Voorbereiding, Imaging, en kwantificeren van Bacteriële Surface Motility Testen
April 7th, 2015
Zwermen motiliteit wordt beïnvloed door fysische en omgevingsfactoren. We beschrijven een tweefasenprotocol en richtlijnen om de uitdagingen die gewoonlijk worden geassocieerd met zwermtestvoorbereiding en gegevensverzameling te omzeilen. Een macroscopische beeldtechniek wordt gebruikt om gedetailleerde informatie over zwermgedrag te verkrijgen die niet wordt geleverd door huidige analysetechnieken.
Het algemene doel van deze procedure is om bacteriële oppervlaktemobiliteit, ook wel zwermen genoemd, op een standaard en reproduceerbare manier te visualiseren en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de platen voor oppervlaktemobiliteit voor te bereiden en te genezen. De tweede stap is om de platen voor het oppervlaktemobiliteitsonderzoek met bacteriën te inoculeren en deze platen in een gecontroleerde omgeving te incuberen.
Vervolgens worden de patronen van bacteriegroei op de plaattests in realtime geïmage. De laatste stap van de procedure is om de beelden te verwerken voor kwantificering. Uiteindelijk biedt deze procedure een gestandaardiseerd protocol voor de voorbereiding van de plaattests voor oppervlaktemobiliteit om kwantitatieve dynamische informatie te genereren, zoals de uitbreidingssnelheid van zwermen of de dichtheidsverdeling van bioproducten voor oppervlaktemodale bacteriën.
Veel groepen voeren oppervlaktemobiliteitstests uit. Het grote voordeel van deze techniek is dat we een systematisch protocol bieden dat de meerdere variabelen minimaliseert die tot inconsistentie kunnen leiden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bacteriële oppervlaktemobiliteit, zoals hoe bacteriën verschillende soorten oppervlakken koloniseren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de zwermmotiliteit van pseudomonas met enkele wijzigingen, kan deze ook worden toegepast om andere oppervlaktemodale bacteriën te bestuderen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode worstelen omdat kleine wijzigingen in het protocol of de laboratoriumomgeving de resultaten van het zwermtest kunnen sterk beïnvloeden. De procedure wordt gedemonstreerd door Morgan, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium.
Om het protocol te beginnen, bereid een agri mix voor door 200 milliliter FAB minus ammoniumsulfaat zwermmedium, 0,9 gram edel agar en 0,2 gram caino zuren te combineren in een mediafles van 500 milliliter. Gebruik een roerplaat om het medium grondig te mengen. Steriliseer vervolgens het medium in een autoclaaf ingesteld op 121,1 graden Celsius gedurende 22 minuten met een snelle ontluchtingsoptie.
Onmiddellijk na sterilisatie, draai de dop van de mediafles vast om waterverdamping te voorkomen. Plaats de media op een magnetische roerplaat en koel de AED af tot 50 graden Celsius in een omgeving met actieve roeren bij een kamertemperatuur. Als de agar op een later tijdstip in het experiment zal worden gebruikt, kan deze 15 uur warm worden gehouden in een waterbad van 60 graden Celsius of een incubator zonder actieve roering.
Wanneer het medium ongeveer 50 graden Celsius bereikt bij twee milliliters gefilterd gesteriliseerde glucose, meng dan grondig met de magnetische roerbar om bubbeltjesvorming in het medium te voorkomen, met behulp van standaard steriele technieken. Gebruik in een afzuigkap een steriele serologische pipet om 7,5 milliliter van de edia in individuele 60 millimeter petrischalen te verdelen. Als een groter zwermoppervlak gewenst is, verdeel 25 liter edia in 100 millimeter petrischalen.
Laat alle schalen ongestapeld en controleer de afzuigkap met een bullseye niveau om er zeker van te zijn dat het oppervlak horizontaal is, zodat de agar kan stollen. Voor 60 millimeter platen, zet de schoteldeksels opzij en laat de onbedekte agar in de kap 30 minuten drogen. Grotere 100 millimeter schalen vereisen een langere drogingstijd.
De luchtvochtigheid, luchtstroom en temperatuur van een bepaald laboratorium kunnen het testen van de drogingstijd noodzakelijk maken voor het optimale zwermen van uw bacterie. Na het drogen, moeten de APL's onmiddellijk worden geïnoculeerd met cellen die apart zijn voorgegroeid tot de gewenste groeifase. Om te beginnen, pluk een geïsoleerde bacteriekolonie van een verse LB-plaat en inoculeer in zes milliliter cultuur.Media.
Incubeer de cultuur een nacht bij 37 graden Celsius met horizontaal schudden. Op de volgende dag, inoculeer een tot vijf microliters van de overnachtcultuur over de gedroogde zwermagarplaten door de agaroppervlakte te prikken met een steriele tandenstoker of draaden inoculatienaald, afhankelijk van de bacteriestam, breng de zwermtestplaten over in een incubator met een temperatuur ingesteld op 30 graden Celsius, 37 graden Celsius of 42 graden Celsius. Draai de platen om zodat overtollig vocht condenseert op het deksel van de plaat en niet op de agar, breng de bacteriën in evenwicht bij stamspecifieke temperaturen gedurende twee of vier uur net voor de time-lapse beeldvorming.
Vervolgens worden de platen overgebracht naar de in vivo beeldvormingseenheid zodat de bacteriën op het agri-oppervlak naar de omgekeerde camera van de eenheid kijken. Vul alle petrischaaldeksels met een kleine hoeveelheid water. Plaats vervolgens elke dop met waterzijde omhoog op de omgekeerde AER-platen.
