Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

Hallo, mijn naam is Helen Kuster en ik werk bij de cardiovasculaire onderzoeksgroep van Dr. Harold en professor aan de Auto Vica Universiteit in MacBook. We zijn geïnteresseerd in de isolatie en karakterisering van mariene monocyten om deze te gebruiken voor voertuigen bij het groeien van zijvaatjes. De volgende belangrijke stappen zijn nodig voor de cultivatie van beenmerg-afgeleide monocyten, ten eerste muizenanesthesie en cervicale dislocatie, ten tweede extractie en spoelen van het dijbeen.

Ten derde filteren van het beenmerg. Ten vierde wasstappen met medium vijfde, cultivatie van de cellen op ultralage aanhechtingsplaten. Zesde flowcytometrie.

Om monocyten uit het beenmerg te extraheren, wordt de muis verdoofd met ISO-fluorine en geëuthanaseerd door cervicale dislocatie. De muis wordt gefixeerd en beide onderste ledematen worden gescheiden met een steriele scalpel. Zowel het dijbeen als het scheenbeen worden geoogst en minimaal 90 seconden met 96% Ethan-ethanol gewassen.

Daarna moeten alle stappen strikt sterieel zijn om besmetting te voorkomen. Spieren of pezen worden van het bot verwijderd. Dijbeen en scheenbeen worden meerdere keren met warm PBS gespoeld.

Voor het oogsten van beenmerg worden de proximale en distale uiteinden van elk bot gesneden met een paar fijne schaar. Om het bot te spoelen, hebben we een steriele 28 G-naald, een milliliter-spuit en tussen de 10 en 15 milliliter medium per bot nodig. Daarna wordt het beenmerg door een 70 micrometer S gefilterd terwijl het bot met een fijne pincet wordt vastgehouden.

Spoil de botten een voor een totdat ze illusie worden. Om celstress te minimaliseren, oefen voorzichtig druk uit op de stempel van de spuit. Spoel de site met PBS.

Daarna worden de cellen gecentrifugeerd bij 250 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. En worden opnieuw gesuspendeerd met medium? Na deze stap herhaalt u de stap nog eens.

Voor beenmerg-afgeleide monocyten uit nat beenmerg gebruiken we M 199 met 1% penicilline en streptomycine en 10% foetaal hoestserum. Bovendien voegen we 20 nanogram per milliliter INE MCSF toe op de eerste dag. Acht nanogram per milliliter interfer gamma wordt op de laatste cultuurdag toegevoegd aan het medium.

Als MHC twee upregulatie gewenst is, worden de cellen gezaaid in ultralage aanhechtingsplaten met dikke putjes om permanente hechting op de bodem te voorkomen. We gebruiken een concentratie van één keer 10 tot de zes cellen per milliliter met maximaal zes milliliter per putje. De kweekperiode is vijf dagen bij een temperatuur van 37 graden en 5% koolstofdioxide.

De cellen worden dagelijks gecontroleerd na vijf dagen tussen 60 tot 80% van de cellen zijn monocyten. Mijn naam is Martin Bachner en ik ben een medisch doctoraal student hier bij Auto Fungi Universiteit in de afdeling Cardiologie, analogie en chronologie. En wanneer je de intraveneuze injectie doet, is het belangrijk om veel te oefenen voordat je het doet, anders zul je de monocyten niet op een adequate manier kunnen toepassen.

Experimenten hebben aangetoond dat monocyten het meest effectief zijn bij het verbeteren van art agenese wanneer ze systemisch worden toegediend. Een veelvoorkomende manier van systemische geneesmiddeltoediening is een staart WA-injectie. In ons geval injecteren we 2,5 miljoen monocyten, die worden geresuspendeerd en natriumchloride.

Er zijn vier vaten in de staart van de muis, aan de ventrale en dorsale kant, en twee wanen aan de laterale kant. Dus voor WA-injectie moeten we de staart ongeveer 90 graden draaien. Voor een gemakkelijkere procedure moet de muis worden opgewarmd met behulp van een verwarmingskussen gedurende ongeveer 10 minuten.

De dieren moeten worden waargenomen door opwarming. Dit is belangrijk om tekenen van oververhitting te herkennen. Bovendien hebben we deze infectie-agent nodig en een 30-gen-naaldset op een insulinespuiten van één milliliter.

Fixeer het dier voorzichtig in een houder, wat het veel gemakkelijker maakt om in de staart te injecteren. Zorg ervoor dat de muis voldoende ruimte heeft om te ademen voordat u de oplossing in de spuit laadt. Vortex, de monocytenoplossing om ervoor te zorgen dat alle monocyten kunnen worden geïnjecteerd.

Desinfecteer de injectieplaats om infectie te voorkomen, pak de staart tussen uw duim en wijsvinger. Op het meest distale punt wordt de naald in een vlakke hoek ingebracht. Als het in de ader wordt geplaatst, is het heel gemakkelijk om de monocytenoplossing te injecteren.

Als er een blaar is, is dit een teken van een verkeerde injectie. Je moet onmiddellijk stoppen en het opnieuw proberen. Proximaal, probeer altijd langzaam te injecteren en niet meer dan vijf microliter per gram.

Als de injectie succesvol was, stopt u het bloeden op de injectieplaats door ongeveer een minuut lang zachtjes te drukken. Aan het einde van de procedure opent u de retractor en plaatst u de muis in zijn kooi om monocyten te karakteriseren. We gebruiken de effecten met een combinatie van antigenen, namelijk CD 11 B, F vier 80, CD 115 en GL een.

De expressie van deze antigenen correleert met een ontwikkelingsstadium voor het analyseren van de monocyten. We deden de feiten op dag 0, 3, 5 en zeven, de monocytenzuiverheid neemt toe tot 90% op dag vijf. Om die zuiverheid te bereiken, is het belangrijk om sterk terrine macrofaag te verminderen.

Non terrine-cellen worden verminderd door gebruik te maken van EDTA-vrije wasbuffer. Om terrine-cellen te verminderen, gebruiken we EDTA-bevattend was, buffer en voorzichtig p petting. Dit diagram toont de belangrijkste celtypen voor hun een-einde kweek.

De verschillende celtypen die worden getoond, zijn een lymfocyten, twee monocyten, drie granulocyten, toenemende monocytenzuiverheid na dag vijf. En kweek. Let op, de veranderende cellulaire samenstelling tijdens de kweekcelpopulatie omvat een monocyten en twee macrofagen.

Figuur twee, tijdlijn van CD 115-expressie tijdens differentiatie. Merk op dat meer dan 95% van alle cellen CD 115-positief is na vi