Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Het algemene doel van deze procedure is om dopamine-neuronen te isoleren uit weefselsecties op glazen platen. Dit wordt bereikt door eerst bevroren ventrale mesencephalonweefsel in stukken te snijden op gestileerde glazen platen of penmembraan platen. Vervolgens worden dopamine-neuronen gelabeld met een snelle fluorescente immunohistologie.

Vervolgens wordt het weefsel gedehydrateerd en geladen in de laser capture microscoop. Daarna worden de gelabelde dopamine-neuronen aan de LCM-kap bevestigd met behulp van de infrarode laser en wordt het RNA of het molecuul van belang geïsoleerd. De resultaten tonen aan dat RNA van voldoende hoeveelheid en kwaliteit kan worden verkregen voor kwantitatieve PCR-metingen met behulp van laser capture microscopie.

Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals grove dissectie of micro punchs, is dat individuele celpopulaties kunnen worden geïsoleerd of zeer discrete hersengebieden. Om je voor te bereiden op RNA-isolatie doop je ofwel seline prep platen of polyethyleen methylaat of penmembraan glazen platen in een decontaminatie oplossing en gebruik RNA-vrije water om ze drie keer te wassen met behulp van een gradiënt reeks van RNA-vrije ethanol, de platen te dehydrateren en gedurende 30 minuten te drogen met een cryostaat gesneden weefselsecties van 10 microns dik en monteer op voorbereide RNA-vrije platen. Houd de monsters bevroren tijdens het snijden om de RNA-kwaliteit te behouden.

Ga vervolgens over tot immunohistologie. Gebruik een hydrofobe pen om het weefsel af te bakenen en laat ze drogen, vervolgens in een een-op-een oplossing van aceton en methanol. Fixeer het weefsel bij min 20 graden Celsius gedurende 10 minuten. Nadat het weefsel uit de vriezer is verwijderd, bedek de secties met 100 tot 200 microliters tyrosine hydroxylase antilichaam NPBS en 1% tritton gedurende 10 minuten.

Gebruik vervolgens PBS met 1% tritton om de platen te spoelen voordat je de secties bedekt met 100 tot 200 microliters van geit anti konijn IgG, gelabeld met Alexa Fluor 4 88. Incubeer gedurende vijf minuten en gebruik vervolgens PBS om de platen twee keer te spoelen. Droog vervolgens de monsters af met een geïntegreerde serie RNA-vrije ethanol gedurende 30 seconden elk, zoals eerder in deze video is aangetoond. Incubeer gedurende één minuut in xyleen en was vervolgens gedurende vijf minuten.

Verwijder de platen onmiddellijk voor gebruik voor LCM en laat ze aan de lucht drogen. Nadat je de LCM-kappen en de platen hebt geladen en het LCM-systeem hebt ingesteld volgens het tekstprotocol, pas je de IR-laser capture aan voor sterkte. Plaats de dop in een gebied van de plaat weg van weefsel op de capture laser toolbar.

Selecteer inschakelen, pas de pulssterkte en het aantal treffers van de laser aan. Laat de IR-laser branden wanneer de dop zich boven een deel van de plaat zonder weefsel bevindt en controleer of de laser de LCM-cap membraan voldoende smelt. Na het aanpassen van de IR-laser intensiteit, klik je met de rechtermuisknop en selecteer je dat de capture laser hier is om de laser te richten voor LCM op individuele dopamine-neuronen van cline prep platen.

Begin met het bewegen naar het gebied van belang om de cellen te vangen om individuele cellen te vangen van een cline prep zijde. Selecteer in de microdissectie toolbar de LCM-tab, vervolgens het enkele puntpictogram. Vervolgens in de microscoop toolbar, gebruik je de sluitertab om te schakelen tussen fluoresceren en helder veld met fluorescente filters tabs om de juiste filters te kiezen en gebruik je de objectieven tabs om de vergroting te veranderen.

Zodra de cellen van belang zichtbaar zijn in het live video venster, pas je de spotgrootte aan die wordt gebruikt om cellen van belang te markeren aan de geschatte grootte van de cellen. Markeer de cellen van belang door het enkele puntpictogram te selecteren en vervolgens op de cellen te klikken. Zodra de cellen zijn gemarkeerd op de microdissectie toolbar, selecteer je de go cut and capture tab en de IR-laser zal automatisch branden op alle gemarkeerde cellen die zijn geselecteerd.

Verplaats de dop weg van de sectie en naar een open gebied van de plaat om te controleren of de cellen op de LCM-cap zijn gevangen. Wanneer je klaar bent met het verzamelen van weefsel, verplaats je de dop door met de rechtermuisknop op de dop te klikken en te selecteren verplaats naar en vervolgens te ontladen zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruik je de plaat verwerkt voor immunohistologie als gids om het gebied van belang van het weefsel op de penmembraan te selecteren. Selecteer in de micro dissectie toolbar de cut and capture tab, selecteer vervolgens de cut line tab en gebruik de immunohistologie gelabelde plaat als gids, omcirkel het gebied van belang onder de 10 x objectief.

Test, brand en richt de IR en UV lasers zoals eerder is aangetoond. In deze video, selecteer in de microdissectie toolbar de go capture and cut tab. Vervolgens verplaats je de LCM-dop van het weefsel om te bepalen of het weefsel is verwijderd van de sectie en bevestigd aan de dop.

Wanneer je klaar bent met het verzamelen van weefsel om de dop te verwijderen, klik je met de rechtermuisknop op de dop en selecteer je verplaats naar en vervolgens de micrografieën in deze figuren laten zien dat LCM in staat is om individuele tyrosine hydroxylase immunoreactieve dopamine-neuronen te isoleren met behulp van de IR-laser of de IR en UV-lasers omdat het meest gebruikelijke gebruik van cellen in weefsels geïsoleerd met behulp van LCM RNA-analyse is. De procedures gepresenteerd werden geoptimaliseerd om de RNA-integriteit te behouden zoals te zien aan een relatieve vermindering in hoogte van de RRNA 28 S piek vergeleken met de 18 S piek, RNA-kwaliteit werd verminderd in LCM-monsters met lagere integriteit na immunohistologie, gevolgd door aceton fixatie vergeleken met de hele hersenen RNA. Om de hoeveelheid RNA te meten verkregen van neuronen aangeschaft via L-C-M-R-N-A van dopamine-neuronen van de ventrale teal gebied vanuit saline prep Platen werden geïsoleerd op basis van de standaardcurve genereerde een totaal van 17,3, 24,8 en 50,9 picogram per microliter werden geïsoleerd uit 5, 100 en 200 dopamine-neuronen respectievelijk.

Met behulp van QPCR om RNA-kwa