Binnen de beeldvormingseenheid, sluit de beeldvormingsomhulling af om een constante luchtvochtigheid te handhaven, pas de beeldvormingsinstellingen van de beeldvormingseenheid aan en start de time-lapse beeldvorming van zwermactiviteit. Na realtime beeldvorming kunnen de zwermdynamiek van de bacteriën worden geanalyseerd met behulp van standaard beeldanalyse, zoals Image J in een oppervlaktemobiliteitsexperiment. Het testen van de agarvochtinhoud net voor de inoculatie is cruciaal voor het bereiken van succesvolle zwermresultaten.
Optimaal zullen AER-platen een strakke inoculatieplek vergemakkelijken en de bacteriële zwermactiviteit verbeteren, terwijl overdrocht platen de oppervlaktemobiliteit zullen onderdrukken. Naast het vochtgehalte, kan de aan- of afwezigheid van media-additieven ook de zwermactiviteit van bacteriën beïnvloeden als functie van de incubatietemperatuur door gebruik te maken van bacteriestammen die luminescentie of fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. De concurrentiedynamiek tussen twee verschillende bacteriesoorten kan worden vastgelegd in een time-lapse video. Bovendien kunnen veranderingen in lokale celdichtheid en de biosynthese van mobiliteit bevorderende lipiden binnen de bacteriezweem ook worden vastgesteld en gekwantificeerd met behulp van time-lapsed fluorescentiemicroscopie.
Volgend op deze procedure. Andere methoden zoals confocale microscopie
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestandaardiseerd protocol voor het visualiseren en kwantificeren van bacteriële zwermbeweging. Het behandelt veelvoorkomende uitdagingen bij de voorbereiding van zwermtests en gegevensverzameling, door gebruik te maken van een macroscopische beeldtechniek voor gedetailleerde analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Bacteriële Motiliteit
- Beeldtechnieken
Achtergrond
- Zwermbeweging wordt beïnvloed door verschillende fysische en omgevingsfactoren.
- Gestandardiseerd protocollen zijn essentieel voor reproduceerbaarheid in experimenten.
- Huidige analysetechnieken kunnen gedetailleerde inzichten in zwermgedrag ontberen.
- Het begrijpen van bacteriële kolonisatie op oppervlakken is cruciaal voor verschillende toepassingen.
Doel van de studie
- Om een systematisch protocol te bieden voor oppervlaktemotiteitstests.
- Om variabelen te minimaliseren die tot inconsistente resultaten leiden.
- Om kwantitatieve gegevens te genereren over zwersuitbreidingssnelheden en bioproductdichtheid.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van oppervlaktemotiteitsplaten met specifiek media.
- Inoculairen van platen met bacteriën en gecontroleerde incubatie.
- Real-time beeldvorming van bacteriegroeipatronen.
- Beeldverwerking voor kwantificering van zwermdynamiek.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde een reproduceerbare methode voor het beoordelen van bacteriële oppervlaktemotiteit.
- Identificeerde belangrijke factoren die zwermgedrag beïnvloeden, zoals vochgehalte.
- Gaf inzichten in de dynamiek van bacteriële concurrentie.
- Maakte gedetailleerde analyse van bacterieel gedrag mogelijk met behulp van time-lapse beeldvorming.
Conclusies
- Het gestandaardiseerde protocol verbetert de betrouwbaarheid van zwermtests.
- Het kan worden aangepast voor verschillende bacteriestammen en omstandigheden.
- Deze methode draagt bij aan een beter begrip van bacteriële motiliteit en kolonisatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Bacterial surface motility assays face reproducibility challenges due to sensitivity to agar concentration, moisture content, and environmental variables, complicating target validation in antimicrobial discovery. This protocol standardizes swarm assay preparation and quantification, enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking of motility-related targets. By providing quantitative dynamic outputs such as swarm expansion rate and bio-product density, it supports predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to bacterial colonization and surface adherence mechanisms.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating motility as a phenotypic readout for target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through quantitative assessment of swarm dynamics under varying genetic or chemical perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by ensuring reproducible swarm phenotypes.
- Operational Value: Standardizes agar preparation, inoculation, and imaging conditions to minimize inter-assay variability.
- Scalability: Supports time-lapse imaging and quantification workflows compatible with high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro motility observations to preclinical models of biofilm formation and host colonization.
- Biomarker Alignment: Enables tracking of fluorescent or luminescent reporters to correlate motility with virulence factor expression.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions in anti-virulence target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for anti-infective programs targeting virulence or colonization factors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting surface motility as a virulence-associated trait.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized media preparation and environmental controls for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dynamic readouts such as radial expansion rate and fluorescence intensity distribution for comparative analysis.
- Translational Research: Links motility phenotypes to preclinical relevance in persistent infection and colonization models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform for multiple bacterial strains and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing false negatives from assay irreproducibility in motility-based screens.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across laboratories through defined curing, inoculation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in surface adherence and biofilm initiation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on motility inhibition efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques and sterile media preparation.
- Dependent on controlled environmental conditions (humidity, temperature, airflow) for optimal agar solidification.
- Necessitates standardization of inoculation volume and incubation timing across users and sites.
- Requires adaptation of agar concentration (0.4%-0.8% wt/vol) based on bacterial strain swarming sensitivity.
- Limited by the need for time-lapse imaging infrastructure and image analysis proficiency (e.g., ImageJ) for quantification.
