Functionele Evaluatie van Biologische Neurotoxines in Networked Cultures van stamcel-afgeleide centrale zenuwstelsel Neuronen

Het doel van deze procedure is om nauwkeurig het effect te meten dat Clostridiale neurotoxines hebben op de synaptische transmissie in genetwerkte culturen van neuronen afgeleid van embryonale stamcellen van muizen. Dit wordt bereikt door embryonale stamcellen eerst aan te passen aan een feeder-celvrije suspensiecultuur en de aangepaste cellen in een pluripotente staat te houden. De tweede stap is het differentiëren van de suspensie-aangepaste stamcellen tot neuronen of ESN's, met gebruik van een variatie van de four-four differentietechniek.

Vervolgens worden de ESN's behandeld met een reeks media om de rijping tot synaptisch actieve netwerkneuronen te bevorderen. De laatste stap is het behandelen van de ESN's met clostridiale neurotoxinen of andere neurotoxinen en het meten van de effecten op de monosynaptische activiteit met behulp van whole-cell patch-clamp elektrofysiologie. Ten slotte worden veranderingen in de spontane productie van monosynaptische activiteit gekwantificeerd op basis van elektrofysiologische opnames, genormaliseerd ten opzichte van controleneuronen die qua leeftijd en lot overeenkomen, en vergeleken tussen verschillende condities, zoals doses, tijden of medicijnbehandelingen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ESN's het eerste celgebaseerde model zijn dat de functionele pathologieën repliceert die verantwoordelijk zijn voor de klinische manifestaties van botulisme en tetanus. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ontdekten dat ESN's zeer gevoelig waren voor alle clostridiale neurotoxinen op basis van snare-eiwit splitsing, en ook spontane synaptische activiteit vertoonden in emergent netwerkgedrag. De procedure zal worden gedemonstreerd door mw. Megan Lyman, een technicus uit mijn laboratorium. Begin met het overbrengen van de aangepaste feeder-celvrije suspensiecultuur.

Breng de ESC-aggregaten over in een conische buis van 15 milliliter en laat de aggregaten bezinken tot een compacte pellet. Zodra de aggregaten zijn bezonken, wordt het supernatant afgezogen, waarbij voorzichtig wordt voorkomen dat de celpellet wordt verstoord. Voeg vervolgens vijf milliliter PBS toe om de cellen te wassen en centrifugeer bij 100 ×g gedurende 2,5 minuten.

Aspireer de PBS zorgvuldig en voeg vervolgens 500 µL trypsine toe; keer de buis meerdere keren om om het celpellet voorzichtig te verbreken. Plaats de buis vervolgens in het waterbad van 37 °C en incubeer gedurende drie minuten. Nadat de incubatietijd is verstreken, brengt u de buis terug naar de weefkweekkap en voegt u 500 µL ESC-medium toe om de trypsine te verdunnen.

Tritureer vervolgens de CEL-suspensie vijf tot 10 keer met de P 1000 pipette om een enkelcel-suspensie te verkrijgen. Tel een aliquot van de cellen met behulp van een hemocytometer en centrifugeer het restant van de celsuspensie bij 200 ×g gedurende drie minuten. Na het aspireren van het supernatant resuspenderen we de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter met ESC-medium.

Breng vervolgens 150 µL van de suspensie over naar 10 mL ESC-medium in een bacteriële schaal van 10 cm en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. ESC's worden routinematig gepassaged met behulp van dit protocol. Elke 48 uur begint de differentiatie van ESC's tot neuronen tijdens een routinematige celpassage.

Dissocieer de ESC's zoals eerder beschreven, maar voeg een extra plaat toe voor neuronale differentiatie. Breng 350 µL van de celsuspensie over naar een 10 cm low attachment dish met 25 mL differentiatiemedium. Plaats de dish op een orbitale schudder ingesteld op 30 tot 45 RPM in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 en incubeer gedurende 48 uur.

Gebruik na 48 uur een pipet van 25 milliliter om de differentiërende celaggregaten over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter. Voeg onmiddervijk daarna 25 milliliter vers differentiatiemedium toe aan de Petrischaal.

Laat de aggregaten twee tot vijf minuten bezinken, waardoor een zichtbare pellet ontstaat met een diepte van één tot twee millimeter. Aspireer voorzichtig het medium, waarbij eventuele losse cellen of kleine aggregaten die nog in suspensie zijn worden genegeerd, en gebruik een P 1000-pipet om de celpellet terug te brengen naar de Petrischaal. Plaats de schaal terug in de rotatie-shaker in de incubator.

