Name: Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer polyacrylamidegelen maken voor invadopodia- en tractiekrachttesten op kankercellen. Deze methode analyseert invasieve eigenschappen en mechanische invloeden op kankercelgedrag in matrices met verschillende stijfheden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. Voorbereiding van de dekglaasjes voor PAAs <ol><li> Schone 12 mm dekglaasjes met pluisarme doekjes. </li><li> Vlam de 12 mm dekglaasjes en de 14 mm dekglaasje in de microwell van elk 35 mm glazen bodem schaal door ze door vlam van een bunsenbrander met een pincet. </li><li> Behandel de microputjes met 200 ui 0,1 N NaOH gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig en lucht drogen de microwells gedurende 30 min. </li><li> Behandel de microputjes met 50-100 pl 3-aminopropyltrimethoxysilaan gedurende 10 min bij kamertemperatuur in de zuurkast. Dit chemisch reageert met kunststof; Gebruik daarom glaspipetten en niet de microputjes niet helemaal vol contact met het gerecht plastic vermijden. </li><li> Was de microwells met ultrapuur water voor ongeveer 10 minuten totdat de 3-aminopropyltrimethoxysilaan duidelijk. </li><li> Spoel de microwells met ultrapuur water twee keer met behulp van een knijpfles. </li><li> Was de microwells met 2 ml ultrapuur water eent kamertemperatuur op een rocker ingesteld op een gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 10 min. </li><li> Zuig en lucht drogen de microwells gedurende 30 min. </li><li> Behandel de microputjes met 2 ml 0,5% glutaaraldehyde oplossing bij kamertemperatuur op een rocker ingesteld op een gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 30 min. </li><li> Was de microputjes met 2 ml ultrazuiver water bij kamertemperatuur op een rocker ingesteld op gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 10 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 30 min. </li><li> Droge microputjes een scherpe hoek (60 ° of meer) gedurende 30 min. Opmerking: Schotels worden opgeslagen gedurende 2 maanden in een exsiccator. </li></ol> 2. Voorbereiding van de PTA&#39;s voor Invadopodia Testen <ol><li> Voor een 1 ml oplossing van het zachte PAA (8% acrylamide en 0,05% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 25 pl 2% BIS en 574 gl ultrazuiver water (tabel 1). </li><li> Voor een 1 ml oplossing van de vaste PAA (8% acrylamide en 0,35% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 175 &amp; #181, l 2% BIS en 409 gl ultrazuiver water (tabel 1). </li><li> Voor een 1 ml oplossing van het stijve PAA (12% acrylamide en 0,60% BIS), combineer 300 gl 40% acrylamide, 300 gl 2% BIS, en 169 pl ultrazuiver water (tabel 1). </li><li> Ontgas de oplossing gedurende 15 min. Voeg 200, 215, en 230 pl van 1 mg / ml humaan plasma fibronectine in ultrazuiver water de zachte, harde en stijve PAA oplossingen resp. Voor alle oplossingen, voeg 1 ui 10 mg / ml acrylzuur N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, 5 ui van een 100 mg / ml ammoniumpersulfaat en 2 ui N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethylethyleendiamine (TEMED ; Tabel 1). Meng met zachte pipetteren en voorkomen dat er luchtbellen in oplossingen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Pl) </td><td> 2% (Pl) </td><td> Ultrapuur Water (Pl) </td><td> 1 mg / ml FN (Pl) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Pl) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Pl) </td><td> TEMED (Pl) </td><td> Elastisch Modulus (Pa) </td></tr><tr><td> Zacht </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Hard </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Stijf </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Ingrediënt volumes en resulterende elastische moduli voor zacht, hard en stijf PTA in de invadopodia assays. AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = ammoniumpersulfaat. <ol start="5"><li> Pipetteer 8.48 ul van de PAA-oplossing op het midden van elk microputje. Opmerking: Dit volume theorie levert een PAA 75 urn dik. </li><li> Sluit voorzichtig de gevlamde zijde van 12 mm dekglaasje op de druppel in de microputjes met een pincet. </li><li> Laat de kern PAA oplossing polymeriseren 15-30 min. Controleer polymerisatie door het controleren van de overgebleven oplossing. </li><li> Voeg 2 ml 1x PBS om elk gerecht en verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet. Opmerking: 10x PBS wordt in het laboratorium en samengesteld uit 0,011 M KH 2PO 4, 1,54 M NaCl en 0,056 M Na 2 HPO 4. </li><li> Was de microputjes met 2 ml 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min. </li></ol> 3. Peerherstel van PTA&#39;s voor meer trekkracht Testen <ol><li> Voor een 1 ml oplossing van het zachte PAA (8% acrylamide en 0,05% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 25 pl 2% BIS en 566 gl ultrazuiver water (tabel 2). </li><li> Voor een 1 ml oplossing van de vaste PAA (8% acrylamide en 0,35% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 175 gl 2% BIS en 401 gl ultrazuiver water (tabel 2). </li><li> Voor een 1 ml oplossing van het stijve PAA (12% acrylamide en 0,60% BIS), combineer 300 gl 40% acrylamide, 300 gl 2% BIS, en 161 pl ultrazuiver water (tabel 2). </li><li> Ontgas de oplossing gedurende 15 min. Voeg 200, 215, en 230 pl van 1 mg / ml humaan plasma fibronectine aan de zachte, harde en stijve PAA oplossingen resp. Ultrasone trillingen 8 pi 200 nm rode fluorescerende microbolletjes (excitatie / emissie van 580/605 nm) gedurende 30 sec. Voor elke oplossing, voeg 8 pi 200 nm rode fluorescerende microbolletjes,1 ui 10 mg / ml acrylzuur NHS ester, 5 ui van een 100 mg / ml ammoniumpersulfaat en 2 ui TEMED (tabel 2). Meng met zachte pipetteren en voorkomen dat er luchtbellen in oplossingen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Pl) </td><td> 2% BIS (Pl) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapuur Water (Pl) </td><td> 1 mg / ml FN (Pl) </td><td> Micro-sferen (Pl) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Pl) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Pl) </td><td> TEMED (Pl) </td><td> Elastisch Modulus (Pa) </td></tr><tr><td> Zacht </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Hard </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Stijf </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabel 2:. Volumes Ingrediënt en resulterende elastische moduli voor zacht, hard en stijf PTA in de trekkracht assays AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = ammoniumpersulfaat. <ol start="5"><li> Pipetteer 8.48 ul van de PAA-oplossing op het midden van elk microputje. Opmerking: Dit volume theorie levert een PAA 75 urn dik. </li><li> Sluit voorzichtig de gevlamde zijde van the 12 mm dekglaasje op de druppel in de microputjes met een pincet. </li><li> Laat de kern PAA oplossing polymeriseren 15-30 min. Controleer polymerisatie door het controleren van overgebleven oplossing. </li><li> Voeg 2 ml 1x PBS om elk gerecht en verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet. </li><li> Was de microputjes met 2 ml 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min. </li></ol> 4. Voorbereiding van ECM voor Invadopodia Testen <ol><li> Verwarm de gelatine-oplossing (1% gelatine en 1% sucrose) tot 37 ° C. </li><li> Behandel de PTA met 150 pi van de gelatine-oplossing gedurende 1 minuut vervolgens zorgvuldig aspireren van de bodem van de microputjes bij het vasthouden van de glazen bodem gerechten in een hoek van 45 °. </li><li> Droog de resterende dunne laag van gelatine aan de PTA in de microputjes op een steile hoek (60 ° of meer) te optimaliseren drogen gedurende 60 min. </li><li> Behandel de microputjes met 2 ml van een gekoelde 0,5% glutaaraldehyde oplossing ice 15 min gevolgd door kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Was de microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min. </li><li> Behandel de microputjes met 2 ml van een natriumboorhydride-oplossing gedurende 1 minuut. Tik voorzichtig gerechten op de bank te bellen die op het oppervlak van de gelatine vormen te verwijderen. </li><li> Zuig en was de microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min. </li><li> Verdun een FITC-gemerkte menselijke plasma fibronectine oplossing van 50 ug / ml met 1x PBS en centrifugeer bij 175.