Name: Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal - Kanalen en Transporters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer hoe je transportactiviteit van gereconstitueerde chloridekanalen kwantitatief bepaalt met behulp van proteoliposomen en een chloridegevoelige elektrode. Deze methode meet de unitaire transportsnelheid en stoichiometrie van het actieve eiwitcomplex.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie GM085232 en een Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier-beurs (voor A.A.).

1. lipidepreparaat <ol><li> Aliquot de gewenste hoeveelheid lipiden in een heldere glazen buis. Gebruik E. coli polair lipide-extract, maar de meeste lipidesamenstellingen worden gebruikt. Indien lipiden in poedervorm, resuspendeer ze in chloroform tot een concentratie van 20 mg / ml. Droog de ​​lipiden bij KT onder N2-gas totdat al het oplosmiddel verdampt. </li><li> Resuspendeer de lipiden in pentaan en drogen weer een gestage stroom van gas N2 overgebleven sporen van chloroform te verwijderen. Droog totdat al het oplosmiddel verdampt. Tijdens het drogen voorzichtig zwenken de buis zodanig dat het lipide is verdeeld in een gelijkmatige film die het onderste derde van de buis in plaats van de vorming van een dichte massa onderin. </li><li> Voeg de reconstitutie buffer die detergens (300 mM KCI, 50 mM citroenzuur, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) de lipiden ontbinden. Gebruik andere milde wasmiddelen voor deze stap over als het eiwit is slecht tolerant CHAPS. </li><li> Resuspend de lipiden aan duidelijkheid met behulp van een waterbad sonicator. Dompel de buis in het midden van het water sonificator bad op maximaal vermogen in het kort (30 sec-1 min) pulsen met kort (30 sec-1 min) pauzeert. De oplossing moet helder worden. Opmerking: De uiteindelijke mate duidelijk mogelijk afhankelijk van de specifieke lipide samenstelling gebruikt. Sommige batch-to-batch variatie in deze stap, zelfs onder nominaal identieke lipiden, is eveneens mogelijk. Residuele waas door lichtverstrooiing door grote deeltjes in de suspensie, die kan worden verwijderd door centrifugatie. </li><li> Incubeer de geresuspendeerde lipiden bij kamertemperatuur gedurende 20-60 min. </li></ol> 2. proteoliposome Vorming OPMERKING: Verschillende strategieën kunnen worden toegepast om het detergens gesolubiliseerde proteïne te voegen in liposomen. Voor CLC-EC1 dialyse werkt goed en is daarom de methode van keuze 6,9,10. <ol><li> Voeg de gezuiverde eiwit aan het gewenste eiwit tot lipide (P / L) verhouding (uitgedrukt in pg o<html> F-eiwit / mg Lipid). De keuze van de P / L-verhouding afhankelijk van het doel van het experiment. <ol><li> Als het doel is om de activiteit van het eiwit van belang kan reconstitueren hoge P / L&#39;s om het signaal te maximaliseren, omdat elk liposoom bevat meerdere kopieën van het eiwit. Om de activiteit en / of unitaire transportsnelheid van het eiwit te kwantificeren, gereconstitueerde een Poisson verdunning regime lage P / L&#39;s, zodat elk vesikel gemiddeld 1 proteïne. Zie stap 7 en discussie voor een meer diepgaande analyse van toen aan elke regeling te gebruiken. </li></ol></li><li> Om de optimale P / L-waarden voor de verschillende regimes te bepalen voor een volledige titratie van de activiteit als functie van eiwitconcentratie 8,11-13. Voor elk eiwit waarvoor het molecuulgewicht (MW, uitgedrukt in kDa) van de actieve eenheid is bekend de volgende P / L-waarden worden gebruikt als initiële guesstimates: pg &quot;/&gt; <img alt="Vergelijking 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Laad het proteïne en lipide mengsel in een vooraf bevochtigde dialyse buis of een cassette. Plaats de dialyse inrichting in een bekerglas met 500-1,000x het volume van de lipide reconstitutie buffer (dat wil zeggen 1 liter buffer gedurende 1 ml lipide resuspensie) onder voorzichtig roeren. <ol><li> Wijzig buffer 3-4 keer om&gt; 3 uur. Bij elke oplossing verandering, was de cassette / buizen en de beker met gedestilleerd water en vul de beker met verse reconstitutie buffer. Omvatten 1-2 O / N-intervallen voor de oplossing verandering. Het exacte aantal en de duur van de oplossing verandert afhankelijk van de precieze lipide en detergenten gebruikt. </li></ol></li><li> Na de laatste stap is voltooid, verwijdert de liposomen van de dialyse vat, aliquot