Name: Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer elektrofysiologische en morfologische analyse van synaptische verbindingen tussen neuronen met behulp van paired patch-clamp opnames in acute hersenschijven. Deze methode combineert functionele en structurele eigenschappen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen alle leden van de ‘Functie van Neuronale Microcircuits’ Groep bij het Instituut voor Neurowetenschappen en Geneeskunde, INM-2, Onderzoekscentrum Jülich en de ‘Functie van Corticale Microcircuits’ Groep in het Dept. van Psychiatrie, Psychotherapie en Psychosomatiek, Medische School, JARA, RWTH Aachen University bedanken voor de vruchtbare discussies. Dit werk werd ondersteund door de DFG onderzoeksgroep voor Barrel Cortex Functie (BaCoFun).

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Gepaarde opnames van synaptisch gekoppelde prikkelende en / of remmende neuronen een zeer veelzijdige benadering voor de studie van neuronale microschakelingen. Niet alleen heeft deze benadering mogelijk maken om schatten synaptische verbindingen tussen soorten neuronen, maar maakt ook de bepaling van de functionele eigenschappen van de verbinding en de morfologie van pre- en postsynaptische neuronen. Bovendien kunnen agonist en / of antagonist eenvoudig worden toegepast op neuronen in slice preparaat. Hierdoor kan men ...

Neuronale microschakelingen tussen twee synaptically gekoppeld neuronen zijn de bouwstenen van grootschalige netwerken in de hersenen en zijn de fundamentele eenheden van synaptische informatieverwerking. Voorwaarde voor het karakteriseren van dergelijke neuronale microcircuits is de morfologie en functionele eigenschappen van zowel de pre- en postsynaptische neuronen partner, het type synaptische verbinding (en) en de structuur en werkingsmechanisme kennen. In veel studies van synaptische verbindingen ten minste één van de neuronen in een microschakeling niet goed gekarakteriseerd. Dit resulteert uit de betrekkelijk onspecifieke stimulatieprotocollen vaak gebruikt in studies van synaptische connectiviteit. Daarom worden de structurele en functionele eigenschappen van het presynaptische neuron ofwel niet geïdentificeerd of slechts een vrij klein gedeelte (bijvoorbeeld, de expressie van merker eiwitten etc.). Gepaarde opnames in combinatie met intracellulaire kleuring door markers sUch als biocytine, neurobiotin of fluorescerende kleurstoffen zijn beter geschikt voor het bestuderen van kleine neuronale microschakelingen. Deze techniek maakt het mogelijk om vele structurele en functionele parameters van een morfologisch geïdentificeerd synaptische verbinding tegelijkertijd te onderzoeken. Zogenaamde &#39;unitaire&#39; monosynaptic verbindingen tussen twee neuronen zijn onderzocht in zowel corticale en subcorticale hersengebieden 1-10 behulp van acute slice voorbereiding. Aanvankelijk werden scherpe micro-elektroden gebruikt in deze experimenten; later werd patch clamp toegepast om opname van synaptische signalen te verkrijgen met een lager geluidsniveau en een verbeterde tijdsresolutie. Een belangrijke technische vooruitgang is het gebruik van infrarode differentiële interferentie contrast (IR-DIC) optiek 11-14, microscopische techniek die aanzienlijk verbeterd de zichtbaarheid en de identificatie van neuronen in de hersenen slice zodat het mogelijk werd to verkrijgen opnames van visueel geïdentificeerde synaptische verbindingen 15-17. In het algemeen gepaard opnamen uitgevoerd bij acute slice preparaten; slechts zeer weinig publicaties zijn verkrijgbaar rapportage opnamen van synaptically verbonden neuronen in vivo 18-20. Het belangrijkste voordeel van gepaarde opnames is het feit dat een functionele karakterisering kan worden gecombineerd met een morfologische analyse op zowel het licht en elektronen microscopisch niveau (zie bv., 7,16,21). Na histochemische verwerking, wordt de dendritische en axonale morfologie van de synaptically verbonden neuron paar getraceerd. Vervolgens is het mogelijk om morfologische kenmerken zoals lengte, ruimtelijke dichtheid, oriëntatie, vertakking enz kwantificeren Deze parameters kunnen dan een basis voor een objectieve classificatie van een specifiek synaptische verbinding. Bovendien, in tegenstelling tot de meeste andere technieken voor het bestuderen van neuronale verbviteit, gepaarde opnames toestaan ​​ook de identificatie van synaptische contacten voor unitaire synaptische verbindingen. Dit kan direct worden gedaan met behulp van een combinatie van licht en elektronenmicroscopie 16,21-27 of met behulp van calcium beeldvorming 28,29 van dendritische spines. Echter, met deze benadering enige prikkelende maar niet remmende verbindingen kunnen worden bestudeerd als het vereist calcium influx via de postsynaptische receptor kanalen. Naast een gedetailleerde analyse van synaptische transmissie bij een bepaalde neuronale microcircuit gepaarde opnames ook de studie van synaptische plasticiteit regels 30,31 toestaan ​​of - in combinatie met agonist / antagonist toepassing - de modulatie van synaptische transmissie door neurotransmitters zoals acetylcholine 32 en adenosine 33.

