Methoden om Evalueer Cytotoxiciteit en Immuunsuppressie van brandbare Rookwaren Voorbereidingen
10 januari 2015
Met behulp van geoptimaliseerde humane perifere bloedmononucleaire cel (PBMC) ex vivo assays, hebben we aangetoond dat een bereiding van een brandbaar tabaksproduct de door receptoren gemedieerde intracellulair uitgescheiden cytokinen en de cytolytische capaciteit van effector PBMC's duidelijk onderdrukt. Deze snelle assays kunnen nuttig zijn bij de evaluatie van producten en het begrijpen van de mogelijke langetermijneffecten van blootstelling aan tabak.
Het algemene doel van deze procedure is om de effecten van de bereiding van tabaksproducten op de cytokinesecretie en het doden van doelcellen door P BMC's te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst gekweekte P BMC's te behandelen met volledige rookconditie, medium of nicotine, en vervolgens wordt intracellulaire kleuring van de behandelde p BMC's uitgevoerd om hun cytokineproductie te bepalen. Als alternatief worden CFSE-gelabelde K 5 62-cellen gecocultiveerd met PBMC-effectorcellen die zijn behandeld met volledige rookgeconditioneerd medium en de levensvatbaarheid van de K 5 62-cellen wordt gekwalificeerd door zeven A a d-kleuring.
Uiteindelijk worden de effecten van de bereidingen van brandbare tabaksproducten op de P BMC's uit beide assays gemeten door middel van flowcytometrie. De belangrijkste voordelen van onze technieken of de bestaande methoden, zoals chromiumrelease-assay of ALI-spot, zijn dat onze methoden hoog doorvoerbaar, niet-radioactief zijn en dat we de celfunctionaliteit kunnen meten. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de biologische effecten van tabaksproductbereiding.
Het kan ook worden toegepast op de evaluatie van andere verbindingen die invloed hebben op de tolike receptor-gemedieerde en STIC-functies van PBMC-effectorcellen Voordat u begint met de kleuringsprocedure. Verdun de volledige rookconditie, het medium en nicotine bij de vermelde concentraties. In RPMI compleet medium tot een totaal volume van 100 microliter per putje in een 96-wellplaat.
Voeg vervolgens 100 microliter P BMC's toe, gesuspendeerd in compleet medium met een concentratie van een keer 10 tot de zes cellen per putje voor een totaal volume van 200 microliter per putje. Bedek vervolgens de plaat en incubeer deze bij 37 graden Celsius en 5%CO2. Na drie uur, was de cellen en zuig het supernatant af.
Bedek vervolgens de plaat opnieuw en vortex deze om de pellets te dissociëren. Was de cellen nog twee keer, eenmaal in ijskoud loopbuffer en eenmaal in compleet medium na de tweede wasbeurt. Behandel ze met 200 microliter per putje van compleet medium aangevuld met Golgi-plug en LPS gedurende zes uur bij 37 graden Celsius en 5%CO2.
Was vervolgens de cellen met ijskoud loopbuffer en behandel ze met 100 microliter cytofix per putje bij vier graden Celsius na 20 minuten, was de cellen drie keer met ijskoud perm-wash. Voeg vervolgens 45 microliter cytoperm toe aan elke put en vervolgens vijf microliter van elk van de vermelde antilichamen. Na 30 minuten bij vier graden Celsius, was de cellen drie keer en fixeer ze in 200 microliter ijskoud 2% para formaldehyde.
Breng vervolgens de cellen over in 12 bij 75 millimeter buisjes en analyseer de monsters op een flowcytometer. Nadat u een plaat met tabaksproductbehandelde pbmc hebt voorbereid zoals zojuist is aangetoond, was een kweek van K 5 62-cellen, geoogst bij een 80% co fluency in 10 milliliter DPBS.Resus. Suspen de pellet in vijf milliliter DPBS en tel de cellen.
Voeg vervolgens een milliliter vers bereide CFSE-werkoplossing toe aan een tot twee keer 10 tot de zevende K 5 62-cellen in een milliliter compleet medium en verspreid de celkleurstof door te vortexen. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur na precies twee minuten, voeg 200 microliter FBS toe en vortex de cellen opnieuw, waarbij ze nog eens twee minuten worden bewaard. Na de tweede incubatie, was de cellen in 10 milliliter compleet medium, suspendeer vervolgens de pellet in nog eens 10 milliliter compleet medium en tel de cellen.