ze in buizen en flash invriezen in vloeibare N2 of bevriezen bij -80 ° C. </li></ol> 3. Opname Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NB: De opname opstelling (figuur 2A) bestaat uit twee kamers (platte bodem cilinders, ~ 3-4 ml volume), een Cl - (zie hieronder) elektrode, een pH-meter met een analoge of digitale elektrisch vermogen, een digitizer, en een computer met een passende acquisitie software. <ol><li> Sluit de Cl - elektrode om de pH meter, de uitgang van de pH-meter om de digitizer die is aangesloten op de computer. Plaats de referentie-elektrode in één kamer en de hercodering draad in de andere (figuur 2B). OPMERKING: De polariteit van de draden is correct als AV Cal (zie Stap 6.4 en 7.2) is positief. </li><li> Plaats de kamers op een roer plaat met een roerstaafje in de opname kamer (Figuur 1B). Zorg ervoor dat het roerstaafje niet de elektrode aanraken. </li><li> Sluit de camera&#39;s met behulp van een agar brug (Figuur 2B) (100 mM KCl en 2% agarose). Bewaar de Agar bruggen in 100 mM KCl. </li&gt; </ol> 4. Voorbereiding van de Cl - elektrode <ol><li> Neem een ​​oude en -possibly- niet-functionerende pH-elektrode. Breek het glas coating volledig onthullen de zilveren draden. </li><li> Verwijder de bekleding voorzichtig uit de zilveren draden met behulp van een scalpel. Maak de draden met overvloedige hoeveelheden H 2 O en EtOH. </li><li> Plaats in een verzadigde oplossing van FeCl3 (of bleekmiddel) tot draden bedekt met een uniforme donkere laag AgCl. </li></ol> 5. Bereiding van Unilamellaire Vesicles <ol><li> De nacht vóór de experimenten, zwellen 1 g Sephadex G-50 kralen in 15 ml externe buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citroenzuur, pH 4,5) onder zacht schudden (niet roeren) voor ten minste 3 uur bij kamertemperatuur vóór gebruik. Elk experiment vereist ~ 3 ml van gezwollen korrels. Houd de gezwollen korrels bij 4 ° C gedurende enkele dagen hooguit. </li><li> Terwijl de liposomen ontdooien bij kamertemperatuur, giet in elke kolom ~ 3 ml gezwollen G-50 kralen. Laat ze drogen door de zwaartekracht stroom bij RT; Dit duurt meestal 1-2 min. </li><li> Bereid unilamellaire blaasjes door het extruderen van de proteoliposomen 11 keer door een mini-extruder met een 0,4 m Teflon cutoff. </li><li> Plaats de kolom in een plastic ronde bodem buis. Spin de kolommen om overtollige oplossing te verwijderen. Centrifugeer gedurende 20-30 seconden bij 1400 xg in een klinische centrifuge. </li><li> Gooi doorstroom plaats kolom in een 13 x 100 mm glazen buis en voeg 100 ul van de geëxtrudeerde blaasjes aan de kolom. Spin kolom gedurende 1 min bij 500 xg in een klinische centrifuge. </li><li> Verzamel ~ 200 ul doorstroom die worden toegevoegd aan de opname kamer in stap 6.5. </li></ol> 6. Efflux Meting <ol><li> Plaats 2 ml van 100 mM KCl in de referentie (grond) kamer en 1,8 ml van de externe buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citroenzuur, pH 4,5) om de opname kamer. De lichte osmotische onbalans tussen de interneen externe oplossingen geen invloed </li><li> Start de acquisitie programma. Laat de basislijn in evenwicht, dit kan een paar minuten duren. </li><li> Zodra het signaal een stabiele basislijn (de liposomen zijn klaar en de kolommen drogen) bereikt, start de opname (figuur 3A). </li><li> Voeg 15 ul van 10 mM KCl oplossing voor het systeem (figuur 2A) te kalibreren. </li><li> Liposomen voegen. Een kleine sprong kan zichtbaar door de onvolledige verwijdering van externe Cl - van proteoliposomen (figuur 3A). Wacht maar tot de basislijn stabiliseert. </li><li> Voeg Valinomycin (1 ui 1 mg / ml in EtOH) om efflux (figuur 3A) te leiden. </li><li> Laat de uitstroom lopen het tijdsverloop tot het plateaus (Figuur 3A). </li><li> Voeg 40 ul van 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) bereid in de externe buffer om alle liposomen (Figuur 3A) oplossen. Stop de opname. </li></ol> 7. Data ANALYSE <ol><li> Het trace bestand exporteren uit in een ASCII of tekstformaat en importeren om de analyse programma naar keuze. </li><li> Meet de spanning op de volgende plaatsen (Figuur 3A): Aan het begin van de opname (0 V); Na toevoeging van het kalibreren puls (V cal); Na toevoeging van de liposomen (V lipo); Aan het einde van de efflux (V fin); Na toevoeging van detergens (V tot); Baseline de spanningen zodat V 0 = 0. </li><li> Gebruik