Name: Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Ontdek een kosteneffectieve methode voor chemisch-genetische interacties in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek identificeert gevoelige mutanten en onthult essentiële genen voor chemische tolerantie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in de CJN lab wordt ondersteund door exploitatiesubsidies uit NSERC, de Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), en de Canadese Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

OPMERKING: De algemene werkstroom van deze procedure is beschreven in figuur 2. 1. Vaststelling van groei-remmende dosis <ol><li> Voorbereiding van gist overnacht cultuur OPMERKING: De gist-extract-pepton-dextrose groeimedia (YEPD) gebruikt in dit protocol is een standaard recept 13. <ol><li> Streak uit BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) cellen op een YEPD agar plaat en incubeer gedurende 48 uur bij 30 ° C of tot zichtbare kolonies vormen. </li><li> Bereid nachts culturen door het enten van 5 ml YEPD vloeibare media in een steriele cultuur schip met een enkele kolonie. Incubeer overnacht bij 30 ° C onder voortdurend draaien of schudden. De cultuur wordt gewoonlijk bereikt verzadiging van de ochtend (~ 2 x 10 8 cellen / ml). </li></ol></li><li> Solid agarmedia preparaat met wisselende chemische doses <ol><li> Bereid een aantal voorradende chemische stof worden getest bij 100x gewenste eindconcentratie in een geschikt oplosmiddel. OPMERKING: Effectieve concentraties hangt af van de chemische en moet empirisch worden bepaald. Het is daarom aan te raden om eerst te testen een breed uiteindelijke concentratie range; dat wil zeggen, van laag uM tot hoge mM. </li><li> Voor elke concentratie van de chemische stof te testen monster 3 ml gesmolten YEPD agar een enkele steriele cultuur buis. Plaats in de 55 ° C waterbad te houden van het stollen. </li><li> Voor elke concentratie van de chemische stof te testen voeg 30 ul van de 100x verbinding gesmolten media, vortex 2-3 seconden mengen en pipet 1 ml in elk paar duplo putjes in een 12-wells plaat. Zorg ervoor dat u een voertuig behoren alleen controle. Laat platen een nacht op kamertemperatuur is gebracht. Gooi alle extra media. </li></ol></li><li> Spread plating cellen <ol><li> Inoculeer 10 ml YEPD vloeibare media met 2 pi van een verzadigde gistcultuur, overnacht gekweekt zoals in stap 1.1.2. </li><li> Plaat 25 ul van de verwaterde gistcultuur per well, gelijkmatig verdelen met behulp van steriele glazen kralen of staaf, en laat de plaat te drogen onder een vlam. Incubeer plaat bij 30 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Evalueer de groei van gist (zowel totaal aantal en grootte van de kolonies) op de platen. Selecteer een sub-letale concentratie van de verbinding die geen groei remt met meer dan 10% -15% aan het scherm worden. </li></ol></li></ol> 2. Systematische Chemische genetische screen <ol><li> Onderhoud van deletie-mutant-array (DMA) en Voorbereiding Bron Plaat van <ol><li> Voor een gedetailleerde beschrijving op de aanleg van deletie mutant arrays uit glycerol voorraden verwijzen wij u naar Baryshnikova et al. 14. Zodra deletiemutanten werden bekleed met een dichtheid van 384 kolonies per plaat, kan de DMA worden enkele maanden opgeslagen bij 4 ° C. Repliceren op YEPD agar die 200 ug / ml G418 nodig om kolonies voorkomen groeien in elkandere. OPMERKING: meerdere seriële replicaties moet worden vermeden om verlies van langzaam groeiende stammen voorkomen en minimaliseren van de verschijning van suppressor mutanten. Dit is met name relevant als het behoud van de collecties als haploiden. </li><li> Voer alle replica-plating stappen met behulp van een microbiële arraying robotsysteem. Als alternatief, te manipuleren getooid kolonies met behulp van handmatige pinning gereedschappen. OPMERKING: De gist deletie collectie is verkrijgbaar haploïden en diploïde van verschillende commerciële bronnen en wordt gewoonlijk geleverd als glycerol voorraden in 96-well platen. </li></ol></li><li> Condenseren van de deletie mutant-array <ol><li> Maak 250 ml YEPD agar medium dat 200 ug / ml G418. De effectieve concentratie van G418 kan variëren en elke partij moet empirisch worden getest. </li><li> Bereid vijf YEPD agarplaten door gieten 50 ml YEPD agar die 200 ug / ml G418 per plaat. Doe dit een dag voor het condenseren van de array en laat de platen afkoelen bij kamertemperatuurerature overnachting op een plat vlak oppervlak. OPMERKING: Vier platen nodig zal zijn voor de collectie van 1536-stam dichtheid, is de vijfde plaat gegoten als een extra. </li><li> Verwijder de 16 platen met de deletie mutant collectie bij een dichtheid van 384 kolonies per plaat en de kamertemperatuur (~ 1 uur) komen. </li><li> Veeg condens die gevormd op het deksel van elke plaat met een delicate taak vegen. Als u dit niet doet, kunnen er waterdruppels worden afgezet op de array en kruisbesmetting van gekleed mutanten. </li><li> Met behulp van een microbiële scala pinning robot, condenseren