Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy
28 november 2014
Hier presenteren we een protocol dat het gebruik van Kelvin sonde krachtmicroscopie uitlegt als een hulpmiddel voor het genereren van hoge resolutie nano-schaal oppervlaktepotentiaal kaarten. Dit hulpmiddel werd toegepast om de rol van oppervlaktepotentiaal op de bindingscapaciteit van micro-organismen aan substraatoppervlakken te beoordelen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om veranderingen in de lading van de celmembraan te observeren na hechting aan verschillende materiaalsubstraten. Dit wordt bereikt door de micro-organismen in voedingsrijk medium te kweken om hun aantal te verhogen. Vervolgens worden de materiaaloppervlakken waar de micro-organismen zich aan zullen hechten, gereinigd en gefunctionaliseerd voor optimale microbiële hechtingssnelheden.
Vervolgens worden de micro-organismen op de verschillende materiaalsubstraten geplaatst om Kelvin-sonde kracht microscopie of KPFM-beeldvorming mogelijk te maken. De resultaten laten zien dat het type materiaalsubstraat en zijn inherente lading een effect hebben op de celactiviteit, zoals te zien is aan veranderingen in de lading van de celmembraan en celhechting. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals elektroforetisch, lichtverstrooiing en iso-elektrisch puntbepaling is dat KPFM toelaat om de lading van individuele cellen en biofilms te onderzoeken in plaats van hele culturen of kolonies.
Dit is gunstig wanneer u cel-cel en biofilm elektrische kenmerken met hoge nauwkeurigheid en precisie wilt vergelijken. Om te beginnen, bereid 5% schapenbloed agar platen voor, streken de MRSA-bacteriën op de voorbereide platen en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius om enkele goed geïsoleerde kolonies te genereren. Maak 500 milliliter triptych soja bouillon, aangevuld met 1% glucose en 0,1% natriumchloride, autoclaveer, samen met twee schone glazen testbuizen en een doos van één milliliter pipetten.
Laat het medium en de testbuizen afkoelen onder een bioveiligheidskast of in de buurt van een buns en brander, pipet zes milliliter van de TSB in elke testbuis. Gebruik een van de eerder bereide schapenbloed agar platen om een enkele kolonie van MRSA in een van de buizen te inoculeren. Gebruik de tweede buis als negatieve controle om steriliteit te waarborgen en incubeer de buizen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 200 RPM in een reciproque incubator.
De MRSA-buis zou groei moeten vertonen of er zou niets in de controle-testbuis moeten zijn gegroeid. Maak vervolgens een subcultuur door één milliliter van de 24-uurs cultuur te gebruiken om zes milliliter verse tryptische soja bouillon te inoculeren en in te kweken bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende nog eens zes uur. Pipet vervolgens één milliliter van de cultuur in een fusbuis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 850 keer G.
Verwijder het supinate en gebruik gedeïoniseerd water om de pellet twee keer met pincetten in de dominante hand te wassen. Houd een 20 millimeter roestvrijstalen FM-monsterschijf vast en gebruik vijf milliliter gedeïoniseerd water om elke kant schoon te maken. Plaats de schone schijven in een beker met gedeïoniseerd water en soniqueer gedurende één minuut na sonificatie.
Gebruik de pincetten om de monsterschijven uit de beker te verwijderen en leun ze op een papieren handdoek op een hoek van ongeveer 60 graden tegen de rand van een open Petri-schaal. Om volledig te drogen, gebruik het deksel van de schaal om de droogschijfjes te bedekken. Zodra ze droog zijn, breng de schijf over in een Petri-schaal om het oppervlak van de schijf te functionaliseren. Pipet 200 tot 400 microliters van 0,1% polyol lysine op de schijven in een bioveiligheidskast en incubeer bij kamertemperatuur gedurende één uur met behulp van pincetten om de schijven vast te houden.
Gebruik gedeïoniseerd water om ze te wassen zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Plateer vervolgens 200 tot 400 microliters van resuspendeerde cellen die twee keer zijn gewassen op de gecoate monsterschijven. Na het incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, gebruik voorzichtig één milliliter gedeïoniseerd water om de schijven te wassen.
Laat de schijven een nacht drogen voordat u beeldvorming uitvoert om Kelvin Probe Force microscopie beeldvorming uit te voeren. Schakel de computer in samen met de atoomkrachtmicroscoop of AFM's, HEB en MAC drie controller. Open een AFM beeldvormingssoftware zoals Ulence P ovu overzicht.
Selecteer A-C-A-F-M of de juiste aanduiding voor beeldvorming in intermittent contact mode. Gebruik een FM pincet in de dominante hand en houd de veerbelaste cliphouder open in de andere hand, plaats voorzichtig de A-K-P-F-M cantilever in de kop. Laad de kop voorzichtig in de AFM en sluit de laserlicht en stage lift motor draden aan.
Richt vervolgens de laser op de punt van de cantilever. Om de laser op de punt van de cantilever te richten. Draai de voor-achterknop een paar keer met de klok mee om de laser bovenop de cantilever chip te bewegen.
Wanneer de laser de chip bereikt, zal deze worden geblokkeerd en niet meer zichtbaar zijn. Draai vervolgens de voor-achterknop tegen de klok in totdat de laservlek weer verschijnt. De laser staat nu op de rand van de chip.
