Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is het observeren van veranderingen in de lading van het celmembraan na adhesie aan verschillende materiaalsubstraten. Dit wordt bereikt door de micro-organismen te kweken in een voedingsrijk medium om hun aantal te verhogen. Vervolgens worden de materiaaloppervlakken waaraan de micro-organismen zullen hechten, gereinigd en gefunctionaliseerd voor optimale microbiële aanhechtingspercentages.

Vervolgens worden de micro-organismen op de verschillende materiaalsubstraten geplaatst om Kelvin probe force microscopy of KPFM-beeldvorming mogelijk te maken. De resultaten tonen aan dat het type materiaalsubstraat en de inherente lading ervan invloed hebben op de celactiviteit, wat blijkt uit veranderingen in de lading van het celmembraan en de celadhesie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektroforetische bepaling, lichtverstrooiing en bepaling van het isoelektrisch punt, is dat KPFM de onderzoeking van de lading van individuele cellen en biofilms mogelijk maakt in plaats van volledige culturen of kolonies.

Dit is gunstig wanneer men cel-tot-cel elektrische eigenschappen alsook die van biofilmen met een hoge nauwkeurigheid en precisie wil vergelijken. Bereid eerst 5% schapenbloedagarplaten, ent de MRSA-bacteriën uit op de bereide platen en incubeer deze gedurende 24 uur bij 37 °C om goed geïsoleerde enkele kolonies te verkrijgen. Maak 500 mL triptiek-sojabouillon, aangevuld met 1% glucose en 0,1% natriumchloride, en autoclaveer dit samen met twee schone glazen reageerbuisjes en één doos pipetteertips van 1 mL.

Nadat het medium en de reageerbuizen zijn afgekoeld onder een veiligheidskast of nabij een brander, pipetteert u 6 mL TSB in elke reageerbuis. Inoculeer met behulp van een van de eerder bereide schapenbloedagarplaten een enkele kolonie MRSA in een van de buizen. Gebruik de tweede buis als negatieve controle om de steriliteit te waarborgen. Incubeer de buizen in een reciprocerende incubator gedurende 24 uur bij 37 °C en 200 RPM.

De MRSA-buis zou groei moeten vertonen, of er zou niets gegroeid mogen zijn in de controlebuis. Maak vervolgens een subcultuur door één milliliter van de 24-uurs cultuur te gebruiken om zes milliliter verse tryptic soy broth te inoculeren en incubeer dit gedurende nog eens zes uur bij 37 °C en 200 RPM. Pipetteer daarna één milliliter van de cultuur in een centrifugebuis en centrifugeer dit gedurende drie minuten bij 850 ×g.

Verwijder het supernatant en gebruik een pincet in de dominante hand om de pellet twee keer te wassen met gedeïoniseerd water. Houd een roestvrijstalen FM-monsterdisk van 20 millimeter vast en gebruik vijf milliliter gedeïoniseerd water om elke zijde te reinigen. Plaats de schone disks in een bekerglas met gedeïoniseerd water ensonicer deze gedurende één minuut.

Gebruik de pincet om de monsterdiskjes uit het bekerglas te verwijderen en plaats ze onder een hoek van ongeveer 60 graden tegen de rand van een open petrischaal op een papieren handdoek. Om ze volledig te laten drogen, kan het deksel van de schaal worden gebruikt om de drogende diskjes af te dekken. Zodra ze droog zijn, wordt het diskje overgebracht naar een petrischaal om het oppervlak van het diskje te functionaliseren. Pipetteer in een veiligheidskabinet 200 tot 400 µL 0,1% polylysine op de diskjes en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur, waarbij de pincet wordt gebruikt om de diskjes vast te houden.

Gebruik gedeïoniseerd water om ze te wassen, zoals eerder in deze video is gedemonstreerd. Pipetteer vervolgens 200 tot 400 µL van de geresuspendeerde cellen, die twee keer zijn gewassen, op de gecoate monsterdiscs. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten worden de discs voorzichtig gewassen met 1 mL gedeïoniseerd water.

Laat de schijven een nacht drogen voor de beeldvorming om Kelvin Probe Force microscopie-opnames te maken. Zet de computer aan samen met de atoomkrachtmicroscoop of AFM's, de HEB en de MAC three controller. Open een AFM-beeldvormingssoftware zoals Ulence P ovu overview.

Selecteer A-C-A-F-M of de juiste aanduiding voor beeldvorming in intermittente contactmodus. Plaats met een FM-pincet in de dominante hand en terwijl u de veerbelaste klemhouder met de andere hand openhoudt, voorzichtig de A-K-P-F-M cantilever in het hoofdstuk. Plaats het hoofdstuk voorzichtig in de A FM en sluit de draden van het laserlicht en de motor van de tafellift aan.