de DMA uit een dichtheid van 384 kolonies per plaat (16 petrischaaltjes) tot 1536 kolonies per plaat (4 petrischaaltjes). Voer deze zodat de 1 ste kolonie plaat 1 kunnen tot 1 kolom 1 van de gecondenseerde matrix rij, de 1e kolonie plaat 2 tot 1 kolom 2, de 1e kolonie plaat 3 naar rij 2 en kolom 1, rij, en de 1 ste kolonie plaat 4 tot rij 2kolom 2. </li><li> Incubeer de geconsolideerde matrix bij 30 ° C geïncubeerd. </li><li> Onderzoek de array om uniforme overdracht van kolonies van bron platen zorgen. Er zullen verschillende lege posities, met opzet in de matrix opgenomen, die als leidraad dienen om ervoor te zorgen de DMA is gecondenseerd correct (figuur 4A). Opmerking: Dit zijn de bron platen voor replica plating op medium met de testverbinding. Een enkele bron plaat kan worden gebruikt voor meerdere pinnings. Ook veel robots zullen hebben een compenserende functie, die zal zorgen voor vergelijkbare aantallen van gist worden telkens overgedragen. </li></ol></li><li> Replica plaat deletie mutant-array <ol><li> Bereid 700 ml controle (voertuig alleen) en 700 ml van experimentele media (-chemische stof). Dit is voldoende voor het uitvoeren van de assay in drievoud (12 platen per toestand, plus twee extra). </li><li> Giet 50 ml YEPD agar met teststof of de controle per plaat. Laat de platen to afkoelen bij kamertemperatuur op een vlak en gelijkmatig oppervlak. </li><li> De robot replica plaat beënt de DMA op drie sets van platen met chemicaliën de experimenteel bepaalde concentratie, en drie sets van platen met de dragercontrole. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 24-48 uur. </li></ol></li></ol> 3. Imaging Platen en Data Analyse <ol><li> Verwijder platen uit incubator en laat ze op kamertemperatuur (~ 1 uur) voorafgaand aan de beeldvorming te komen. Dit voorkomt condensvorming, terwijl de beeldvorming van de platen. </li><li> Afbeelding platen bij 24 en 48 uur door het verwijderen van het deksel en het gezicht naar beneden op een flat bed scanner. Maak foto&#39;s met een resolutie van minimaal 300 dpi. U kunt ook gebruik maken van een digitale camera om beelden vast te leggen. Als dit te doen, plaats platen open op een donkere achtergrond en verwijder de deksels op de foto. OPMERKING: De bestandsformaat en positionering van de platen zal afhangen van de kwantificering gebruikte programma. </li&gt; <li> Voeren kwantificering en vergelijking van array-kolonie maten met behulp van een van de verschillende open source-programma&#39;s, waaronder Balony 15, SGAtools 16, en ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validatie van het Scherm OPMERKING: In dit stadium meerdere gist schrappingen mutanten als overgevoelig zijn voor de chemische belangstelling zal scoren. Deze chemische-genetische interacties Vervolgens moet worden gevalideerd op twee manieren. Eerst de identiteit van gevoelige stammen moeten worden bevestigd door PCR. Ten tweede moeten chemische gevoeligheid onafhankelijk worden gescoord. Hieronder volgt een overzicht is een kort protocol voor het uitvoeren van het spotten van assays om spanning overgevoeligheid, een techniek die veel voor in gist biologie valideren. <ol><li> Streak uit gewenste (overgevoelig) mutanten uit de gist verwijdering collectie op YEPD agar met 200 ug / ml G418. Incubeer bij 30 ° C tot kolonies vormen. Controleer het genotype van de stam met diagnostische PCR met primers volgensprotocol van de fabrikant. </li><li> Inoculeer 5 ml YEPD vloeistof voor elke stam en incubeer overnacht bij 30 ° C met rotatie of schudden. </li><li> Meet OD 600 en vul elke stam aan OD 600 = 1 in steriele dH 2 O. Dit zijn nu de genormaliseerde gistkweken. </li><li> Breng 100 pi van genormaliseerde wild-type gist (BY4741) cultuur en A1 van een 96-wells plaat. Doseer 100 ul van maximaal zeven extra onder druk te putten B1-H1. </li><li> Gebruik een multichannel pipet 90 ul steriele dH 2 O afzien putjes A2-H2 door A6-H6. Tot slot, bereiden een reeks van 1:10 verdunningen van genormaliseerde gistculturen. Begin met serieel pipetteren 10 pl kolom 1 tot kolom 2 met een multichannel pipet, en verder over de 96-well plaat tot zes verdunningen gemaakt (bijvoorbeeld, 10 0 tot 10 -5). </li><li> Transfer 2-5 pi van verdunde gist culturen in een raster met een multichannelpipet op YEPD vaste media die chemische en controle over het voertuig. Incubeer de platen bij de geschikte temperatuur gedurende 24-48 uur. </li><li> Inspecteer platen en vergelijkt de gevoeligheid van geselecteerde mutanten chemische (ten opzichte BY4741 controle). Afbeelding platen 24 en 48 uur zoals in stap 3.2. OPMERKING: Terwijl de identificatie van verschillende overgevoelig stammen met bijbehorende gen ontologieën of functies leent het vertrouwen om de geldigheid van het scherm, transformatie van een overgevoelig verwijdering stam met een plasmide met een wild-type kopie van het gen is vereist om formeel vast te stellen dat een gen verwijdering van belang (en niet verborgen tweede plaats mutaties) veroorzaakt drug gevoeligheid. </li></ol>