Draai de links-rechtsknop om de laser op de cantilever te positioneren. Terwijl de laser over de cantilever passeert, zal deze verdwijnen en weer verschijnen in snelle opvolging. De laservlek moet zichtbaar zijn in de matglas deksel waar de fotodiode-eenheid later zal zitten.
Draai de voor-achterknop tegen de klok in om de vlek langs de cantilever naar de punt te bewegen tot de vlek op het matglas verdwijnt. Draai nu de voor-achterknop slechts lichtjes met de klok mee om de laser zo te positioneren dat deze net op de cantileverpunt zit, de laservlek zal opnieuw verschijnen op het matglas. Zodra de laser is uitgelijnd, houd de stage lift motor in de open positie gedurende 10 seconden om voldoende ruimte tussen de cantilever en het monster te garanderen.
Wanneer u het monster aan de AFM bevestigt, plaats het monster nu op de KPFM stage. Gebruik koperdraad om het monster te aarden en sluit de juiste draden van de AFM aan op het monsterstadium. Verbind vervolgens het stadium met de AFM in de AFM-software.
Zorg ervoor dat de insteltijd niet meer dan 10 milliseconden is en dat de benaderingssnelheden niet hoger zijn dan twee micrometer per seconde. Om schade aan de punt te voorkomen, stemt u de cantilever af en begint u de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het gebruik van Kelvin probe force microscopy (KPFM) om hoge-resolutie nanoschaaloppervlakte potentiaal kaarten te maken. De techniek wordt toegepast om te onderzoeken hoe oppervlakte potentiaal de bindingscapaciteit van micro-organismen tot verschillende substraatoppervlakken beïnvloedt.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Microbiologie
- Oppervlaktewetenschap
Achtergrond
- Micro-organismen vertonen verschillende hechting aan verschillende materiaalsubstraten.
- Oppervlakte potentiaal speelt een cruciale rol bij microbiële hechting.
- Traditionele methoden beoordelen bulk eigenschappen in plaats van individuele celkenmerken.
- KPFM biedt inzichten in de lading van individuele cellen en biofilms.
Doel van de studie
- Om veranderingen in celmembraan lading na hechting aan verschillende substraten te observeren.
- Om de impact van substraatlading op microbiële hechtingssnelheden te evalueren.
- Om de voordelen van KPFM ten opzichte van bestaande methoden te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Micro-organismen kweken in voedingsrijke media.
- Reinigen en functioneel maken van materiaaloppervlakken voor optimale hechting.
- Micro-organismen op verschillende substraten plateren.
- KPFM gebruiken voor beeldvorming en analyse van celmembraan lading.
Belangrijkste resultaten
- Het type materiaal substraat beïnvloedt celactiviteit en hechting.
- Veranderingen in celmembraan lading correleren met substraatkenmerken.
- KPFM maakt gedetailleerde onderzoek van individuele cel eigenschappen mogelijk.
- De techniek overtreft traditionele methoden in specificiteit.
Conclusies
- KPFM is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van microbiële interacties met oppervlakken.
- Begrip van oppervlakte potentiaal kan materiaalontwerp informeren voor betere microbiële hechting.
- Deze methode verbetert ons vermogen om microbieel gedrag op nanoschaal onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Kelvin probe force microscopy (KPFM) enables nanoscale measurement of microbial membrane surface potential, providing critical insights into electrostatic interactions that govern bacterial adhesion to biomaterials. This capability supports target validation in anti-infective development by de-risking mechanistic hypotheses about surface-mediated pathogenesis. The technique offers predictive value for screening antimicrobial coatings and implant materials by quantifying cell-surface charge dynamics at single-cell resolution.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses linking microbial membrane charge to adhesion mechanisms on medically relevant surfaces.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating surface potential changes with cellular metabolism and motility phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying surface properties that modulate pathogenic biofilm formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antimicrobial screening by mapping surface potential heterogeneity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for assay optimization across material substrates.
- Scalability: Facilitates platform reuse for evaluating lead compounds against adhesion-resistant strains.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage surface potential metrics to preclinical validation of anti-adhesion therapeutics.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by linking membrane charge shifts to reduced biofilm burden on implant materials.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive de-risking of surface-targeted interventions through nanoscale charge mapping.
Pipeline & Workflow Integration
KPFM integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, particularly for anti-infective programs targeting microbial adhesion.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of charge-mediated adhesion pathways and biological de-risking of surface targets.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized surface potential mapping and topographical correlation.
- Analytics: Provides quantitative surface potential readouts and step-height graphs that enable condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking membrane potential changes to reduced adherence on functionalized surfaces.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening material libraries and compound effects on microbial electrostatic interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in adhesion mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of single-cell electrostatic measurements.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions on antimicrobial coatings, capital efficiency in biomaterial screening, reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on surface charge modulation efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy, KPFM operation, and nanoscale electrical data interpretation.
- Dependent on AFM instrumentation with KPFM module, conductive probes, and vibration isolation for stable measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, substrate functionalization, and environmental controls.
- Involves adaptation considerations for varying microbial strains, biofilm states, and substrate material properties.
- Practical limitations include sample dehydration artifacts and the need for conductive substrate coating for non-conductive materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Preparation of Glassware and Cultures
3:10
Cleaning and Inoculation of Stainless Steel and Gold Substrates
4:40
Kelvin Probe Force Microscopy Imaging
8:42
Results: Bacterial Surface Potential Measurements using Kelvin Probe Force Microscopy
10:19
Conclusion