de Nernst-Plank vergelijking om de experimentele waarde van te bepalen <img alt="Vergelijking 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> door meting <img alt="Vergelijking 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Wanneer Vol Cal is het volume van de kalibratiepuls in pl, 1800 wordt de volumekamer aan het begin van het experiment uitgedrukt1; l, [Cl] cal / in de Cl - concentraties van de kalibratiepuls en van de externe buffer in mm en AV cal is de sprong in mV gemeten na de kalibratiepuls. LET OP: Deze empirische bepaling van α dient drie doelen: het zorgt ervoor dat het systeem goed reageert, biedt een maat voor de consistentie van de reactie van het instrument tussen de experimenten, alsmede om te controleren dat er geen fouten zijn gemaakt in de oplossing maken. </li><li> Bereken de Cl concentraties na elke stap als volgt: <img alt="Vergelijking 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Vergelijking 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Vergelijking 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> De factor 3/400 komt van de verdunning van de 15 pl kalibratiepuls in de 2000 pl eindvolume. </li><li> Calculaten de veranderingen in [Cl] bij elke stap, ΔCl lipo / fin / tot. </li><li> Zet V (t) in Cl (t) met <img alt="Vergelijking 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Direct bepalen [Cl] waarden kritische punten en te vergelijken met de berekende waarden als een interne controle. </li><li> Normaliseren van de sporen, zodat de Cl rel lipo = 0 en Cl rel tot = 1 <img alt="Vergelijking 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Breng de efflux tijdsverloop aan de volgende vergelijking: <img alt="Vergelijking 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Waarbij L de snelheid van Cl - lek experimenteel wordt bepaald door Cl - efflux van eiwitvrije liposomen bereid onder dezelfde omstandigheden en τ de tijdconstante van het proces. </li><li> Bereken v, de beginsnelheid: Wanneer ΔCl vin wordt uitgedrukt in mM en V het volume van de kamer in ul. </li><li> Bereken het transport tarief / geleiding <img alt="Vergelijking 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> Waarbij p de P / L, MW is het molecuulgewicht van het actieve complex uitgedrukt in kDa </li></ol>

<ol><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14, 673-681 (2006).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Almo, S. C., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+and+faster%3A+improvements+and+optimization+for+mammalian+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).</li>
<li>Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cells+to+improve+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering cells to improve protein expression.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).</li>
<li>Accardi, A., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+active+transport+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> Nature. 427, 803-807 (2004).</li>
<li>Nguitragool, W., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+a+CLC+Cl-%2FH%2B+exchange+transporter+by+polyatomic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions.</a> J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).</li>
<li>Walden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+and+turnover+in+a+Cl-%2FH%2B+exchange+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter.</a> J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).</li>
<li>Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).</li>
<li>Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+required+for+H%28%2B%29%2FCl%28-%29+exchange+mediated+by+a+CLC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter.</a> Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).</li>
<li>Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+TMEM16A+is+sufficient+to+form+Ca2%2B+activated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nature Communications. 4, 2367(2013).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+of+substrate+binding+and+conservation+of+selectivity+in+the+CLC+family+of+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).</li>