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min. Ofwel koopt commercieel beschikbaar gelabeld fibronectine of het etiket het als volgt: <ol><li> Los 5 mg fibronectine in 10 ml boraatbuffer (170 mM natriummetaboraat-tetrahydraat en 40 mM NaCl) en plaats dialyse tubing. </li><li> Label de fibronectine door het plaatsen van de buis in 200 ml boraatbuffer met 6 mg opgeloste FITC bij kamertemperatuur op een magnetische roerderingesteld op de laagste stand gedurende 1,5 uur in het donker. </li><li> Dialyseren met 500 ml van een 1x PBS op een ingesteld op de laagste stand voor 3 dagen in een donkere koude kamer (4 ° C) met twee volume magneetroerder verandert per dag. </li><li> Bereken FITC-gemerkte fibronectine concentratie gebaseerd op de optische dichtheid van monsters verdund (1: 200) bij 280 nm en 493 nm als [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 maal de verdunningsfactor van 200 maal 2 (waar de glycerol concentratie de fibronectine in de volgende stap) resulterend in mg / ml units. </li><li> Dialyseren overnachting in een 50% glycerol oplossing op een ingesteld op de laagste stand overnachting in een donkere koude kamer bij 4 ° C magneetroerder.) </li></ol></li><li> Behandel de microputjes met 150 pi van de FITC-gelabelde fibronectine-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 60 min in het donker. </li><li> Zuig het FITC gemerkte fibronectine oplossing uit de bodem van de microputjes voorzichtig bij het vasthouden van de glazen bodem gerechten45 ° en vul de glazen bodem gerechten met 70% ethanol oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een donkere celkweek kap voor sterilisatie. Vul ook glazen bodem schotel deksels of maak schoon met pluizen weinig doekjes gedrenkt in 70% ethanol. </li><li> Was glazen bodem gerechten door ze te vullen met 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer met 2 ml 1x PBS gedurende in totaal 15 min. </li></ol> 5. Voorbereiding en beeldvorming van Invadopodia Testen <ol><li> Voeg 25,000 kankercellen in 2 ml invadopodia medium (1: 1 DMEM en RPMI 1640 met 5% eiwitarme serum, 10% foetaal runderserum en 20 ng / ml vers toegevoegde epidermale groeifactor) voor de glazen bodem gerechten incubeer overnacht. </li><li> Zuig en behandel de microputjes met 2 ml van een 3,7% paraformaldehyde oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten om de cellen te repareren. </li><li> Na twee snelle wasbehandelingen met 2 ml 1x PBS, behandelen de microputjes met 2 ml van een 0,1% Triton X-100 oplossing bij kamer- tempetuur in het donker gedurende 5 minuten om de cellen te permeabiliseren. </li><li> Na een snelle wassing met 2 ml 1x PBS, behandelen de microputjes met 3% bovine serum albumine blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 minuten om de cellen te blokkeren. </li><li> Incubeer de microputjes met 150 pi van muizen anti-cortactin antilichaam (1: 750) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 min. </li><li> Was microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min. </li><li> Incubeer de microputjes 150 ul geit anti-muis 633 antilichaam (1: 500) en 546 falloïdine (1: 750) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 min. </li><li> Was microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min. </li><li> Voeg zes druppels montage medium aan elke microwell vullen en dek af met 22 x 22 dekglaasjes. </li><li> Afbeelding cortactine en actine te invadopodia te identificeren met behulp van excitatie en emissie filters van 632/647 nm en556/570 nm, respectievelijk, met behulp van een hoge NA, 40x olie-immersie lens op een breed veld omgekeerde microscoop. Op dezelfde afbeelding fibronectine aan ECM degradatie te identificeren met behulp van een excitatie en emissie-filter van 492/518 nm. </li></ol> 6. Voorbereiding en beeldvorming van Traction Force Testen <ol><li> Voeg 15.000 kankercellen in 2 ml invadopodia medium om de glazen bodem gerechten en incubeer overnacht. </li><li> Zuig medium in de glazen bodem gerechten en vervangen door 2 ml L-15-medium met dezelfde aanvullingen (5% eiwitarme serum, 10% foetaal runderserum en 20 ng / ml vers toegevoegde epidermale groeifactor), pre -warmed tot 37 ° C. </li><li> Incubeer de glazen bodem gerechten in een klimaatkamer bij een omgekeerde microscoop vooraf geëquilibreerd tot 37 ° C met een hoge vochtigheid gedurende 1 uur. </li><li> Neem vier sets van beelden met een hoge NA, 40x lens op een breed veld omgekeerde microscoop met een geautomatiseerde podium om cellulaire posities te markeren: <ol><li> Afbeelding cellen aanp van de PTA&#39;s met behulp van fase contrast (&quot;fase&quot; image). </li><li> Afbeelding fluorescerende