<ol><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30(2010).</li>
<li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li>
<li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+In+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+%28SGA%29+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li>
<li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balony%3A+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).</li>
<li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SGAtools%3A+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li>
<li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScreenMill%3A+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement%2C+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).</li>
<li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil%3A+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li>
<li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth%3A+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li>
<li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunSpec%3A+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li>
<li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology+annotations+at+SGD%3A+new+data+sources+and+annotation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li>
<li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleosome+function%3A+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier geschetst is een aanpak voor het genereren van chemisch-genetische interactie profielen. De werkwijze is eenvoudig: bij het vergelijken kolonie groottes van elke stam in uitgebreide gendeletie collecties in de aanwezigheid en afwezigheid van een chemische stof, worden alle genen nodig om een ​​chemische insult tolereren geïdentificeerd. Annotatie verrijking analyse van de resulterende lijst van gevoelige stammen kunnen vervolgens worden gebruikt om inzicht in een chemische werkingswijze. Hoewel dit protocol is geop...

De genetische instrumenten en middelen die beschikbaar zijn in het model organisme Saccharomyces cerevisiae hebben grootschalige functionele genomica studies die gezamenlijk zorgen voor nieuw inzicht in hoe genen functioneren als netwerken om aan de eisen van biologische systemen voldoen ingeschakeld. De hoeksteen van deze tools was het collectief creëren van een complete set van niet-essentiële gendeleties van alle open reading frames in gist 1,2. Een opvallende observatie was dat slechts ~ 20% gist genen vereist voor levensvatbaarheid wanneer gegroeid haploïden onder standaard laboratoriumomstandigheden. Dit wijst op het vermogen van een cel buffer tegen genomische verstoringen door het gebruik van alternatieve biologische routes. Genetische mutanten die levensvatbaar zijn individueel, maar dodelijk in combinatie, signaleren aangesloten of convergente parallel biologische pathways en vormen genetische interactie netwerken die biologische functie te beschrijven. Met de ontwikkeling van conditionele temperature-gevoelige en hypomorphic allelen van essentiële genen technologie is niet beperkt tot de studie van niet-essentiële genen 3,4. Dit concept is toegepast op genomisch schaal produceren van een zuivere genetische interactie kaart illustreert hoe genen betrokken bij soortgelijke cellulaire processen cluster samen 5. Chemische verstoringen van genetische netwerken nabootsen gen deleties (figuur 1) 6. Opvragen groeiremmende verbindingen tegen een array met hoge dichtheid van deletie stammen voor overgevoeligheid wordt een chemisch-genetische interactie profiel, bijvoorbeeld een lijst van genen die nodig is om chemische belasting verdragen. Zoals genetische interacties grote schermen van chemische bibliotheken hebben aangetoond dat verbindingen met een soortgelijk werkingsmechanisme cluster samen 7. Daarom is door de oprichting van de chemische-genetische interactie profiel van een verbinding het werkingsmechanisme kan worden afgeleid door het te vergelijken met de LARge-schaal synthetische genetische en chemische genetische interactie datasets 8,9. Zijn op grote schaal chemische-genetische screens, waar scores van verbindingen worden ondervraagd, uitgevoerd door barcode competitie assays. In deze benadering wordt de gepoolde verzameling van