Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Het algemene doel van het volgende experiment is om te demonstreren hoe synaptische verbindingen tussen morfologisch geïdentificeerde neuronen zowel functioneel als structureel worden gekenmerkt. Dit wordt bereikt door acute herfsneden te verkrijgen, die geoptimaliseerd zijn voor het bestuderen van een specifieke synaptische verbinding. Vervolgens wordt patch clamping gebruikt om te testen op synaptisch gekoppelde neuronen.

Hiervoor wordt een individueel potentieel postsynaptisch neuron gepatcht en vervolgens wordt een tweede pijpje gebruikt om omringende neuronen te stimuleren om de aanwezigheid van een synaptische verbinding vast te stellen. Als er geen reactie wordt gezien, wordt het stimulerende elektrode verplaatst. Zodra een verbinding is gevonden, wordt het presynaptische neuron opnieuw gematcht in de groothandelsmodus.

Na elektrofysiologische opnames van deze neuronen en gelijktijdige biotinvullingen wordt de snede gefixeerd, verwerkt voor biotin en computer-ondersteunde 3D reconstructies van de neuronen worden uitgevoerd. Uiteindelijk is onze methode gericht op een gecorreleerde kwantitatieve structurele en functionele analyse van neuronale microcircuits. Het grote voordeel van gepaarde opnames van synaptisch gekoppelde neuronen is dat we een gecorreleerde structurele en functionele analyse van zowel pre- als postsynaptische neuronen in neuronale microcircuits kunnen uitvoeren.

Nog recenter geïntroduceerde technieken zoals optische stimulatie van neuronen zijn tot nu toe niet in staat om dit met zoveel detail te bereiken. Deze methode maakt de studie van de interacties van excitatie en remming van morfologisch geïdentificeerde neurontypes mogelijk en hoe de activiteit wordt gemoduleerd. Het demonstreren van de procedures voor pet opnames zal Guan zijn.

Hij die een postdoc in mijn laboratorium is. Na het voorbereiden van sneden van het doelgebied, laat ze tijdens deze tijd incuberen, trek de patchpijpjes, die een lange en slanke steel moeten hebben. Nadat een herfsnede is bevestigd met een platina harp in een experimentele kamer, vult u een opnamepijpje met interne oplossing.

Plaats de pijp in de voorversterker en patch een verondersteld postsynaptisch neuron in de gehele celmodus met behulp van een zoekende patchpijp van acht tot 10 mega ohm weerstand gevuld met een interne oplossing waarin kaliumzouten zijn vervangen door natriumzouten. Pas zachte zuiging toe op de zoekende pijp om een potentieel presynaptisch neuron in een losse cel te patchen. Bevestigde configuratie.

Houd het membraanpotentiaal onder de losse afdichting op tussen de negatieve 30 en negatieve 60 millivolt in de stroomklemmodus. Breng vervolgens grote stroompulsen van 0,2 tot twee nano ampère aan om een actiepotentiaal op te wekken in de potentiële presynaptische cel. Observeer deze actiepotentiaal als een kleine spikelet op het spanningsrespons.

Stel de stimulatiefrequentie in op 0,1 hertz om een afname van de postsynaptische respons te voorkomen. Als het postsynaptische neuron niet reageert op stimulatie van het geteste potentieel presynaptische neuronpatch, een nieuw potentieel presynaptisch neuron in losse afdichtingsmodus. Test tot 30 potentieel presynaptische neuronen op deze manier.

Gebruik dezelfde zoekende patchelektrode zolang een afdichting met een weerstand van meer dan 30 mega ohm kan worden vastgesteld. Als stimulatie in de losse afdichtingsmodus resulteert in een EPSP of IPSP met een latentie van minder dan vijf milliseconden in het postsynaptische neuron, verwijdert u de zoekende pijp van het presynaptische neuron met behulp van een opname-patchpijp gevuld met biotine die een normale interne oplossing bevat met een weerstand van vier tot acht mega ohm. Patch het presynaptische neuron en neem op in de gehele cel stroomklemmodus.

Wek actiepotentialen op door stroominjectie in de presynaptische neuronen en neem de postsynaptische respons op. Sla de gegevens op een computer op voor later offline analyse. Tijdens de opname diffundeert biotine in het neuron om een adequate kleuring te verkrijgen.

Laat de biotine minimaal 15 tot 30 minuten diffunderen, afhankelijk van de grootte van het neuron. Voor neuronale microcircuits met een hoge connectiviteitsverhouding wordt geen zoekelektrode gebruikt. Begin liever met direct het patchen van een presynaptisch neuron in de gehele celmodus.

Gebruik vervolgens een patchpijp gevuld met normale interne oplossing om een potentieel postsynaptisch neuron ook in de gehele celmodus te patchen, beide cellen moeten onder stroomklemcontrole staan. Wek een actiepotentiaal op in de presynaptische cel en monitor de potentiële postsynaptische neuron voor een postsynaptisch potentiaal. Als het neuron geen reactie vertoont op presynaptische stimulatie, gebruikt u een nieuwe elektrode om opnieuw een nieuw neuron in de gehele celmodus te patchen.

Wanneer een verbinding is gevonden, gaat u verder met opnemen zoals eerder is aangetoond zonder de patchpijp te veranderen. Na het fixeren en monteren van de sneden zoals beschreven in het tekstprotocol, onderzoekt u de met biotine gelabelde neuronen onder een lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat de axonale stokken en dendritische stekels duidelijk zichtbaar zijn.

Gebruik een commercieel neuron-traceringssysteem om de neuronen of synaptisch gekoppelde neuronparen handmatig te traceren. Zorg ervoor dat zelfs kleine axonale of dendritische zijtakken worden opgenomen. Gebruik de sporen om 3D neuronale reconstructies te verkrijgen, corrigeer de neuronale reconstructies voor krimp in alle drie ruimtelijke dimensies in het juiste gedeelte van het traceringsprogramma.

De krimpcorrectiefactoren voor het inbeddingsmedium zijn ongeveer 1,1 voor de x- en y-richtingen, en ongeveer 2,1 voor de Z-richting. Een wederzijds gekoppelde celpaar bestaande uit een stekelrijke stellate en een snel spiekende in neuron. In corticale laag vier werd gevuld met biotine.

Tijdens opname geven de groene stippen putatieve excitatoire synaptische contacten aan tussen de pre-synaptische stekelrijke neuron en het post-synaptische interneuron. De blauwe stippen geven putatieve wederzijdse remmende synaptische contacten aan. Hier worden hoogwaardige afbeeldingen van de synaptische contacten getoond.

De groene open cirkels tonen excitatoire contacten en de blauwe open cirkels tonen remmende contacten. Een neuro-heldere reconstructie van dit wederzijds verbonden celpaar wordt hier getoond. Het axon van het interneuron is in blauw weergegeven en zijn soma en dendriet zijn in rood