microbolletjes met excitatie en emissie filters van 560/645 nm door zich net onder de cellen tot de eerste laag van microsferen aan de bovenkant van de PTA is scherpgesteld (&quot;stress&quot; beeld). </li><li> Daarnaast richten op de bodem van de PTA (de microsferen markers) en maak een opname (&quot;bottom&quot; beeld). Opmerking: Het doel van dit beeld is de z-positie om de werkelijke PAA dikte krijgen op elke positie trekkracht berekeningen zoals beschreven in Representatieve resultaten opnemen. </li><li> Na deze beelden zijn verworven op meerdere posities, meng in 220 ul van 10% Triton-X oplossing om cellen te verwijderen. Afbeelding microsferen bij de bovenkant van de PAAs op elke positie zoals eerder beschreven (het &quot;nul&quot;). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction gone awry.</a> Nature. 10, 63-73 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension+mounts%3A+mechanics+meets+morphogenesis+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mammary+gland+biology+and+neoplasia%22%5BJournal%5D)">The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy.</a> Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).</li>
<li>Parekh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+modulation+of+invadopodia+across+a+wide+range+of+rigidities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities.</a> Biophysical. 100, 573-582 (2011).</li>
<li>Jerrell, R. J., Parekh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+mediate+extracellular+matrix+degradation+by+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia.</a> Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7, e32572(2012).</li>
<li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2014).</li>
<li>Haage, A., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+contractility+and+extracellular+matrix+stiffness+regulate+matrix+metalloproteinase+activity+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells.</a> FASEB J. , (2014).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+specialized+cell+structures+for+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion.</a> Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia.</a> Curr Biol. 18, R362-364 (2008).</li>
<li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+breast+cancer+risk+prediction+model+for+women+undergoing+screening+mammography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+absolute+invasive+breast+cancer+risk+in+white+women+with+a+model+that+includes+mammographic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).</li>
<li>Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tense+situation%3A+forcing+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tense situation: forcing tumour progression.</a> Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Rosel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+Rho%2FROCK+signaling+in+sarcoma+cells+drives+invasion+and+increased+generation+of+protrusive+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces.</a> Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).</li>
<li>Indra, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys Biol. 8, 015015(2011).</li>
<li>Parekh, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+invasiveness+by+the+physical+extracellular+matrix+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+%26+migration%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment.</a> Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).</li>
<li>Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples).</a> Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wang, J. H., Lin, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+traction+force+and+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+modeling+in+mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Cell traction force and measurement methods.</a> Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).</li>
<li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+and+branching+of+PC12+cells+on+very+soft+substrates+sharply+decreases+below+a+threshold+of+substrate+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity.</a> J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).</li>
<li>Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules%2C+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).</li>
</ol>

Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal K25CA143412 (Parekh). We willen graag erkennen dat extra ondersteuning werd verleend door het ministerie van KNO. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

We presenteren een werkwijze voor het vervaardigen PTA die kunnen worden gebruikt als basis voor invadopodia en trekkracht assays invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren. Terwijl PTA zijn lang gebruikt om te kijken naar stijfheid effecten op cellen en bereken trekkrachten 18,24,27, dit protocol is de eerste parallelle assays op basis PTA dezelfde starheid ontwikkelen invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren reactie op matrix mechanische eigenschappen. Goed activeren van de dekglaa...

De stijfheid van het tumor geassocieerde ECM is geïdentificeerd als een belangrijke factor bij het ​​stimuleren maligne gedrag verhogen actomyosine contractiliteit 1-3. Hoewel dit effect voornamelijk aangetoond met borstkankercellen werd matrix stijfheid gebleken invasieve eigenschappen van cellen afkomstig van verschillende kankers 4-8 suggereert dat tumor stijfheid kan een rol spelen bij andere kankersoorten veranderen. Om verknoopte weefsels tijdens invasieve migratie dringen, kankercellen gebruiken actine-rijke lijm uitsteeksels bekend als invadopodia dat proteinases lokaal te maken focaal degraderen de ECM 9. Invadopodia worden beschouwd als een kenmerk van invasieve cellen en zijn betrokken bij tumorcel invasie en metastase 10,11. Vorige werk heeft aangetoond dat matrix stijfheid invadopodia nummers kunnen reguleren en bijbehorende ECM degradatie 4,12 door myosine II activiteit en mechanosensitieve eiwitten 12. Gezien decorrelatie tussen dichtheid en kanker tumor agressiviteit 13,14 suggereren deze resultaten een mechanisme waardoor kankercellen reageren stijve tumorweefsels invasie en metastase rijden door actomyosine contractiliteit. In vitro ECM stijfheid en in vivo weefseldichtheid is aangetoond dat invasieve gedrag van kankercellen 1,15-17 reguleren. Terwijl actomyosine contractiliteit blijkt belangrijk te zijn in dit proces, bestaande studies conflict of metastatische capaciteit gecorreleerd verhoogde of verlaagde contractiele krachten 6,18-20. Bovendien is het nog onbekend of deze krachten rechtstreeks bemiddelen invadopodia activiteit 21. We ontdekten recent dat kankercel contractiele krachten waren afhankelijk van matrix stijfheid en waren voorspellend voor ECM afbraak door invadopodia 5. Deze resultaten suggereren dat cellulaire krachten een belangrijke rol in de progressie van kanker kunnen spelen door te bemiddelen invadopodia activiteit in reactie op de mechanische eigenschappen van de tumor micro-omgeving. Om invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen 5 correleren, we aangepast een protocol voor het creëren van PTA&#39;s met verschillende rigiditeiten die eerder werd gebruikt om de stijfheid-afhankelijke invadopodia activiteit 4,12,22 onderzoeken. Door chemisch verknopen menselijk plasma fibronectine gehele PAAs, kunnen deze gemodificeerde hydrogelen worden gebruikt als basis voor zowel invadopodia en trekkracht testen om te waarborgen dat cellen ervoer dezelfde starre beide experimenten 5. In de invadopodia assays, de fibronectine zorgt voor een natuurlijke bindende domein voor gelatine om de overlay ECM koppelen aan de PTA&#39;s te matrixafbraak detecteren. In de trekkracht assays, de fibronectine verschaft een ligand voor directe cellulaire adhesie microsferen verplaatsingen gebruikt om cellulaire aandrijfkrachten berekenen detecteren. Deze methode resulteert in wat wij zacht, hard hebben genoemd,en stijf PTA&#39;s die zijn gebonden aan glazen bodem gerechten en hebben elasticiteitsmoduli, E, van 1.023, 7.307 en 22.692 Pa 5, die het bereik van de mechanische eigenschappen gemeld voor de normale en kankerweefsel 23 overspannen.