deletie stammen gekweekt massaal meerdere generaties in een kleine hoeveelheid medium met een chemische stof. Aangezien elke deletie mutant herbergt een unieke genetische barcode, wordt de levensvatbaarheid / groei van individuele mutanten binnen de pool van deletiestammen bijgehouden door microarray of high-throughput sequencing 10. Afleiden van fitness door het monitoren kolonie grootte van fysiek gekleed mutanten gegroeid op vaste agar dat een bioactieve verbinding is ook een effectieve methode om de chemische-genetische interacties 11,12 identificeren. Deze benadering verschaft een kosteneffectief alternatief voor concurrentie gebaseerde screening en is zeer geschikt voor het testen van kleine bibliotheken van chemische stoffen.Hier geschetst is een eenvoudige methode voor het produceren van een lijst van chemisch-genetische interacties in S. cerevisiae die niet afhankelijk moleculaire biologie manipulaties of infrastructuur. Het vereist slechts een gist deletie verzameling, een robot of handmatig pinning apparaten en vrij beschikbare beeldanalyse software.

<table><tbody><tr><td>Gist Extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Voor YEPD vloeibaar/vast media tot 1% eindconcentratie (w/v) toevoegen</td></tr><tr><td>Tyrptone Poeder</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>Voor YEPD vloeibaar/vast media tot 2% eindconcentratie (w/v) toevoegen</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>Voor YEPD vloeibaar/vast media tot 2% eindconcentratie (w/v) &#8212; niet autoclaveren. Bereid 20% stockoplossing, filter steriliseren, en voeg toe aan media na autoclavering.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>Voor YEPD vast media tot 2% eindconcentratie (w/v) toevoegen</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Bereid 1.000x stock bij 200&nbsp;mg/ml in dH2O en filter steriliseren.&nbsp;</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml kweekbuisjes</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>high-throughput microbiële array pinning robot</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; Petri Dish</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Doos van 200 schalen</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Doos van 1.000 pads</td></tr><tr><td>1536 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Doos van 1.000 pads</td></tr><tr><td colspan="4">Alternatieve Pinning Tools:</td></tr><tr><td>Volledig Geautomatiseerde Robtische Systemen</td><td>S&amp;P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Verschillende geautomatiseerde kolonie-afhandeling robtische en imagineringssystemen beschikbaar.</td></tr><tr><td>Handmatige Pinning Tools</td><td>V&amp;P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Handbediende replicatietools en accessoires.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

snelle identificatie van chemische genetische interacties in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Het bepalen van het werkingsmechanisme van bioactieve stoffen is van belang om een breed scala van academische, farmaceutische en industriële wetenschappers. Saccharomyces cerevisiae, of gist is een modeleukaryoot waarvoor een complete collectie van ~ 6000 gendeletie mutanten en hypomorfe essentieel gen mutanten zijn commercieel verkrijgbaar. Deze verzamelingen van mutanten kan gebruikt worden om systematisch detecteren chemische geninteracties, dwz genen noodzakelijk een chemische tolereren. Deze gegevens zijn beurt verslagen over de waarschijnlijke werkingsmechanisme van de verbinding. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle identificatie van chemische-genetische interacties in gist. We demonstreren de werkwijze met het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU), die een goed gedefinieerde werkingsmechanisme heeft. Onze resultaten tonen dat de nucleaire TRAMP exosome RNA en DNA repair enzymen zijn nodig voor proliferatie in de aanwezigheid van 5-FU, hetgeen in overeenstemming met eerdere microarray gebaseerd barcoderingssysteem chemische genetische benaderingen en de wetenschap dat 5-FU negatieve invloed op zowel RNA en DNA-metabolisme. De vereiste valideringsprotocols deze high-throughput schermen worden ook beschreven.