Herhaal na nog eens 48 uur de procedure voor het verversen van het medium. Gebruik ditmaal 30 milliliters differentiatiemedium aangevuld met zes micromolar all-trans retinoïnezuur. Het gevormde pellet zal na incubatie van de cellen nu twee tot vier millimeter diep zijn.

Herhaal, zoals eerder beschreven, voor de laatste keer de procedure voor het verversen van het medium met toevoeging van retinoïnezuur. De pellet zal de volgende dag een diepte van vier tot acht millimeter hebben. Bereid de platen voor zoals beschreven in het geschreven gedeelte van het protocol op de middag van de uitplaatdag, of bereid telkens vijf milliliter vooraf gecoat MPC-trypsinemedium en 0,1% soja-trypsine-inhibitor voor bij 37 °C.

Gebruik vervolgens een pipet van 25 milliliter om de differentiërende aggregaten van de kweekplaat over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter. Laat de aggregaten drie tot vijf minuten bezinken en aspireer daarna voorzichtig het medium zonder de pellet te verstoren. Was de pellet vervolgens met vijf tot 10 milliliter PBS nadat de aggregaten zijn bezonken.

Zuig de PBS af en herhaal de wasstap. Na de tweede PBS-was worden vijf milliliter MPC-izatiemedium aan het pellet toegevoegd en wordt dit vijf minuten geïncubeerd bij 37 °C.

Tik tijdens de incubatie voorzichtig twee tot drie keer tegen de buis. Voeg vervolgens vijf milliliter 0,1% soja-trypsineremmer toe aan de cellen en meng snel door te keren. Tritureer de cellen daarna voorzichtig 10 tot 15 keer met een 10 milliliter pipette tot er een relatief homogene celsuspensie is gevormd.

Filtreer de celsuspensie langzaam door een cellzeef van 40 of 70 micron die bovenop een conische buis van 50 milliliter is geplaatst. Zodra de volledige suspensie is gefiltreerd, voegt u één milliliter N2-medium toe aan het filter om de resterende cellen door de zeef te spoelen. Draag de celsuspensie over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer zes minuten bij 200 ×g. Nadat het medium is geaspireerd zonder het pellet te verstoren, wordt dit getritureerd in twee milliliter N2-medium; voeg vervolgens N2-medium toe tot een totaal volume van 10 milliliter.

Centrifugeer vijf minuten bij 200 ×g. Aspireer het medium en herhaal het wasproces van de pellet opnieuw. Resuspendeer de pellet in 10 milliliters N2-medium.

Neem een aliquot van de cellen en tel deze met een hemocytometer, en herhaal vervolgens de centrifugatie. Suspendeer de cellen in N2-medium tot een uiteindelijke concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter en zaai deze uit op een dichtheid van 150.000 tot 200.000 cellen per centimeter² (cm⁻²). Dit wordt voorbereid op DIV -1 en geplaatst in de weefselkweekincubator bij 37 °C.

Onderhoud de ESN's volgens de instructies in het geschreven protocol. Verdun eerst botulinetoxine serotype A tot 100 keer de gewenste eindconcentratie in ESN-kweekmedium en verwarm dit tot 37 °C. Voeg vervolgens een geschikt volume toxine toe aan DIV 21 plus ESN-culturen.

Laat het kweekschaaltje zwellen en plaats het op het gewenste tijdstip terug in de incubator. Aspireer het ESN-kweekmedium via een punctie en was tweemaal met extracellulair registratiebuffer of ERB. Voeg vervolgens vier milliliter ERB toe, aangevuld met vijf micromolair tetrodotoxine om actiepotentialen te blokkeren en 10 micromolair bicuculline om de activiteit van gabaa-receptoren tegen te werken.

Plaats vervolgens de schaal in de elektrofysiologische opstelling. Voor de meting van de inhibitie van synaptische transmissie of de mist-assay is noch perfusie noch temperatuurregeling vereist. Trek met een micropipet-trekker twee silicaatpipetten met een weerstand van 5 tot 10 mega ohms en vul een pipet via de achterzijde met intracellulaire registratiebuffer.

Doop de pipet vervolgens voorzichtig in het siliconreagens. Bevestig de registratiepipet aan de電odehouder en sluit een luchtgevulde spuit aan op de slang die in de電odehouder is geplaatst. Oefen via de spuit een constante positieve druk uit terwijl u de registratiepipet in de ERB laat zakken.