<li>Stockbridge, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride+resistance+and+transport+by+riboswitch-controlled+CLC+antiporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr Biol. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Nimigean, C. M., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+block+and+permeation+in+a+K%2B+channel+of+known+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure.</a> J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).</li>
<li>Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+substrate+binding+determines+the+stoichiometry+of+transport+of+a+prokaryotic+H%28%2B%29%2FCl%28-%29+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger.</a> Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).</li>
<li>Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sided+functions+of+an+arginine-agmatine+antiporter+oriented+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes.</a> Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).</li>
<li>Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+a+prokaryotic+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).</li>
<li>Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function%3A+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).</li>
<li>Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride-dependent+interruption+of+the+transport+cycle+of+a+CLC+Cl%28-%29%2FH%28%2B%29+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter.</a> Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).</li>
<li>Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+fluoride-specific+ion+channels+with+dual-topology+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture.</a> Elife. 2, e01084(2013).</li>
<li>Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+nucleotide+modulated+prokaryotic+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 124, 7(2004).</li>
<li>Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK%2C+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K%2B+Ion+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li>
<li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+slow+CLC+Cl-%2FH%2B+antiporter+from+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Transport gemedieerd door gezuiverd anion-selectieve kanalen of transporteurs gereconstitueerd in liposomen - We hebben een gedetailleerd protocol om Cl te meten beschreven. Het voorbeeld gebruikt was de prokaryotische H + / Cl - wisselaar CLC-EC1. Echter, kan de methode gemakkelijk worden aangepast om kanalen afgesloten door liganden 12,13,15, 11,12 spanning of sportieve andere anionogene selectiviteit 15,16 door vervanging van de Ag bestuderen: AgCl elektrode met ...

In de laatste twee decennia is de mogelijkheid om overexpressie en te zuiveren membraan transporteiwitten is dramatisch toegenomen: ionkanalen, primaire en secundaire transporteurs worden nu routinematig gezuiverd van heterologe expressie systemen, alsmede natuurlijke bronnen. Nieuwe benaderingen te controleren meningsuiting, te verbeteren en de winning faciliteren en versterken de stabiliteit van deze eiwitten worden constant ontwikkeld 1-5. Deze technologische doorbraken zijn geweest bij het activeren van de explosie van atoom-niveau structurele informatie over membraaneiwitten die op zijn beurt verbeterde ons begrip van de structurele basis van hun functie is. Daarentegen ons vermogen sonderen de functionele eigenschappen van de gezuiverde eiwitten geen verhoging in hetzelfde tempo, zodat in sommige gevallen hoge resolutie structuurinformatie gepaard met kwalitatieve functionele gegevens, waardoor ons vermogen om kwantitatief te testen structuur gebaseerde voorspellingen beperkt. Vandaar dat de development van kwantitatieve en generaliseerbaar functionele assays is een belangrijke stap naar de ontrafeling van de mechanistische onderbouwing van membraaneiwit functie. Hier beschrijven we een efflux assay die kan worden gebruikt om kwantitatief belangrijkste functionele eigenschappen van gezuiverd en gereconstitueerd Cl - kanalen en transporters. De beginselen van de test kan worden gegeneraliseerd naar diverse transportsystemen, alsmede niet-ion transport eiwitten. Liposomen worden gereconstitueerd met gezuiverde Cl - kanaal / transporters in de aanwezigheid van een grote Cl - helling (figuur 1A, B). Cl - efflux wordt geïnitieerd door de toevoeging van een ionofoor om voor tegenion flux, in ons geval de K + ionofoor valinomycine, dat voldoet aan de Cl spanning shunt - gradiënt en het beginvolume membraanpotentiaal