Voorbereiding, Imaging, en kwantificeren van Bacteriële Surface Motility Testen
7 april 2015
Zwermen motiliteit wordt beïnvloed door fysische en omgevingsfactoren. We beschrijven een tweefasenprotocol en richtlijnen om de uitdagingen die gewoonlijk worden geassocieerd met zwermtestvoorbereiding en gegevensverzameling te omzeilen. Een macroscopische beeldtechniek wordt gebruikt om gedetailleerde informatie over zwermgedrag te verkrijgen die niet wordt geleverd door huidige analysetechnieken.
Het algemene doel van deze procedure is om bacteriële oppervlaktemobiliteit, ook wel zwermen genoemd, op een standaard en reproduceerbare manier te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de platen voor oppervlaktemobiliteit voor te bereiden en te genezen. De tweede stap is om de platen voor het oppervlaktemobiliteitsonderzoek met bacteriën te inoculeren en deze platen in een gecontroleerde omgeving te incuberen.
Vervolgens worden de patronen van bacteriegroei op de plaattests in realtime geïmage. De laatste stap van de procedure is om de beelden te verwerken voor kwantificering. Uiteindelijk biedt deze procedure een gestandaardiseerd protocol voor de voorbereiding van de plaattests voor oppervlaktemobiliteit om kwantitatieve dynamische informatie te genereren, zoals de uitbreidingssnelheid van zwermen of de dichtheidsverdeling van bioproducten voor oppervlaktemodale bacteriën.
Veel groepen voeren oppervlaktemobiliteitstests uit. Het grote voordeel van deze techniek is dat we een systematisch protocol bieden dat de meerdere variabelen minimaliseert die tot inconsistentie kunnen leiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bacteriële oppervlaktemobiliteit, zoals hoe bacteriën verschillende soorten oppervlakken koloniseren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de zwermmotiliteit van pseudomonas met enkele wijzigingen, kan deze ook worden toegepast om andere oppervlaktemodale bacteriën te bestuderen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen omdat kleine wijzigingen in het protocol of de laboratoriumomgeving de resultaten van het zwermtest kunnen sterk beïnvloeden. De procedure wordt gedemonstreerd door Morgan, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.
Om het protocol te beginnen, bereid een agri mix voor door 200 milliliter FAB minus ammoniumsulfaat zwermmedium, 0,9 gram edel agar en 0,2 gram caino zuren te combineren in een mediafles van 500 milliliter. Gebruik een roerplaat om het medium grondig te mengen. Steriliseer vervolgens het medium in een autoclaaf ingesteld op 121,1 graden Celsius gedurende 22 minuten met een snelle ontluchtingsoptie.
Onmiddellijk na sterilisatie, draai de dop van de mediafles vast om waterverdamping te voorkomen. Plaats de media op een magnetische roerplaat en koel de AED af tot 50 graden Celsius in een omgeving met actieve roeren bij een kamertemperatuur. Als de agar op een later tijdstip in het experiment zal worden gebruikt, kan deze 15 uur warm worden gehouden in een waterbad van 60 graden Celsius of een incubator zonder actieve roering.
Wanneer het medium ongeveer 50 graden Celsius bereikt bij twee milliliters gefilterd gesteriliseerde glucose, meng dan grondig met de magnetische roerbar om bubbeltjesvorming in het medium te voorkomen, met behulp van standaard steriele technieken. Gebruik in een afzuigkap een steriele serologische pipet om 7,5 milliliter van de edia in individuele 60 millimeter petrischalen te verdelen. Als een groter zwermoppervlak gewenst is, verdeel 25 liter edia in 100 millimeter petrischalen.
Laat alle schalen ongestapeld en controleer de afzuigkap met een bullseye niveau om er zeker van te zijn dat het oppervlak horizontaal is, zodat de agar kan stollen. Voor 60 millimeter platen, zet de schoteldeksels opzij en laat de onbedekte agar in de kap 30 minuten drogen. Grotere 100 millimeter schalen vereisen een langere drogingstijd.
