreerd voor de preparatie van het verzamelen van nanodeeltjes en de daaropvolgende functionele analyse van het geïncorporeerde SDF one alpha.

preparation-characterization-sdf-1-chitosan-dextran-sulfate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Een belangrijke hindernis in de huidige stamceltherapie is het bepalen van de meest effectieve methode om deze cellen te leveren aan gastheer weefsels. Hier beschrijven we een chitosan-gebaseerde levering methode die is efficiënt en eenvoudig in aanpak, terwijl vet-afgeleide stamcellen om hun multipotent te behouden.

De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Dit protocol richt zich op gebruik te maken van de inherente vermogen van stamcellen om cue te nemen van hun omringende extracellulaire matrix en worden aangezet om te differentieren naar verschillende fenotypes. Deze methode manuscript strekt de beschrijving en karakterisering van een model met behulp van een dubbellagige hydrogel, bestaande uit PEG-fibrine en collageen, gelijktijdig gelijktijdig onderscheid...

Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Gratis oplossing capillaire elektroforese is een snelle, goedkope en robuuste analytische methode die het kwantitatieve bewaken van chemische reacties in real time mogelijk maakt. Het nut ervan voor snelle, gemakkelijke en nauwkeurige analyse wordt hier aangetoond door middel van analyse van covalente peptide-grafting op chitosanfilms voor verbeterde celadhesie.

Capillaire elektroforese Monitor Peptide Enten op chitosan films in Real Time

Eenvoudige homogenisatie werd gebruikt om nieuwe, hoge dichtheid, lipoproteïne-nabootsende nanodeeltjes te bereiden om de zenuwgroeifactor te inkapselen. Uitdagingen, gedetailleerde protocollen voor nanodeeltjespreparatie, in vitro karakterisering en in vivo studies worden beschreven in dit artikel.

Voorbereiding en karakterisering van nieuwe HDL-nabootsende nanodeeltjes voor ingewikkelde zenuwgroei Factor

Hier beschrijven we een facile voorbereiding van chitosan gebaseerde injecteerbare hydrogels met behulp van dynamische imine chemie. Methoden om aan te passen van de hydrogel mechanische sterkte en de toepassing ervan in de 3D-celkweek worden gepresenteerd.

Voorbereiding van injecteerbare Hydrogels Chitosan gebaseerde en de toepassing ervan in de 3D-celkweek

Hier presenteren we een protocol voor de synthese van placenta chondroitin sulfaat A bindend peptide (plCSA-BP)-geconjugeerd lipide-polymeer nanodeeltjes via -voor-stapmodus ultrasoonapparaat en bioconjugate technieken. Deze deeltjes een roman hulpmiddel vormen voor de gerichte levering van therapeutics aan de meeste menselijke tumoren en placenta trophoblasts voor de behandeling van kanker en placenta aandoeningen.

Synthese en karakterisering van placenta Chondroitin sulfaat een (plCSA) - Targeting lipide - polymeer nanodeeltjes

Dit artikel beschrijft de inkapseling van falcarindiol in lipide-gecoate 74 nm nanodeeltjes. De mobiele opname van de nanodeeltjes door menselijke stamcellen in lipide druppels wordt gecontroleerd door fluorescerende en confocal beeldvorming. Nanodeeltjes worden vervaardigd door de snelle injectie methode van oplosmiddel verschuiven, en hun grootte wordt gemeten met de Dynamische lichtverstrooiing techniek.

Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen

De vriesontdooi methode wordt gebruikt voor de productie van Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels zonder dwars verbindingsmiddelen. Voor deze methode is het belangrijk om de Vries condities (temperatuur, aantal cycli) en polymeer verhouding te overwegen, wat de eigenschappen en toepassingen van de verkregen hydrogels kan beïnvloeden.

Een Bevriezings methode voor het bereiden van Chitosan-poly (vinyl alcohol) hydrogels zonder dwars verbindingsmiddelen en Diflunisale vrijgave studies

Deze studie beschrijft een methode om chitine uit te breiden tot een schuim door chemische technieken die geen gespecialiseerde apparatuur vereisen.

Bereiding van geëxpandeerde chitineschuimen en hun gebruik bij het verwijderen van waterig koper

Het huidige protocol beschrijft een niet-emulsie-gebaseerde methode voor de fabricage van chitosan-genipin microgels. De grootte van deze microgels kan nauwkeurig worden gecontroleerd en ze kunnen pH-afhankelijke zwelling vertonen, in vivo afbreken en worden geladen met therapeutische moleculen die in de loop van de tijd op een duurzame manier vrijkomen, waardoor ze zeer relevant zijn voor tissue engineering-toepassingen.

Fabricage van maatgecontroleerde en emulsievrije Chitosan-Genipin-microgels voor tissue engineering-toepassingen

Leer de bereiding en karakterisatie van SDF-1α-chitosan-dextransulfaat nanodeeltjes voor biomateriaalonderzoek. Deze methode meet grootte, zeta-potentiaal en biologische activiteit.

Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes

Meer video's verkennen