Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal ^- Kanalen en Transporters

Het algemene doel van deze procedure is om de transportactiviteit van gereconstitueerde chloridekanalen of transporters kwantitatief te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de zuivere gezuiverde transporter te reconstitueren in liposomen met een lage dichtheid, zodat elke liposomer ofwel geen ofwel één kopie van het actieve complex bevat na het verwijderen van de externe chloride-ionen, zodat er een naar buiten gerichte ionische gradiënt is, worden de liposomen toegevoegd aan de opnamekamer waar de chlorideconcentratie wordt gemonitord met behulp van een chloridegevoelige elektrode. Vervolgens wordt chlorideflx van de liposomen geïnitieerd door toevoeging van Val Mycine, een kaliumionofoor, die het membraanpotentieel verlicht.

Zodra het signaal een stabiele toestand bereikt, wordt het experiment beëindigd door toevoeging van detergent om de liposomen op te lossen. Uiteindelijk, door de snelheid van chloride-efflux uit protea-liposomen te meten, gereconstitueerd met een gezuiverde kanaal of transporter, is het mogelijk om kwantitatief de unitaire transportrate en de stoichiometrie van het actieve eiwitcomplex te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere bestaande benaderingen, zoals fluxmetingen op basis van fluorescentie, is dat met deze techniek het mogelijk is om kwantitatieve parameters van de gereconstitueerde transporter, zoals de unitaire omzettingssnelheid, en de geometrie van het complex, te bepalen.

Naast het leveren van kwantitatieve maatregelen van deze sleutelparameters, kan deze methode worden gebruikt om snel en nauwkeurig het effect van mutatie kleine moleculen te bepalen, en om subeenheden in het gereconstitueerde transfereiwit te monitoren. De opnameopstelling bestaat uit twee kamers, een chloride-elektrode, een pH-meter met een analoog of digitaal elektrisch uitgangssignaal, een digitizer en een computer met geschikte acquisitiesoftware. Verbind de chloride-elektrode met de pH-meter, verbind vervolgens de uitgang van de pH-meter met de digitizer, die is aangesloten op de computer.

Plaats de referentie-elektrode in één kamer en de opnamedraad in de andere. Plaats vervolgens de kamers op een roerplaat met de roerlat in de opnamekamer. Zorg ervoor dat de roerlat de elektrode niet raakt.

Verbind de kamers met behulp van een agarbrug de nacht voor de experimenten, zwel één gram cidex G 50-kralen in 15 milliliter externe buffer gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur voor gebruik. Elke experiment vereist ongeveer drie milliliter gezwollen kralen terwijl de liposomen bij kamertemperatuur ontdooien. Giet ongeveer drie milliliter gezwollen G 50-kralen in elke kolom.

Laat ze door zwaartekracht drogen. Stroom bij kamertemperatuur. Dit duurt meestal één tot twee minuten.

Bereid vervolgens ulaire vesicles voor door de protea-liposomen 11 keer door een mini-extruder te extruderen met behulp van een 0,4 micron Teflon-cutoff. Plaats vervolgens de kolom in een ronde kunststofbuiscentrifuge gedurende 20 tot 30 seconden bij 1400 G in een klinische centrifuge om overtollige oplossing te verwijderen. Na dit, ter bescherming van de stroom door, plaats de kolom in een 13 bij 100 millimeter glazen buis en voeg 100 microliter van de extrudeerde vesicles toe aan de kolom.

Speel de kolom gedurende één minuut bij 500 G. In een klinische centrifuge, verzamel ongeveer 200 microliter van de stroom door die aan de opnamekamer zal worden toegevoegd. Om efflux-meting uit te voeren, plaats twee milliliter van 100 millimolair kaliumchloride in de referentiekamer, en 1,8 milliliter van de externe buffer in de opnamekamer. Start het acquisitieprogramma.

Laat de baseline gelijkwaardig worden. Dit kan een paar minuten duren. Zodra het signaal een stabiele baseline bereikt, begin met opnemen.

Voeg 15 microliter van een tan molaire kaliumchloride-oplossing toe om het systeem te kalibreren. Voeg vervolgens liposomen toe. Een kleine sprong kan zichtbaar zijn als gevolg van onvolledige verwijdering van extern chloride uit de protea-liposomen.

Wacht tot de baseline stabiliseert. Voeg vervolgens CIN toe om flx te initiëren. Laat de FLX zijn tijdsverloop laten lopen totdat het plateau bereikt.

Op dit punt, voeg 40 microliter van 1,5 molair bèta Octa glucocide toe, bereid in de externe buffer om alle liposomen op te lossen. Wacht vervolgens 10 tot 15 seconden. Beëindig de opname en ga verder met gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol.

Wanneer liposomen die hoog intern chloride bevatten, worden ondergedompeld in laag chloride, waardoor een 300-voudige chloridegradiënt ontstaat, wordt geen netto ionenflux waargenomen. Dit komt omdat de eiwitvrije liposomen een lage intrinsieke permeabiliteit voor ionen hebben. Er wordt geen macroscopische FLX waargenomen van prot liposomen gereconstitueerd met de proton-gekoppelde chloridetransporter, C-L-C-E-C een.

Aangezien de kleine hoeveelheid chloride die uit de vesco stroomt, een netto positieve lading in de liposome opbouwt, zorgt de toevoeging van CIN ervoor dat kaliumionen door het membraan kunnen bewegen, waardoor het elektrische potentieel wordt verlicht en chlorideflx wordt geïnitieerd. De reactie wordt beëindigd en de totale hoeveelheid chloride-ionen in de vesicles wordt gemeten om de eigenschappen van de enkele gereconstitueerde eiwitten te bepalen. De ruwe gegevens van het efflux-tijdsverloop worden eerst omgezet van millivolt naar een chlorideconcentratie en vervolgens genormaliseerd. Het tijdsverloop wordt vervolgens gefit.

Het werd vastgesteld dat de tijdsconstante van efflux 41 seconden is en de fractie van liposomen die nul actieve kopieën van C-L-C-E-C een bevatten, is punt 31, wat aangeeft dat ongeveer een derde van de liposomen nul actieve eiwitten bevatten. Uit deze waarden en het meten van het chloridegehalte van vesicles die minstens één kopie van C-L-C-E-C een bevatten, is het mogelijk om een unitaire transportrate van C-L-C-E-C een te bepalen die ongeveer 2.500 chloride-ionen per seconde is. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de noodzakelijke om