Centrifugeer nu de tabaksbehandelde p BMC's en giet het supernatant af. Vervolgens vervangt u het deksel, suspendeert u de cellen door te vortexen en wast u ze in 200 microliter compleet medium per putje. Om de doodsassay te starten, voegt u de CFSE-gelabelde K 5 62-cellen toe aan de pbmc in een verhouding van een op vijftien en incubeer de co-cultuur bij 37 graden Celsius en 5%CO2.
Na vijf uur, draai de cellen naar beneden en gooi het supernatant weg. Suspen de pellets door te vortexen en was vervolgens de cellen met 200 microliter loopbuffer per putje, voeg vervolgens 95 microliter loopbuffer toe, gevolgd door vijf microliter van zeven A a d voor een totaal volume van 100 microliter per putje. Eindelijk incubeer de cellen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
Voeg vervolgens 100 microliter loopbuffer toe aan elke put en breng het volledige volume over naar de juiste corresponderende faxbuizen om het percentage zeven a a D en CFSE-positieve cellen te bepalen. Door flowcytometrische analyse wordt een dosisafhankelijke toename in celdood waargenomen met volledig rookgeconditioneerd medium bij 24 uur met bijna 80%van de cellen dood bij vier microgram per milliliter equin nicotine-eenheden. Echter, behandeling van de p BMC's gedurende slechts drie uur resulteert niet in een significante toxiciteit, zelfs bij vijf microgram per milliliter equin nicotine-eenheden van volledig rookgeconditioneerd medium bij 24 uur.
Een vergelijkbaar graad van celdood wordt niet opgemerkt vóór behandeling met 3000 microgram per milliliter nicotine na drie uur, nicotinebehandeling veroorzaakt geen meetbare celdood vóór de 2000 microgram per milliliter concentratiebehandeling met volledige rookconditie, medium en nicotine, gevolgd door stimulatie van de TLR vier receptor door LPS resulteert in een dosisafhankelijke afname van uitgescheiden cytokinen. Hoewel de mate van onderdrukking varieert tussen de individuele cytokinen. Verder, wanneer cellen slechts zes uur worden behandeld met LPS en Golgi-plug, wordt een afname in het aantal intracellulaire cytokine-positieve cellen waargenomen na blootstelling aan volledig rookgeconditioneerd medium, zelfs bij de lagere equin nicotine-eenheidconcentraties vergeleken met nicotineblootstelling.
Inderdaad, de resultaten van deze doodsassay illustreren dat blootstelling aan 1,56 microgram per milliliter volledig rookgeconditioneerd medium de doodscapaciteit van de effector PBMC-populatie significant vermindert in vergelijking met de controle en de lagere dosisconcentraties. Terwijl nicotinebehandeling bij hoge of lage concentraties de doodscapaciteit van de effector PBMC-populatie niet verstoort. Bij het uitvoeren van deze procedures
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie evalueert de effecten van preparaten van brandbare tabaksproducten op de cytokinesecretie en het doden van doelcellen door mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC's) van mensen. Met behulp van geoptimaliseerde ex vivo assays belicht het onderzoek de impact van blootstelling aan tabak op de functionaliteit van immuuncellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Tabaksonderzoek
- Celbiologie
Achtergrond
- PBMCs spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Tabaksproducten kunnen schadelijke effecten hebben op de functie van immuuncellen.
- Het begrijpen van deze effecten is essentieel voor de evaluatie van tabaksproducten.
- Bestaande methoden voor het beoordelen van de celfunctionaliteit kennen beperkingen.
Doel van de studie
- Om de impact van tabaksproductbereidingen op de cytokineproductie van PBMC's te beoordelen.
- Om het cytolytisch vermogen van PBMC's tegen doelcellen te evalueren.
- Om inzicht te verschaffen in de biologische effecten van blootstelling aan tabak.
Gebruikte methoden
- Behandeling van gekweekte PBMCs met medium geconditioneerd met rook of nicotine.
- Intracellulaire kleuring om de cytokineproductie te meten.
- Co-cultuur van met CFSE gelabelde K562-cellen met behandelde PBMCs.
- Flowcytometrie om de celfunctionaliteit en levensvatbaarheid te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Preparaten van brandbare tabaksproducten onderdrukken de cytokinesecretie aanzienlijk.