<table><tbody><tr><td>Versterker</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>met 2 - 3 voorversterkers</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>met 2 camerapoorten, een 4X objectief en een 40X water-immersieobjectief</td></tr><tr><td>Camera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>infrarood CCD-camera</td></tr><tr><td>Werkstation</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>met een gemotoriseerde x-y-fase en een gemotoriseerde focusas voor de microscoop</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z manipulatoren voor 2 - 3 voorversterkers</td></tr><tr><td>Faraday-kooi</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-vibratietafel</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettrekker</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida-systeem</td><td>Microbrightfield</td><td></td><td>met Neurolucida en Neuroexplorer softwares</td></tr></tbody></table>

elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale microschake in acute brain slices met behulp paired patch-clamp recordings

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

De combinatie van patch clamp opnamen van twee (of meer) synaptically gekoppeld neuronen (gepaarde opnames) bij acute hersenen slice bereidingen met gelijktijdige intracellulaire biocytine vulling maakt een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen. Met deze methode is het mogelijk om zowel pre- en postsynaptische neuronen identificeren en karakteriseren door hun morfologie en elektrofysiologische respons patroon. Gepaarde opnames toe de connectiviteitspatronen tussen deze neuronen alsook de eigenschappen van zowel chemische en elektrische synaptische transmissie. Hier geven we een stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om betrouwbare gepaarde opnames samen te verkrijgen met een optimaal herstel van het neuron morfologie procedures. We zullen beschrijven hoe paren van neuronen die via chemische synapsen of gap junctions zijn geïdentificeerd in de hersenen slice preparaten. We zullen aangeven hoe neuronen worden gereconstrueerd om hun 3D-morfologie van de Dendrit verkrijgenic en axonale domein en hoe synaptische contacten worden geïdentificeerd en gelokaliseerd. We bespreken ook de valkuilen en beperkingen van de gepaarde opnametechniek, met name die in verband met dendritische en axonale afknottingen tijdens de voorbereiding van de hersenen plakjes, omdat deze sterk beïnvloeden connectiviteit schattingen. Vanwege de veelzijdigheid van de gepaarde opname benadering zal een waardevol hulpmiddel bij het karakteriseren van verschillende aspecten van synaptische transmissie bij die neuronale microcircuits in de hersenen blijft.

Gepaarde opnamen de voorkeursmethode voor een grondige karakterisering van morfologisch geïdentificeerd uni- of bidirectionele synaptische verbindingen alsmede gap junction (elektrische) aansluitingen (figuur 1). Een voorbeeld van een gepaarde opname laag 4 van de somatosensorische cortex vat wordt getoond in figuur 1A. Zowel unidirectionele prikkelende en remmende synaptische verbindingen worden gekarakteriseerd (Figuur 1B, C). Verder gepaarde opnames laten opnemen bid...

