Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in

Het algemene doel van deze procedure is om gistcellen te gebruiken om de biologische processen te vinden die door een chemisch product van belang worden aangesproken. Dit wordt bereikt door eerst het dosisresponsprofiel van een chemisch product voor gist te bepalen. De tweede stap is om een complete verzameling gistgen-knockoutstammen te laten groeien op een sub-dodelijke dosis chemisch product en op een controleplaat.

Vervolgens worden gistmutanten die overgevoelig zijn voor het chemisch product geïdentificeerd. Deze lijst wordt bioinformatica-analytisch onderzocht om alle genen te onthullen die nodig zijn om het chemisch product te verdragen. De laatste stap is om een biologische replica van het experiment uit te voeren met lage doorvoer.

Dit valideert eventuele gevonden interacties tussen chemicaliën en genen. Uiteindelijk wordt deze methode voor chemisch-genetische screening met hoge doorvoer gebruikt om te laten zien welke genproducten en biologische paden worden gebruikt om het chemisch product van belang te verdragen. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals competitief groei van gebarcodeerde mutanten in vloeibare cultuur, is dat er geen moleculaire biologietechnieken nodig zijn.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van chemische biologie, zoals hoe een nieuwe kleine molecuul de groei van eukaryote cellen kan remmen. Om te beginnen, bereidt u een overnacht gistcultuur voor door BY 4 7 4 1 cellen uit te strekken op een A-Y-E-P-D plaat en in te kweken gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius of totdat zichtbare kolonies zijn gevormd. Wanneer de kolonies klaar zijn.

Bereid overnacht vloeibare culturen voor door een enkele kolonie te kiezen en vijf milliliter YEPD vloeibaar media in een steriele vat te inoculeren. Incubeer vervolgens overnacht bij 30 graden Celsius met continue rotatie of schudden. Bereid vervolgens vast agarmedia voor met verschillende doses van het te testen chemisch product.

Om dit te doen. Bereid eerst verschillende stamoplossingen van het chemisch product van belang bij 100 keer de uiteindelijke concentratie in een geschikt oplosmiddel. Bereid vervolgens voor elke te testen concentratie drie milliliter gesmolten YEPD-agar in verschillende steriele kweekbuizen.

Plaats de buizen met de agar in een waterbad van 55 graden Celsius om stollen van de agar te voorkomen. Nu, voor elke concentratie van chemisch product die moet worden getest, zet u de vrijlating van de 100 x verbinding vrij op een aliquot van gesmolten agar tex, de buis gedurende twee tot drie seconden om te mengen en pipet vervolgens één milliliter uit elke buis in duplicaatputjes in een 12 wereldplaat, laat de plaat overnacht bij kamertemperatuur stollen. De volgende dag, inoculeert u 10 milliliter YEPD vloeibaar media met twee microliter van de verzadigde overnacht gistcultuur.

Pipet vervolgens 25 microliter van deze cultuur op de agar die het chemisch product bevat in de putjes van de 12-wereldplaat en verspreid gelijkmatig met behulp van steriele glazen kralen of een steriele staaf. Laat de plaat drogen onder een vlam en incubeer vervolgens de plaat bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur. Na het verstrijken van de incubatietijd, evalueert u het totale aantal en de grootte van de kolonies in de putjes.

Identificeer een sub-dodelijke concentratie van het verbinding die de groei niet meer dan 10 tot 15% remt om in de screening te gebruiken. Houd de mutantenverwijderingssnelheid op een dichtheid van 384 kolonies per plaat door replicatie op 16 YEPD-agarplaten, die 200 microliter per milliliter G vier 18 bevatten. Gebruik een microbieel arraying robotsysteem of handmatig pinninggereedschap om dit elke drie maanden uit te voeren.

Bewaar de platen bij vier graden Celsius totdat ze nodig zijn. Bereid vervolgens 250 milliliter YEPD-agarmedia voor met dezelfde concentratie G vier 18 of vijf agarplaten en laat ze overnacht bij kamertemperatuur op een platte, gelijkmatige ondergrond afkoelen. Verwijder de platen met de verzameld verwijderingsmutant uit de opslag bij vier graden Celsius en laat de platen op kamertemperatuur komen.

Gebruik een delicaat takendoekje om eventuele condensvorming die zich op het deksel van elke plaat heeft gevormd te verwijderen om te voorkomen dat waterdruppels op de array worden afgezet en kruisbesmetting van de array-mutanten. Laat de microbieel array pinning robot de verzameld verwijderingsmutant array condenseren van een dichtheid van 384 kolonies per plaat op 16 petrischalen naar 1.536 kolonies per plaat op vier petrischalen. Na het overnacht incuberen van de array bij 30 graden Celsius, onderzoek de array om een uniforme overdracht van kolonies van de bronplaten te verzekeren.

Er zullen verschillende lege posities in de array zijn opgenomen, die dienen als een gids dat de verzameld verwijderingsmutant array correct is gecondenseerd. Dit zullen de bronplaten zijn die worden gebruikt om te repliceren op media die uw chemisch product van belang bevatten. Een enkele bronplaat kan worden gebruikt voor meerdere pinnings.

Ook hebben veel robots offset-functies die zullen zorgen voor een vergelijkbaar aantal gisten dat elke keer wordt overgebracht. Om de replicaplaat verzameld verwijderingsmutant array reparatie op te zetten, 700 milliliter controle voertuig alleen en experimenteel YEPD-agar bevattend het chemisch product van belang. Dit is voldoende voor het uitvoeren van de test in drievoudig.

Giet de platen met behulp van de controle en experimentele agar. Voeg 50 milliliter toe aan elke plaat. Laat de platen overnacht bij kamertemperatuur afkoelen op een platte, gelijkmatige ondergrond, met behulp van de robot om een plaat te repliceren.

Inoculeer de dubbele mutantenarray op drie sets platen die chemicaliën bevatten in de experimenteel bepaalde concentratie, evenals resets van platen die de voertuigcontrole bevatten. Incubeer de platen op de werktafel bij kamertemperatuur voor een totaal van 24 tot 48 uur afbeelding. De platen worden 24 en 48 uur geïncubeerd door de deksel te verwijderen en de platen met de voorkant naar beneden op een scanner te plaatsen.

Vangen afbeeldingen met een resolutie van minimaal 300 DPI. Gebruik alternatief