- Effector-PBMC's vertonen een verminderde cytolytische activiteit tegen doelcellen.
- De assays maken gebruik van high-throughput en niet-radioactieve methoden.
- De resultaten bieden waardevolle inzichten in de effecten van tabak op immuuncellen.
Conclusies
- Geoptimaliseerde PBMC-assays zijn effectief voor het evalueren van de effecten van tabaksproducten.
- De bevindingen benadrukken het immunosuppressieve potentieel van blootstelling aan tabak.
- Verder onderzoek is nodig om de langetermijngevolgen te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze methode stelt biofarmaceutische R&D in staat om de immunosuppressieve effecten van preparaten van brandbare tabaksproducten op menselijke immuuncellen te evalueren met behulp van ex vivo PBMC-assays. Het ondersteunt targetvalidatie door de onderdrukking van cytokinen en de cytotoxische functie te kwantificeren, wat mechanistische risicoreductie biedt voor immunomodulerende kandidaten. De assay levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor vroege discovery-screening van immunomodulatoren of immunosuppressiva.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Meet de onderdrukking van IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8 en intracellulaire cytokinen IFN-γ, TNF-α, MIP-1α in PBMCs die zijn blootgesteld aan preparaten van tabaksproducten.
- Wetenschappelijke waarde: Beoordeelt de vermindering van de cytolytische effectoractiviteit van PBMCs tegen K562-doelcellen via CFSE/7-AAD flowcytometrie.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een high-throughput, niet-radioactief 96-wells plaatformaat dat compatibel is met screeningscascades.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert dosisafhankelijke cytokine-secretie en intracellulaire cytokine-metingen voor de profilering van immunomodulatoren.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele beoordeling van de dodoctilitiet van immuuncellen mogelijk als biomarker voor immunosuppressie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflow met Golgi-plug, LPS-stimulatie en intracellulaire kleuring voor consistente functionele PBMC-metingen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt ziekterelevante systeemmodellering van door tabak geïnduceerde immuunsuppressie die gekoppeld is aan infectie- en tumorgevoeligheid.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door de suppressie van gesecreteerde en intracellulaire cytokinen te koppelen aan functionele immuunuitkomsten.
- Operationele waarde: Maakt beslissingen over voortgang op basis van risico-aanpassing mogelijk door het immunosuppressieve potentieel vroeg in de ontdekkingsfase te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows om de immunomodulerende effecten van testverbindingen op de functionaliteit van PBMC's te evalueren voorafgaand aan de lead-identificatie.
- Discovery Biology: Test van de hypothese dat preparaten van tabaksproducten TLR-4-gemedieerde immuunresponsen in primaire menselijke PBMC's onderdrukken.
- Screening: Levert kwantitatieve, gemultiplexte cytokine- en cytotoxische read-outs voor het vergelijken van het effect van verbindingen.
- Analytics: Maakt gebruik van flowcytometrie om uitgescheiden cytokines (IFN-γ, TNF, IL-6, IL-8, IL-10) en de frequenties van intracellulaire cytokine-positieve cellen te meten.
- Translational Research: Verbindt immuunsuppressie aan een verhoogde vatbaarheid voor infecties en tumoren, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Platform is aanpasbaar om andere immunomodulatoren, immunosuppressiva of omgevingsverbindingen die de PBMC-functie beïnvloeden te testen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanistisch inzicht in tabaksgerelateerde immunosuppressie via cytokine- en cytotoxische suppressie.
- Operationele waarde: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare functionele assays van PBMC mogelijk voor verschillende discoveryteams.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door immunosuppressieve risico's in een vroeg stadium te identificeren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten op basis van immuunfunctionele profilering.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de isolatie, kweek en flowcytometrie van primaire menselijke PBMC's.
- Afhankelijk van een flowcytometer die in staat is tot multiplex cytokine- en levensvatbaarheidsdetectie.
- Vereist standaardisatie van LPS-stimulatie, Golgi-plugbehandeling en antilichaampanelen tussen laboratoria.
- Aanpassing aan andere modelsystemen vereist validatie van de responsiviteit van PBMC's en cytokineniveaus.
- Beperkt tot ex vivo functionele readouts; vervangt geen in vivo farmacokinetische studies of langetermijntoxiciteitsstudies.