De luchtvochtigheid, luchtstroom en temperatuur van een bepaald laboratorium kunnen het testen van de drogingstijd noodzakelijk maken voor het optimale zwermen van uw bacterie. Na het drogen, moeten de APL's onmiddellijk worden geïnoculeerd met cellen die apart zijn voorgegroeid tot de gewenste groeifase. Om te beginnen, pluk een geïsoleerde bacteriekolonie van een verse LB-plaat en inoculeer in zes milliliter cultuur.Media.
Incubeer de cultuur een nacht bij 37 graden Celsius met horizontaal schudden. Op de volgende dag, inoculeer een tot vijf microliters van de overnachtcultuur over de gedroogde zwermagarplaten door de agaroppervlakte te prikken met een steriele tandenstoker of draaden inoculatienaald, afhankelijk van de bacteriestam, breng de zwermtestplaten over in een incubator met een temperatuur ingesteld op 30 graden Celsius, 37 graden Celsius of 42 graden Celsius. Draai de platen om zodat overtollig vocht condenseert op het deksel van de plaat en niet op de agar, breng de bacteriën in evenwicht bij stamspecifieke temperaturen gedurende twee of vier uur net voor de time-lapse beeldvorming.
Vervolgens worden de platen overgebracht naar de in vivo beeldvormingseenheid zodat de bacteriën op het agri-oppervlak naar de omgekeerde camera van de eenheid kijken. Vul alle petrischaaldeksels met een kleine hoeveelheid water. Plaats vervolgens elke dop met waterzijde omhoog op de omgekeerde AER-platen.
Binnen de beeldvormingseenheid, sluit de beeldvormingsomhulling af om een constante luchtvochtigheid te handhaven, pas de beeldvormingsinstellingen van de beeldvormingseenheid aan en start de time-lapse beeldvorming van zwermactiviteit. Na realtime beeldvorming kunnen de zwermdynamiek van de bacteriën worden geanalyseerd met behulp van standaard beeldanalyse, zoals Image J in een oppervlaktemobiliteitsexperiment. Het testen van de agarvochtinhoud net voor de inoculatie is cruciaal voor het bereiken van succesvolle zwermresultaten.
Optimaal zullen AER-platen een strakke inoculatieplek vergemakkelijken en de bacteriële zwermactiviteit verbeteren, terwijl overdrocht platen de oppervlaktemobiliteit zullen onderdrukken. Naast het vochtgehalte, kan de aan- of afwezigheid van media-additieven ook de zwermactiviteit van bacteriën beïnvloeden als functie van de incubatietemperatuur door gebruik te maken van bacteriestammen die luminescentie of fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. De concurrentiedynamiek tussen twee verschillende bacteriesoorten kan worden vastgelegd in een time-lapse video. Bovendien kunnen veranderingen in lokale celdichtheid en de biosynthese van mobiliteit bevorderende lipiden binnen de bacteriezweem ook worden vastgesteld en gekwantificeerd met behulp van time-lapsed fluorescentiemicroscopie.
Volgend op deze procedure. Andere methoden zoals confocale microscopie
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestandaardiseerd protocol voor het visualiseren en kwantificeren van bacteriële zwermmotiliteit. Er wordt ingegaan op veelvoorkomende uitdagingen bij de voorbereiding van swarm-assays en de gegevensverzameling, waarbij gebruik wordt gemaakt van een macroscopische beeldtechniek voor gedetailleerde analyse.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Bacteriële Motiliteit
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Zwermmotiliteit wordt beïnvloed door diverse fysieke en omgevingsfactoren.
- Gestandaardiseerde protocollen zijn essentieel voor de reproduceerbaarheid van experimenten.
- Huidige analysetechnieken bieden mogelijk onvoldoende gedetailleerde inzichten in zwermgedrag.
- Inzicht in bacteriële kolonisatie op oppervlakken is cruciaal voor diverse toepassingen.
Doel van de studie
- Om een systematisch protocol te bieden voor oppervlaktemobiliteitsassays.
- Om variabelen te minimaliseren die leiden tot inconsistente resultaten.
- Om kwantitatieve gegevens te genereren over zwermexpansiesnelheden en de dichtheid van bioproducten.
Gebruikte methoden
- Bereiding van oppervlaktemotiliteitsplaten met specifieke media.
- Inoculatie van platen met bacteriën en gecontroleerde incubatie.
- Real-time imaging van bacteriële groeipatronen.