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om te demonstreren hoe synaptische verbindingen tussen morfologisch geïdentificeerde neuronen zowel functioneel als structureel worden gekenmerkt. Dit wordt bereikt door acute herfsneden te verkrijgen, die geoptimaliseerd zijn voor het bestuderen van een specifieke synaptische verbinding. Vervolgens wordt patch clamping gebruikt om te testen op synaptisch gekoppelde neuronen.Hiervoor wordt een individueel potentieel postsynaptisch neuron gepatcht en vervolgens wordt een tweede pijpje gebruikt om omringende neuronen te stimuleren om de aanwezigheid van een synaptische verbinding vast te stellen. Als er geen reactie wordt gezien, wordt het stimulerende elektrode verplaatst. Zodra een verbinding is gevonden, wordt het presynaptische neuron opnieuw gematcht in de groothandelsmodus.Na elektrofysiologische opnames van deze neuronen en gelijktijdige biotinvullingen wordt de snede gefixeerd, verwerkt voor biotin en computer-ondersteunde 3D reconstructies van de neuronen worden uitgevoerd. Uiteindelijk is onze methode gericht op een gecorreleerde kwantitatieve structurele en functionele analyse van neuronale microcircuits. Het grote voordeel van gepaarde opnames van synaptisch gekoppelde neuronen is dat we een gecorreleerde structurele en functionele analyse van zowel pre- als postsynaptische neuronen in neuronale microcircuits kunnen uitvoeren.Nog recenter geïntroduceerde technieken zoals optische stimulatie van neuronen zijn tot nu toe niet in staat om dit met zoveel detail te bereiken. Deze methode maakt de studie van de interacties van excitatie en remming van morfologisch geïdentificeerde neurontypes mogelijk en hoe de activiteit wordt gemoduleerd. Het demonstreren van de procedures voor pet opnames zal Guan zijn.Hij die een postdoc in mijn laboratorium is. Na het voorbereiden van sneden van het doelgebied, laat ze tijdens deze tijd incuberen, trek de patchpijpjes, die een lange en slanke steel moeten hebben. Nadat een herfsnede is bevestigd met een platina harp in een experimentele kamer, vult u een opnamepijpje met interne oplossing.Plaats de pijp in de voorversterker en patch een verondersteld postsynaptisch neuron in de gehele celmodus met behulp van een zoekende patchpijp van acht tot 10 mega ohm weerstand gevuld met een interne oplossing waarin kaliumzouten zijn vervangen door natriumzouten. Pas zachte zuiging toe op de zoekende pijp om een potentieel presynaptisch neuron in een losse cel te patchen. Bevestigde configuratie.Houd het membraanpotentiaal onder de losse afdichting op tussen de negatieve 30 en negatieve 60 millivolt in de stroomklemmodus. Breng vervolgens grote stroompulsen van 0,2 tot twee nano ampère aan om een actiepotentiaal op te wekken in de potentiële presynaptische cel. Observeer deze actiepotentiaal als een kleine spikelet op het spanningsrespons.Stel de stimulatiefrequentie in op 0,1 hertz om een afname van de postsynaptische respons te voorkomen. Als het postsynaptische neuron niet reageert op stimulatie van het geteste potentieel presynaptische neuronpatch, een nieuw potentieel presynaptisch neuron in losse afdichtingsmodus. Test tot 30 potentieel presynaptische neuronen op deze manier.Gebruik dezelfde zoekende patchelektrode zolang een afdichting met een weerstand van meer dan 30 mega ohm kan worden vastgesteld. Als stimulatie in de losse afdichtingsmodus resulteert in een EPSP of IPSP met een latentie van minder dan vijf milliseconden in het postsynaptische neuron, verwijdert u de zoekende pijp van het presynaptische neuron met behulp van een opname-patchpijp gevuld met biotine die een normale interne oplossing bevat met een weerstand van vier tot acht mega ohm. Patch het presynaptische neuron en neem op in de gehele cel stroomklemmodus.Wek actiepotentialen op door stroominjectie in de presynaptische neuronen en neem de postsynaptische respons op. Sla de gegevens op een computer op voor later offline analyse. Tijdens de opname diffundeert biotine in het neuron om een adequate kleuring te verkrijgen.Laat de biotine minimaal 15 tot 30 minuten diffunderen, afhankelijk van de grootte van het neuron. Voor neuronale microcircuits met een hoge connectiviteitsverhouding wordt geen zoekelektrode gebruikt. Begin liever met direct het patchen van een presynaptisch neuron in de gehele celmodus.Gebruik vervolgens een patchpijp gevuld met normale interne oplossing om een potentieel postsynaptisch neuron ook in de gehele celmodus te patchen, beide cellen moeten onder stroomklemcontrole staan. Wek een actiepotentiaal op in de presynaptische cel en monitor de potentiële postsynaptische neuron voor een postsynaptisch potentiaal. Als het neuron geen reactie vertoont op presynaptische stimulatie, gebruikt u een nieuwe elektrode om opnieuw een nieuw neuron in de gehele celmodus te patchen.Wanneer een verbinding is gevonden, gaat u verder met opnemen zoals eerder is aangetoond zonder de patchpijp te veranderen. Na het fixeren en monteren van de sneden zoals beschreven in het tekstprotocol, onderzoekt u de met biotine gelabelde neuronen onder een lichtmicroscoop. Zorg ervoor dat de axonale stokken en dendritische stekels duidelijk zichtbaar zijn.Gebruik een commercieel neuron-traceringssysteem om de neuronen of synaptisch gekoppelde neuronparen handmatig te traceren. Zorg ervoor dat zelfs kleine axonale of dendritische zijtakken worden opgenomen. Gebruik de sporen om 3D neuronale reconstructies te verkrijgen, corrigeer de neuronale reconstructies voor krimp in alle drie ruimtelijke dimensies in het juiste gedeelte van het traceringsprogramma.De krimpcorrectiefactoren voor het inbeddingsmedium zijn ongeveer 1,1 voor de x- en y-richtingen, en ongeveer 2,1 voor de Z-richting. Een wederzijds gekoppelde celpaar bestaande uit een stekelrijke stellate en een snel spiekende in neuron. In corticale laag vier werd gevuld met biotine.Tijdens opname geven de groene stippen putatieve excitatoire synaptische contacten aan tussen de pre-synaptische stekelrijke neuron en het post-synaptische interneuron. De blauwe stippen geven putatieve wederzijdse remmende synaptische contacten aan. Hier worden hoogwaardige afbeeldingen van de synaptische contacten getoond.De groene open cirkels tonen excitatoire contacten en de blauwe open cirkels tonen remmende contacten. Een neuro-heldere reconstructie van dit wederzijds verbonden celpaar wordt hier getoond. Het axon van het interneuron is in blauw weergegeven en zijn soma en dendriet zijn in rood