Richt vervolgens de laser op de punt van de cantilever. Om de laser op de punt van de cantilever uit te lijnen, draait u de knop voor achteruit een paar keer met de klok mee om de laser bovenop de cantilever-chip te positioneren.

Wanneer de laser de chip bereikt, wordt deze geblokkeerd en is hij niet langer zichtbaar. Draai vervolgens aan de knop voor achterwaartse verplaatsing tegen de klok in totdat de laserstraal opnieuw verschijnt. De laser bevindt zich nu op de rand van de chip.

Draai aan de knop voor de links-rechtsverplaatsing om de laser op de cantilever te positioneren. Terwijl de laser over de cantilever beweegt, zal deze in snelle opeenvolging verdwijnen en weer verschijnen. De laserstraal moet zichtbaar zijn op de matte glazen afdekplaat waar de fotodiodunit later zal worden geplaatst.

Draai de knop voor-achter tegen de klok in om de spot over de cantilever naar de tip te bewegen totdat de spot op het matglas verdwijnt. Draai de knop voor-achter nu slechts een klein beetje met de klok mee om de laser zodanig te positioneren dat deze precies op de tip van de cantilever rust; de laserspot zal dan weer zichtbaar worden op het matglas. Zodra de laser is uitgelijnd, houdt u de liftmotor van de tafel 10 seconden lang in de open positie om voldoende ruimte tussen de cantilever en het monster te garanderen.

Plaats bij het bevestigen van het monster aan de A FM het monster nu op de KPFM-houder. Gebruik koperdraad om het monster te aarden en verbind de juiste draden van de A FM met de monsterhouder. Verbind vervolgens de houder met de A FM in de A FM-software.

Zorg ervoor dat de insteltijd niet meer dan 10 milliseconden bedraagt en dat de benaderingssnelheden twee microns per seconde niet overschrijden. Stem vervolgens de cantilever af en begin de cantilevertip naar het monster te bewegen om beschadiging van de tip te voorkomen. Zodra de cantilevertip het monsteroppervlak bereikt, selecteert u een grootte voor het beeldvenster en een ideaal beeldgebied, en optimaliseert u de I- en P-versterkingen samen met het instelpunt van de cantilever, zodat de topografische beeldvorming is geoptimaliseerd.

Zodra de topografische beeldvorming is geoptimaliseerd, schakelt u de KPFM-module in FM-modus in. Stel het beeldvenster in op vijf micron bij vijf micron met een resolutie van 12 bij 12 of lage scansnelheden. Stel voor de FM KPFM-instellingen de drive in tussen 5% en 10%. Stel de drive-frequentie in tussen 1 en 5 kilohertz met een bandbreedte van 2 kilohertz.

Stel de ijzer-NP-winsten voor de F-M-K-P-F-M in op 0,3%. Na het verkrijgen van de KPFM-beelden wordt software voor nabewerking gebruikt om de beelden te analyseren en om SP-gegevens te verzamelen met de instellingen die in deze video-demonstratie worden beschreven. KPFM-beelden werden genomen van 15 MRSA-cellen op zowel roestvrijstalen als gouden oppervlakken. Hier worden de verzamelde typen beelden getoond.

Omdat KPFM werkt met dubbele frequenties, werden topografische beelden en elektrische gegevens van het celoppervlak gelijktijdig verzameld. Thermische filters werden toegepast op de potentiaalkaarten van het oppervlak om kleine veranderingen in het oppervlaktepotentiaal gemakkelijker te kunnen onderscheiden. In deze grafiek werden beelden geanalyseerd om het oppervlaktepotentiaal van het microbiële membraan te bepalen, om deze vervolgens te gebruiken voor een vergelijking van de groei op verschillende substraten.

Oppervlaktepotentiaalscans van de onbehandelde roestvrijstalen en onbehandelde gouden substraten vertoonden over het algemeen negatieve oppervlaktepotentialen. Zowel de met polyollysine gecoate roestvrijstalen als gouden schijven vertoonden een verschuiving naar positieve oppervlaktepotentialen. De membraanpotentialen van MRSA-cellen varieerden tussen de roestvrijstalen en gouden oppervlakken.

Hierbij vertoonde het roestvrij staal een aanzienlijk groter positief membraanoppervlakspotentiaal voor cellen vergeleken met MRSA-cellen op het gouden substraat, die negatieve oppervlaktepotentialen vertoonden. Om de volledige mogelijkheden van KPFM aan te tonen, is hier een voorbeeld van een staphoogtegrafiek van MRSA op roestvrij staal te zien. Dit toont het verschil in oppervlaktepotentiaal tussen het oppervlak van het substraat en het microbiële membraan.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe Kelvin probe force microscopy kan worden gebruikt om de effecten van elektrische lading op de aanhechting en activiteit van microbiële cellen op verschillende materiaalsubstraten te onderzoeken.