Als validatie van deze benadering hebben we een representatieve chemische genetische interactie scherm van het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU) na bovengenoemde protocol. 5-FU is bekend thymidylaatsynthase en DNA- en RNA-metabolisme 18 verstoren. De chemische genetische interacties van 5-FU zijn goed bestudeerd en zijn onderzocht door gist barcode microarray-technieken met behulp van zowel heterozygote en homozygote deletie collecties 8,19. Hier laten we zien dat soortgelijke result...

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Het algemene doel van deze procedure is om gistcellen te gebruiken om de biologische processen te vinden die door een chemisch product van belang worden aangesproken. Dit wordt bereikt door eerst het dosisresponsprofiel van een chemisch product voor gist te bepalen. De tweede stap is om een complete verzameling gistgen-knockoutstammen te laten groeien op een sub-dodelijke dosis chemisch product en op een controleplaat.Vervolgens worden gistmutanten die overgevoelig zijn voor het chemisch product geïdentificeerd. Deze lijst wordt bioinformatica-analytisch onderzocht om alle genen te onthullen die nodig zijn om het chemisch product te verdragen. De laatste stap is om een biologische replica van het experiment uit te voeren met lage doorvoer.Dit valideert eventuele gevonden interacties tussen chemicaliën en genen. Uiteindelijk wordt deze methode voor chemisch-genetische screening met hoge doorvoer gebruikt om te laten zien welke genproducten en biologische paden worden gebruikt om het chemisch product van belang te verdragen. Het grote voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals competitief groei van gebarcodeerde mutanten in vloeibare cultuur, is dat er geen moleculaire biologietechnieken nodig zijn.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van chemische biologie, zoals hoe een nieuwe kleine molecuul de groei van eukaryote cellen kan remmen. Om te beginnen, bereidt u een overnacht gistcultuur voor door BY 4 7 4 1 cellen uit te strekken op een A-Y-E-P-D plaat en in te kweken gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius of totdat zichtbare kolonies zijn gevormd. Wanneer de kolonies klaar zijn.Bereid overnacht vloeibare culturen voor door een enkele kolonie te kiezen en vijf milliliter YEPD vloeibaar media in een steriele vat te inoculeren. Incubeer vervolgens overnacht bij 30 graden Celsius met continue rotatie of schudden. Bereid vervolgens vast agarmedia voor met verschillende doses van het te testen chemisch product.Om dit te doen. Bereid eerst verschillende stamoplossingen van het chemisch product van belang bij 100 keer de uiteindelijke concentratie in een geschikt oplosmiddel. Bereid vervolgens voor elke te testen concentratie drie milliliter gesmolten YEPD-agar in verschillende steriele kweekbuizen.Plaats de buizen met de agar in een waterbad van 55 graden Celsius om stollen van de agar te voorkomen. Nu, voor elke concentratie van chemisch product die moet worden getest, zet u de vrijlating van de 100 x verbinding vrij op een aliquot van gesmolten agar tex, de buis gedurende twee tot drie seconden om te mengen en pipet vervolgens één milliliter uit elke buis in duplicaatputjes in een 12 wereldplaat, laat de plaat overnacht bij kamertemperatuur stollen. De volgende dag, inoculeert u 10 milliliter YEPD vloeibaar media met twee microliter van de verzadigde overnacht gistcultuur.Pipet vervolgens 25 microliter van deze cultuur op de agar die het chemisch product bevat in de putjes van de 12-wereldplaat en verspreid gelijkmatig met behulp van steriele glazen kralen of een steriele staaf. Laat de plaat drogen onder een vlam en incubeer vervolgens de plaat bij 30 graden Celsius gedurende 48 uur. Na het verstrijken van de incubatietijd, evalueert u het totale aantal en de grootte van de kolonies in de putjes.Identificeer een sub-dodelijke concentratie van het verbinding die de groei niet meer dan 10 tot 15% remt om in de screening te gebruiken. Houd de mutantenverwijderingssnelheid op een dichtheid van 384 kolonies per plaat door replicatie op 16 YEPD-agarplaten, die 200 microliter per milliliter G vier 18 bevatten. Gebruik een microbieel arraying robotsysteem of handmatig pinninggereedschap om dit elke drie maanden uit te voeren.Bewaar de platen bij vier graden Celsius totdat ze nodig zijn. Bereid vervolgens 250 milliliter YEPD-agarmedia voor met dezelfde concentratie G vier 18 of vijf agarplaten en laat ze overnacht bij kamertemperatuur op een platte, gelijkmatige ondergrond afkoelen. Verwijder de platen met de verzameld verwijderingsmutant uit de opslag bij vier graden Celsius en laat de platen op kamertemperatuur komen.Gebruik een delicaat takendoekje om eventuele condensvorming die zich op het deksel van elke plaat heeft gevormd te verwijderen om te voorkomen dat waterdruppels op de array worden afgezet en kruisbesmetting van de array-mutanten. Laat de microbieel array pinning robot de verzameld verwijderingsmutant array condenseren van een dichtheid van 384 kolonies per plaat op 16 petrischalen naar 1.536 kolonies per plaat op vier petrischalen. Na het overnacht incuberen van de array bij 30 graden Celsius, onderzoek de array om een uniforme overdracht van kolonies van de bronplaten te verzekeren.Er zullen verschillende lege posities in de array zijn opgenomen, die dienen als een gids dat de verzameld verwijderingsmutant array correct is gecondenseerd. Dit zullen de bronplaten zijn die worden gebruikt om te repliceren op media die uw chemisch product van belang bevatten. Een enkele bronplaat kan worden gebruikt voor meerdere pinnings.Ook hebben veel robots offset-functies die zullen zorgen voor een vergelijkbaar aantal gisten dat elke keer wordt overgebracht. Om de replicaplaat verzameld verwijderingsmutant array reparatie op te zetten, 700 milliliter controle voertuig alleen en experimenteel YEPD-agar bevattend het chemisch product van belang. Dit is voldoende voor het uitvoeren van de test in drievoudig.Giet de platen met behulp van de controle en experimentele agar. Voeg 50 milliliter toe aan elke plaat. Laat de platen overnacht bij kamertemperatuur afkoelen op een platte, gelijkmatige ondergrond, met behulp van de robot om een plaat te repliceren.Inoculeer de dubbele mutantenarray op drie sets platen die chemicaliën bevatten in de experimenteel bepaalde concentratie, evenals resets van platen die de voertuigcontrole bevatten. Incubeer de platen op de werktafel bij kamertemperatuur voor een totaal van 24 tot 48 uur afbeelding. De platen worden 24 en 48 uur geïncubeerd door de deksel te verwijderen en de platen met de voorkant naar beneden op een scanner te plaatsen.Vangen afbeeldingen met een resolutie van minimaal 300 DPI. Gebruik alternatief