- Beeldbewerking voor kwantificering van swarming-dynamiek.
Belangrijkste resultaten
- Een reproduceerbare methode aangetoond voor het beoordelen van bacteriële oppervlaktemobiliteit.
- Belangrijke factoren geïdentificeerd die het zwermgedrag beïnvloeden, zoals het vochtgehalte.
- Inzichten verschaft in de dynamiek van bacteriële competitie.
- Gedetailleerde analyse van bacteriëel gedrag mogelijk gemaakt met behulp van time-lapse imaging.
Conclusies
- Het gestandaardiseerde protocol verbetert de betrouwbaarheid van swarm-assays.
- Het kan worden aangepast voor diverse bacteriële stammen en condities.
- Deze methode draagt bij aan een beter begrip van bacteriële motiliteit en kolonisatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Bacteriële oppervlakte-motiliteitsassays kampen met reproduceerbaarheidsproblemen vanwege de gevoeligheid voor agarconcentratie, vochtgehalte en omgevingsvariabelen, wat de validatie van targets bemoeilijkt bij de ontdekking van antimicrobiële middelen. Dit protocol standaardiseert de voorbereiding en kwantificering van swarm-assays, waardoor betrouwbare fenotypische screening en mechanistische risicobeperking van motiliteitsgerelateerde targets mogelijk worden. Door het leveren van kwantitatieve dynamische output, zoals de expansiesnelheid van de swarm en de dichtheid van het bio-product, ondersteunt het de voorspellende betrouwbaarheid in vroege discovery-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen met betrekking tot bacteriële kolonisatie en mechanismen van oppervlakteadhesie mogelijk.
- Operationele waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door motiliteit te isoleren als fenotypische uitlezing voor doelvalidatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage via kwantitatieve beoordeling van zwermdynamiek onder variërende genetische of chemische perturbaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound-screening door reproduceerbare swarm-fenotypes te waarborgen.
- Operationele waarde: Standardiseert de bereiding van agar, de inoculatie en de beeldvormingscondities om variabiliteit tussen assays te minimaliseren.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt time-lapse beeldvorming en kwantificeringsworkflows die compatibel zijn met high-content screeningplatforms.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt in vitro motiliteitswaarnemingen met preklinische modellen van biofilmvorming en kolonisatie van de gastheer.
- Afstemming van biomarkers: Maakt het mogelijk om fluorescerende of luminescente reporters te volgen om motiliteit te correleren met de expressie van virulentiefactoren.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Biedt kwantitatieve drempelwaarden voor go/no-go-beslissingen bij de validatie van anti-virulentiedoelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypotheses tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor anti-infectieuze programma's die zich richten op virulentie- of kolonisatiefactoren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van genen of verbindingen die de oppervlaktemobiliteit beïnvloeden als een virulentie-geassocieerde eigenschap.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde mediapreparatie en omgevingscontroles voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve dynamische read-outs, zoals de radiale expansiesnelheid en de distributie van de fluorescentie-intensiteit voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Koppelt mobiliteitsfenotypes aan preklinische relevantie in modellen voor persistente infectie en kolonisatie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging- en kwantificatieplatform voor meerdere bacteriële stammen en experimentele condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door het verminderen van fout-negatieven als gevolg van onreproduceerbaarheid van assays in screenings op basis van motiliteit.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria door gedefinieerde protocollen voor uitharding, inoculatie en beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van vroegtijdige risicoreductie van targets die betrokken zijn bij oppervlakteadhesie en de initiatie van biofilms.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van anti-virulentiekandidaten op basis van de effectiviteit van motiliteitsinhibitie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiologische technieken en de bereiding van steriele media.
- Afhankelijk van gecontroleerde omgevingscondities (vochtigheid, temperatuur, luchtstroom) voor een optimale stolling van de agar.
- Vereist standaardisatie van het inoculatievolume en de incubatietijd tussen verschillende gebruikers en locaties.
- Vereist aanpassing van de agarkoncentratie (0,4%-0,8% wt/vol) op basis van de zwermgevoeligheid van de bacteriële stam.
- Beperkt door de noodzaak van een infrastructuur voor time-lapse imaging en vaardigheid in beeldanalyse (bijv. ImageJ) voor kwantificatie.
