Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal

Het algemene doel van deze procedure is om de transportactiviteit van gereconstitueerde chloridekanalen of transporters kwantitatief te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de zuivere, gezuiverde transporter bij een lage dichtheid te reconstitueren in liposomen, zodat elk liposoom na verwijdering van de externe chloride-ionen — om een naar buiten gericht ionengradiënt te creëren — nul of één kopie van het actieve complex bevat. De liposomen worden vervolgens toegevoegd aan de meetkamer, waar de chlorideconcentratie wordt gemonitord met een chloridesensitieve elektrode. Vervolgens wordt de chlorideflux uit de liposomen geïnitieerd door toevoeging van Valinomycine, een kaliumionofoor, wat het membraanpotentiaal opheft.

Zodra het signaal een stabiele toestand bereikt, wordt het experiment beëindigd door toevoeging van detergent om de liposomen op te lossen. Uiteindelijk is het, door het meten van de snelheid van chloride-efflux uit proteoliposomen die zijn gereconstitueerd met een gezuiverd kanaal of transporteiwit, mogelijk om de unittestaire transportsnelheid en de stoichiometrie van het actieve eiwitcomplex kwantitatief te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande benaderingen, zoals op fluorescentie gebaseerde fluxmetingen, is dat het met deze techniek mogelijk is om sleutelparameters van het gereconstitueerde transporteiwit kwantitatief te bepalen, zoals de unittestaire omzetsnelheid en de geometrie van het complex.

Naast het leveren van kwantitatieve maten van deze sleutelparameters, kan deze methode worden gebruikt om het effect van kleine moleculen bij mutaties snel en nauwkeurig te bepalen, en om subunits in het gereconstitueerde transporteiwit te monitoren. De registratie-opstelling bestaat uit twee kamers, een chloride-elektrode, een pH-meter met een analoge of digitale elektrische output, een digitizer en een computer met geschikte acquisitiesoftware. Sluit de chloride-elektrode aan op de pH-meter en verbind vervolgens de output van de pH-meter met de digitizer, die is aangesloten op de computer.

Plaats de referentie-elektrode in de ene kamer en de registratiedraad in de andere. Plaats vervolgens de kamers op een roerplaat met de roerstaaf in de registratiekamer. Zorg ervoor dat de roerstaaf de elektrode niet raakt.

Verbind de kamers met een agarbrug op de avond vóór de experimenten. Laat één gram Cidex G 50-kralen zwellen in 15 milliliters extern buffer onder zachte schudding gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur voor gebruik. Voor elk experiment zijn ongeveer drie milliliters gezwollen kralen nodig, terwijl de liposomen ontdooien bij kamertemperatuur. Giet ongeveer drie milliliters gezwollen G 50-kralen in elke kolom.

Laat ze door zwaartekracht drogen. Laat dit op kamertemperatuur gebeuren. Dit duurt gewoonlijk één tot twee minuten.

Bereid vervolgens unilamellaire vesicles voor door de proteoliposomen 11 keer door een mini-extruder te persen met een Teflon-cutoff van 0,4 micron. Plaats de kolom vervolgens in een plastic centrifugebuis met ronde bodem en centrifugeer deze 20 tot 30 seconden bij 1400 G in een klinische centrifuge om overtollige oplossing te verwijderen. Plaats daarna, terwijl de doorstroom wordt bewaakt, de kolom in een glazen buis van 13 bij 100 millimeter en voeg 100 microliters van de ge-extrudeerde vesicles toe aan de kolom.

Centrifugeer de kolom gedurende één minuut bij 500 G. Verzamel in een klinische centrifuge ongeveer 200 µL van het doorstroomvolume om dit aan de meetkamer toe te voegen. Om de effluxmeting uit te voeren, plaatst u 2 mL 100 mM kaliumchloride in de referentiekamer en 1,8 mL van de externe buffer in de meetkamer. Start het acquisitieprogramma.

Laat de basislijn stabiliseren. Dit kan enkele minuten duren. Zodra het signaal een stabiele basislijn bereikt, start u met de opname.

Voeg 15 µL van een kaliumchloride-oplossing met een bekende molariteit toe om het systeem te kalibreren. Voeg vervolgens de liposomen toe. Er kan een kleine sprong zichtbaar zijn door onvolledige verwijdering van extern chloride uit de protea-liposomen.

Wacht tot de basislijn stabiliseert. Voeg vervolgens CIN toe om flx te initiëren. Laat de FLX het tijdsverloop doorlopen tot er een plateau wordt bereikt.

Voeg op dit punt 40 µL van 1,5 M bèta-octylglucoside toe, bereid in de externe buffer, om alle liposomen op te lossen. Wacht vervolgens 10 tot 15 seconden. Stop de opname en ga over tot de data-analyse zoals beschreven in het tekstprotocol.

Wanneer liposomen met een hoge interne chlorideconcentratie worden ondergedompeld in een lage chlorideconcentratie, waardoor een chloridegradiënt van 300-voud ontstaat, wordt er geen netto-ionenstroom waargenomen. Dit komt doordat eiwitvrije liposomen een lage intrinsieke permeabiliteit voor ionen hebben. Er wordt geen macroscopische FLX waargenomen bij proteoliposomen gereconstitueerd met de protongekoppelde chloride-transporter, C-L-C-E-C one.

Omdat de kleine hoeveelheid chloride die de vesikel verlaat een netto positieve lading in het liposoom opbouwt, maakt de toevoeging van CIN het mogelijk voor kaliumionen om door het membraan te bewegen, waardoor het elektrisch potentiaal wordt opgeheven en de chlorideflux wordt geïnitieerd. De reactie wordt beëindigd en de totale hoeveelheid chloride-ionen in de vesikels wordt gemeten om de eigenschappen van de individuele gereconstitueerde eiwitten te bepalen. De ruwe gegevens van het efflux-tijdverloop worden eerst omgezet van millivolts naar een chlorideconcentratie en vervolgens genormaliseerd, waarna het tijdverloop wordt gefit.

Er werd vastgesteld dat de tijdconstante van de efflux 41 seconden bedraagt en dat de fractie liposomen die nul actieve kopieën van CLCEC1 bevatten 0,31 is, wat aangeeft dat ongeveer een derde van de liposomen geen actieve eiwitten bevat. Op basis van deze waarden en door het chloridegehalte van vesicles te meten die ten minste één kopie van CLCEC1 bevatten, is het mogelijk om een eenitaire transportsnelheid van CLCEC1 te bepalen die gelijk is aan ongeveer 2.500 chloride-ionen per seconde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de omzetsnelheid van een transporter kan worden bepaald. Deze experimenten kunnen in 10 tot 15 minuten worden uitgevoerd wanneer ze zorgvuldig worden uitgevoerd.

Het is van cruciaal belang om de kwaliteit van de liposomen zorgvuldig te beoordelen, aangezien lekken de schattingen van de turnoverrate nadelig beïnvloeden.