Nadat de registratiepipet voorzichtig op de SOR van het te registreren neuron is geplaatst, wordt de positieve druk gecontroleerd door het zegel op de spuit te verbreken. Sluit de spuit opnieuw aan en pas een aanhoudende negatieve druk toe via een voorzichtige aspiratie om een giga-ohm zegel te vormen.

Zodra de gigaseal is gevormd, wordt de houdspanning verlaagd naar -70 millivolt. Pas vervolgens voorzichtig korte pulsen negatieve druk toe met de spuit om over te gaan naar de whole-cell configuratie. Monitor de capaciteitspieken gedurende 30 seconden om te bevestigen dat de patch stabiel is.

Schakel de capaciteitspieken in de HEA-software uit en schakel over naar de current clamp-modus om de rustmembraanpotentiaal te monitoren en vast te leggen zonder correctie voor vloeistofovergangspotentialen. De rustmembraanpotentiaal kan tussen minus 67 en minus 82 millivolt liggen. Stel de gain in op twee millivolt per pico amp.

Schakel over naar de voltage clamp-modus en voer gedurende drie tot vijf minuten een continue opname uit bij -70 millivolts om miniatuur excitatoire postsynaptische stromen te detecteren. Analyseer drie tot vijf minuten aan opgenomen gegevens om me PSC's te detecteren met de standaardinstellingen voor AMPA-receptor EPC's in de mini-analyse; verzamel en bewaar informatie over de gedetecteerde gebeurtenissen. Verzamel M-E-P-S-C frequenties voor acht tot 12 controles en acht tot 12 met botulinumneurotoxine behandelde monsters voor elke blootstellingsconditie.

Analyseer de frequentie ten opzichte van op leeftijd en lot gematchte controles en bepaal vervolgens de statistische significantie van het percentage inhibitie van de synaptische activiteit met behulp van geschikte statistische tests van div 7 tot div 49; ESN's brengen neurotrope compartimenten tot expressie en vormen synaptische puncta. Taxo dendritische interfaces. ESN's ondergaan inhibitie van de synaptische activiteit bij blootstelling aan botulinum neurotoxine serotypes a TG en tetanus toxine.

Deze representatieve sporen van ESN's werden verzameld 20 uur na toevoeging aan het bad van botulinetoxine serotypes A, TG tetanusneurotoxine of het vehikel. Elk neurotoxine reduceerde de synaptische activiteit met meer dan 95% in vergelijking met de controles. De volgende vier afbeeldingen tonen de gevoeligheid van het gebruik van mist om monosynaptische activiteit te meten in met botulinetoxine serotype A behandelde ESN's.

Deze eerste afbeelding toont representatieve sporen van gemeten synaptische activiteit 20 uur na toevoeging van botulinumneurotoxine serotype A aan het bad. De segmenten van de voltage-clamp-sporen vertoonden een afname van de M-E-P-S-C-frequentie na blootstelling aan botulinumneurotoxine serotype A. Deze afbeelding toont de kwantificering van de M-E-P-S-C-frequentie en bevestigt een dosisafhankelijke afname van de M-E-P-S-C-frequentie. De mediane inhiberende concentratie werd bepaald met de kleinste-kwadratenmethode van een niet-lineaire regressie met behulp van een vierparameter variabele helling. Let op: de detectielimiet in SNS is ten minste 0,005 picaMolar.

Deze staafgrafiek toont de cytometry-kwantificering van SNAP 25-splitsing gemeten via western blot. Let op de verminderde gevoeligheid van snare-eiwitsplitsing als maatstaf voor intoxicatie. In vergelijking met mist geeft een enkel asterisk een P-waarde van minder dan 0,05 aan.

Drie asterisken geven een P-waarde van minder dan 0,001 aan. Deze bevindingen tonen aan dat genetwerkte populaties van uit stamcellen afgeleide neuronen een fysiologisch relevant celgebaseerd model bieden voor clostridiale neurotoxinevergiftiging. De inzet van SNS zal naar verwachting het lijden en de sterfte van dieren aanzienlijk verminderen door te dienen als een geschikt alternatief voor de muis-letaliteitstest, met het extra voordeel van een verbeterde snelheid, specificiteit en sensitiviteit.

Deze techniek baant de weg voor onderzoekers op het gebied van de neurotoxicologie om screeningstechnieken met een middelmatige doorvoersnelheid, gebaseerd op de activiteit van neurale netwerken, in te zetten om therapeutische screening en de detectie van clostridiale neurotoxines te vergemakkelijken.