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Acrylzuur NHS-ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>vers vers bereiden in afzuigkap 10 mg/ml in DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 ftaloïdin</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>kan ook rodamine gebruiken</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>vers vers bereiden 10% oplossing in 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>gebruik 6 druppels om microwells te vullen</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>maak 3% voor blokkeringsoplossing in 1x PBS en bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Dekglasjes (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Dialysebuis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>vooraf in evenwicht brengen in boraatbuffer gedurende 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>gebruik om invadopodia-medium te maken</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>gebruik om acrylzuur NHS-esteroplossing te maken</td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td>gebruik om invadopodia-medium te maken</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>verdun met ultrapuur water tot 70%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>gebruik om invadopodia-medium te maken</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>beschermen tegen licht</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>maak typisch 10 ml van 1% sucrose/1% gelatineoplossing in PBS en bewaar bij 4 &deg;C (verwarm PBS vooraf om gelatine gemakkelijk op te lossen)</td></tr><tr><td>Schotel met glazen bodem (35 mm dekglasjes)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>dekglasjes zijn ongecoat</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>verdun met 1x PBS tot 0,5%</td></tr><tr><td>Geit anti-muis Alexa Fluor 633-antilichaam</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Human plasma fibronectine</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>voeg 5 ml ultrapuur water toe om 1 mg/ml te maken; opsplitsen in volumes op basis van gebruik om overmatige bevriezing en ontdooicycli te voorkomen</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>gebruik om 10x PBS-voorraad te maken</td></tr><tr><td>Muis anti-cortactine 4F11-antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>gebruik om 10x PBS-voorraad te maken</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>gebruik om 10x PBS-voorraad en boraatbuffer te maken</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>verdun met ultrapuur water tot 0,1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (lage-eiwitserum)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>gebruik om invadopodia-medium te maken</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>maak typisch 10% voorraad in 1x PBS, bereid in afzuigkap en voeg een paar ml sterke NaOH toe om paraformaldehyde gemakkelijk op te lossen en breng vervolgens terug naar pH 7,4 met sterke HCl)</td></tr><tr><td>PBS (steriel)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>gebruik voor celkweek</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>gebruik om invadopodia-medium te maken</td></tr><tr><td>Natriumborohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>vers vers bereiden in afzuigkap 1 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>Natriummetaboraat tetrahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>gebruik om boraatbuffer te maken</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>maak typisch 10 ml van 1% sucrose/1% gelatineoplossing in PBS en bewaar bij 4 &deg;C (verwarm PBS vooraf om gelatine gemakkelijk op te lossen)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>maak 10% voorraad in 1x PBS en gebruik zoals het is voor celverwijdering in tractiekrachtassay of verdun met 1x PBS voor kleuring</td></tr></tbody></table>