de evenwichtspotentiaal van K + 6,7. Zonder thij ionofoor geen significant netto Cl - efflux optreedt, zoals wordt voorkomen door het genereren van een transmembraanpotentiaal. De data wordt kwantitatief beschreven door twee meetbare parameters (figuur 1C): τ de tijdconstante van Cl - efflux en f0, de fractie van liposomen actief eiwit bevatten. Van τ en f 0 de unitaire Cl - transportsnelheid, kan de fractie van actief eiwit en de molecuulmassa van het actieve complex afgeleid 8. De techniek wordt hier geïllustreerd aan de hand proteoliposomen gereconstitueerd met CLC-EC1, een goed gekarakteriseerde CLC-type H + / Cl - wisselaar van bekende structuur en functie. Deze test wordt gemakkelijk gegeneraliseerd om kanalen of transporters met verschillende ionische selectiviteit of waarvan de activiteit afhankelijk van de aanwezigheid van spanning en / of liganden. Bovendien kan deze bepaling worden vastgesteld of kleine moleculen rechtstreeks de gereconstitueerde eiwit,om de effecten van deze verbindingen en hoe membraansamenstelling of lipidemodificerend reagentia invloed op de functie van de gereconstitueerde kanalen en transporters kwantificeren.

<table><tbody><tr><td>Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp;Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 Benchtop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter</td><td></td><td></td><td>Deze kunnen worden gevonden op Ebay.</td></tr><tr><td>Niet-functionele pH-sonde</td><td></td><td></td><td>Elke pH-meter sonde met zilveren draden zal werken. De glas/kunststof coating moet worden verwijderd en de draden schoongemaakt.</td></tr><tr><td>DI-710 Data Logger</td><td>DATAQ instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ acquisitiesoftware</td><td>DATAQ instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce wegwerpbare kunststof kolommen, zwaartekracht-flow, 2ml</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX Cultuurbuizen, Wegwerp, Borosilicaatglas</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>Extruder Set Met Houder/Verwarmingsblok</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een proteoliposome-based efflux assay om enkelmolecuul eigenschappen van cl bepaal<sup&gt; -</sup&gt; kanalen en transporters

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

De afgelopen 15 jaar zijn gekenmerkt door een explosie in de mogelijkheid om membraaneiwitten te overexpresseren en te zuiveren uit zowel prokaryotische organismen als uit eukaryoten. Deze toename is grotendeels gedreven door de succesvolle inspanningen om structurele informatie over membraaneiwitten te verkrijgen. Echter, de mogelijkheid om deze eiwitten functioneel te onderzoeken, is niet in dezelfde mate gevorderd en is vaak beperkt tot kwalitatieve tests met beperkte kwantitatieve waarde, waardoor de mechanistische inzichten die ze kunnen bieden beperkt blijven. Een test wordt beschreven om de transportactiviteit van gereconstitueerde Cl- kanalen of transporteurs kwantitatief te onderzoeken. De test is gebaseerd op de meting van de effluxsnelheid van Cl- uit proteoliposomen na toevoeging van het K+ ionofoor valinomycine om het membraanpotentiaal te shunten. Een ionengevoelige elektrode wordt gebruikt om de tijdsverloop van ionenefflux van proteoliposomen, gereconstitueerd met het gewenste eiwit, te volgen. De methode is zeer geschikt voor mechanistische studies, omdat het de kwantitatieve bepaling van sleuteleigenschappen van het gereconstitueerde eiwit mogelijk maakt, zoals de unitaire transportsnelheid, het percentage actieve eiwitten en de moleculaire massa van de functionele eenheid. De test kan ook worden gebruikt om het effect van kleine molecuulverbindingen die het gereconstitueerde eiwit direct remmen/activeren te bepalen, evenals om de modulatorische effecten van de membraansamenstelling of lipide-modificerende reagentia te testen. Waar mogelijk, werd een directe vergelijking tussen resultaten verkregen met deze methode in goede overeenstemming gevonden met die verkregen met elektrofysiologische benaderingen. De techniek wordt geïllustreerd met behulp van CLC-ec1, een CLC-type H+/Cl- uitwisselingssysteem, als modelsysteem. De efflux-test kan worden gebruikt om elke Cl- geleidende kanaal/transporteur te bestuderen en kan, met minimale wijzigingen, worden aangepast om elk ion-transporterend eiwit te bestuderen.