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

In this video, we demonstrate the modified yeast one-hybrid assay, which detects multiple proteins interacting with target DNA. The transformed yeast cells contain the target DNA sequence upstream of the reporter gene. Additionally, they express transcription factor proteins. When the proteins form complexes and bind to the target DNA, the reporter gene is expressed and can be detected enzymatically.

Modified Yeast-One Hybrid Assay to Detect Heteromeric Protein Complex-DNA Interactions

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Wederzijdse hemizygosity via sequencing (RH-SEQ) is een krachtige nieuwe methode om de genetische basis van een eigenschap verschil tussen soorten in kaart te worden. Pools van hemizygotes worden gegenereerd door transposon mutagenese en hun fitheid wordt bijgehouden door concurrerende groei met behulp van High-through sequencing. Analyse van de resulterende gegevens wijst genen aan die aan de eigenschap ten grondslag liggen.

Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Om chaperonne-chaperonne- en chaperonne-substraatinteracties te bestuderen, voeren we synthetische interactiescreenings uit in Caenorhabditis elegans met behulp van RNA-interferentie in combinatie met milde mutaties of overexpressie van chaperonnes en monitoren we weefselspecifieke eiwitdisfunctie op organismaal niveau.

Caenorhabditis elegans gebruiken om te screenen op weefselspecifieke chaperonne-interacties

Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), een glycerol gradiënt centrifugatie in de aanwezigheid van een crosslinker, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex.

Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen

Dit werk beschrijft een protocol voor een multicopy suppressor genetische screening in Schizosaccharomyces pombe. Dit scherm maakt gebruik van een genoombrede plasmidebibliotheek om suppressorkloon (en) van een functieverliesfenotype geassocieerd met een querymutantenstam te identificeren. Nieuwe genetische onderdrukkers van de ell1 null-mutant werden geïdentificeerd met behulp van dit scherm.

Genetische screening voor identificatie van multicopy suppressors in Schizosaccharomyces pombe

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Ontdek een kosteneffectieve methode voor chemisch-genetische interacties in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek identificeert gevoelige mutanten en onthult essentiële genen voor chemische tolerantie.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in

Meer video's verkennen