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een veelzijdige benadering van het onderzoek naar functionele veranderingen in de hippocampus circuits wordt uitgelegd. Elektrofysiologische technieken worden beschreven, samen met de schade-protocol, gedrags-testen en regionale dissectie methode. De combinatie van deze technieken kunnen worden toegepast op soortgelijke wijze andere hersengebieden en wetenschappelijke vragen.

Onderzoeken op Wijzigingen van de hippocampus Circuit Functie Na mild traumatisch hersenletsel

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

This video demonstrates the procedure to map synaptic connections by securing a brain slice, positioning pipettes to achieve whole-cell configurations, and stimulating presynaptic neurons to record postsynaptic responses, thereby elucidating neuronal connectivity.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Het segment patch-clamp techniek is een effectieve methode voor het analyseren van leren-geïnduceerde veranderingen in de intrinsieke eigenschappen en de plasticiteit van excitatory of inhiberende synapsen.

Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity

Dit protocol beschrijft hoe u automatische beeldgeleide patch-clamp experimenten kunt uitvoeren met behulp van een systeem dat onlangs is ontwikkeld voor standaard in vitro elektrofysiologie apparatuur.

Toepassing van geautomatiseerde beeldgeleide patchclamp voor de studie van neuronen in hersenschijven

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

Leer elektrofysiologische en morfologische analyse van synaptische verbindingen tussen neuronen met behulp van paired patch-clamp opnames in acute hersenschijven. Deze methode combineert functionele en structurele eigenschappen.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings (Video) | JoVE Journal

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Meer video's verkennen