We beschrijven een gedetailleerd en robuust protocol om Cl te meten - transport gemedieerd door gezuiverd CLC-EC1, een prokaryotische CLC-type H + / Cl - wisselaar, gereconstitueerd in liposomen. Een schematische voorstelling van het experiment wordt getoond in figuur 3 proteoliposomen gereconstitueerd met gezuiverd CLC-EC1 en met hoge interne Cl -. Ondergedompeld in een bad oplossing die lage Cl -. Onder deze omstandigheden net Cl - effl...

Proteoliposomen worden gebruikt om gezuiverde kanalen en transporteurs te bestuderen die gereconstitueerd zijn in een goed gedefinieerde biochemische omgeving. Er wordt een experimentele procedure geïllustreerd om efflux gemedieerde door deze eiwitten te meten. De stappen om proteoliposomen voor te bereiden, de opnames uit te voeren en gegevens te analyseren om de functionele eigenschappen van het gereconstitueerde eiwit kwantitatief te bepalen worden beschreven.

Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal<sup&gt; -</sup&gt; Kanalen en Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Het algemene doel van deze procedure is om de transportactiviteit van gereconstitueerde chloridekanalen of transporters kwantitatief te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de zuivere, gezuiverde transporter bij een lage dichtheid te reconstitueren in liposomen, zodat elk liposoom na verwijdering van de externe chloride-ionen — om een naar buiten gericht ionengradiënt te creëren — nul of één kopie van het actieve complex bevat. De liposomen worden vervolgens toegevoegd aan de meetkamer, waar de chlorideconcentratie wordt gemonitord met een chloridesensitieve elektrode. Vervolgens wordt de chlorideflux uit de liposomen geïnitieerd door toevoeging van Valinomycine, een kaliumionofoor, wat het membraanpotentiaal opheft.Zodra het signaal een stabiele toestand bereikt, wordt het experiment beëindigd door toevoeging van detergent om de liposomen op te lossen. Uiteindelijk is het, door het meten van de snelheid van chloride-efflux uit proteoliposomen die zijn gereconstitueerd met een gezuiverd kanaal of transporteiwit, mogelijk om de unittestaire transportsnelheid en de stoichiometrie van het actieve eiwitcomplex kwantitatief te bepalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande benaderingen, zoals op fluorescentie gebaseerde fluxmetingen, is dat het met deze techniek mogelijk is om sleutelparameters van het gereconstitueerde transporteiwit kwantitatief te bepalen, zoals de unittestaire omzetsnelheid en de geometrie van het complex.Naast het leveren van kwantitatieve maten van deze sleutelparameters, kan deze methode worden gebruikt om het effect van kleine moleculen bij mutaties snel en nauwkeurig te bepalen, en om subunits in het gereconstitueerde transporteiwit te monitoren. De registratie-opstelling bestaat uit twee kamers, een chloride-elektrode, een pH-meter met een analoge of digitale elektrische output, een digitizer en een computer met geschikte acquisitiesoftware. Sluit de chloride-elektrode aan op de pH-meter en verbind vervolgens de output van de pH-meter met de digitizer, die is aangesloten op de computer.Plaats de referentie-elektrode in de ene kamer en de registratiedraad in de