polyacrylamidegelen voor invadopodia en traction force testen op kankercellen

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Vaste tumorweefsels zijn sterk betrokken bij het reguleren kankercelmigratie en invasie. Invasieve migratie door middel van cross-linked weefsels wordt vergemakkelijkt door actine-rijke uitsteeksels genaamd invadopodia dat proteolytisch degraderen de extracellulaire matrix (ECM). Invadopodia activiteit is aangetoond afhankelijk ECM stijfheid en kankercellijnen contractiele krachten suggereert dat stijfheid signalen die subcellulaire structuren kunnen reguleren door actomyosine contractiliteit te zijn. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Sommige verschillen tussen de twee tests bestaan, het protocol hier gepresenteerde een werkwijze voor het maken PAAs thbij kan in beide testen en gemakkelijk aanpasbaar aan specifieke biologische en technische behoeften van de gebruiker.

In de invadopodia assay worden invadopodia gewoonlijk geïdentificeerd door colocalization markers zoals actine en cortactin op puntvormige structuren in het cellichaam (figuur 1). Zowel actief afbrekende en niet-degraderende invadopodia kunnen worden geteld en gedifferentieerd of deze structuren colocalized met donkere gedeeltes zonder fluorescent signaal in de FITC-gelabelde fibronectine (figuur 1). Invadopodia worden handmatig geteld en ECM afbraak per cel wordt bepaald door het handm...

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Het algemene doel van deze procedure is het maken van polyacrylamidegels die kunnen worden gebruikt in zowel invader-, podia- als tractiekracht-assays om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de dekglasjes van 14 millimeter in de glazen petrischalen te activeren om ervoor te zorgen dat de polyacrylamidegels aan het glas hechten. Vervolgens worden polyacrylamide-oplossingen voor beide assays bereid om gels met verschillende stijfheden of mechanische eigenschappen te verkrijgen.Vervolgens worden de assays voor geïnvadeerde podia voorbereid met een dunne laag fluorescent gelabelde extracellulaire matrix om degradatie te detecteren. Ten slotte worden de assays gezaaid met kankercellen voor incubatie gedurende één nacht, gevolgd door het fixeren en kleuren van de invader- en podiaplaten, en live-cell imaging van de tractiekrachtplaten. Tot slot wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de invader, de podia en de degradatie van de extracellulaire matrix in beeld te brengen.Hoewel fluorescentie- en wide-field microscopie respectievelijk worden gebruikt om microsferen en cellen in beeld te brengen voor tractiekrachtberekeni

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

We beschrijven de prototypische werkwijze voor het produceren microscoop dekglaasje bedekt met fluorescent gelatine visualiseren invadopodia-gemedieerde matrixafbraak. Rekentechnieken met beschikbare software gepresenteerd voor het kwantificeren van de niveaus van resulterende matrix proteolyse door enkele cellen in een gemengde populatie en voor meercellige groepen omvat gehele microscopische velden.

Kwantitatieve meting van Invadopodia-gemedieerde extracellulaire matrix proteolyse in Single en Meercellige contexten

This video describes the traction force microscopy assay. The assay determines the cellular traction of human colon cancer cells on the extracellular matrix present on soft elastic hydrogel having embedded fluorescent beads. The resultant displacement of fluorescent beads is measured using an appropriate software.

Traction Cytometry Assay: A Method to Quantify Traction Force Exerted by Cancer Cells on ECM

Vaak gebruikt, zijn zeer toegankelijk methoden voor de behandeling van cel migratie en invasie in vitro beschreven. De eerste methode is de cel wondsluiting assay die celmotiliteit meet. De tweede methode is de transwell migratie en invasie assay die de chemotactische en invasieve vermogen van cellen beoordeelt.

In vitro cel-migratie en invasie assays

Ons laboratorium heeft DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels, een dynamisch hydrogel systeem ontwikkeld om de effecten van modulerende weefsels stijfheid op celfunctie beter te begrijpen. Hier bieden we schema's, beschrijvingen en protocollen om deze hydrogels bereiden.

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Er wordt een protocol beschreven om primaire humane cellen te extraheren uit chirurgische colontumor- en normale weefsels. De geïsoleerde cellen worden vervolgens gekweekt op zachte elastische substraten (polyacrylamide-hydrogels) die functioneel zijn gemaakt door een extracellulair matrix-eiwit en ingebed met fluorescente microbeads. Trekcytometrie wordt uitgevoerd om de cellulaire contractiele spanningen te beoordelen.

Isolatie van primaire humane Colon tumorcellen uit Chirurgische weefsels en kweken ze rechtstreeks op zachte elastische substraten voor Traction Cytometry

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Leer polyacrylamidegelen maken voor invadopodia- en tractiekrachttesten op kankercellen. Deze methode analyseert invasieve eigenschappen en mechanische invloeden op kankercelgedrag in matrices met verschillende stijfheden.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Meer video's verkennen