andere. Plaats vervolgens de kamers op een roerplaat met de roerstaaf in de registratiekamer. Zorg ervoor dat de roerstaaf de elektrode niet raakt.Verbind de kamers met een agarbrug op de avond vóór de experimenten. Laat één gram Cidex G 50-kralen zwellen in 15 milliliters extern buffer onder zachte schudding gedurende ten minste drie uur bij kamertemperatuur voor gebruik. Voor elk experiment zijn ongeveer drie milliliters gezwollen kralen nodig, terwijl de liposomen ontdooien bij kamertemperatuur. Giet ongeveer drie milliliters gezwollen G 50-kralen in elke kolom.Laat ze door zwaartekracht drogen. Laat dit op kamertemperatuur gebeuren. Dit duurt gewoonlijk één tot twee minuten.Bereid vervolgens unilamellaire vesicles voor door de proteoliposomen 11 keer door een mini-extruder te persen met een Teflon-cutoff van 0,4 micron. Plaats de kolom vervolgens in een plastic centrifugebuis met ronde bodem en centrifugeer deze 20 tot 30 seconden bij 1400 G in een klinische centrifuge om overtollige oplossing te verwijderen. Plaats daarna, terwijl de doorstroom wordt bewaakt, de kolom in een glazen buis van 13 bij 100 millimeter en voeg 100 microliters van de ge-extrudeerde vesicles toe aan de kolom.Centrifugeer de kolom gedurende één minuut bij 500 G. Verzamel in een klinische centrifuge ongeveer 200 µL van het doorstroomvolume om dit aan de meetkamer toe te voegen. Om de effluxmeting uit te voeren, plaatst u 2 mL 100 mM kaliumchloride in de referentiekamer en 1,8 mL van de externe buffer in de meetkamer. Start het acquisitieprogramma.Laat de basislijn stabiliseren. Dit kan enkele minuten duren. Zodra het signaal een stabiele basislijn bereikt, start u met de opname.Voeg 15 µL van een kaliumchloride-oplossing met een bekende molariteit toe om het systeem te kalibreren. Voeg vervolgens de liposomen toe. Er kan een kleine sprong zichtbaar zijn door onvolledige verwijdering van extern chloride uit de protea-liposomen.Wacht tot de basislijn stabiliseert. Voeg vervolgens CIN toe om flx te initiëren. Laat de FLX het tijdsverloop doorlopen tot er een plateau wordt bereikt.Voeg op dit punt 40 µL van 1,5 M bèta-octylglucoside toe, bereid in de externe buffer, om alle liposomen op te lossen. Wacht vervolgens 10 tot 15 seconden. Stop de opname en ga over tot de data-analyse zoals beschreven in het tekstprotocol.Wanneer liposomen met een hoge interne chlorideconcentratie worden ondergedompeld in een lage chlorideconcentratie, waardoor een chloridegradiënt van 300-voud ontstaat, wordt er geen netto-ionenstroom waargenomen. Dit komt doordat eiwitvrije liposomen een lage intrinsieke permeabiliteit voor ionen hebben. Er wordt geen macroscopische FLX waargenomen bij proteoliposomen gereconstitueerd met de protongekoppelde chloride-transporter, C-L-C-E-C one.Omdat de kleine hoeveelheid chloride die de vesikel verlaat een netto positieve lading in het liposoom opbouwt, maakt de toevoeging van CIN het mogelijk voor kaliumionen om door het membraan te bewegen, waardoor het elektrisch potentiaal wordt opgeheven en de chlorideflux wordt geïnitieerd. De reactie wordt beëindigd en de totale hoeveelheid chloride-ionen in de vesikels wordt gemeten om de eigenschappen van de individuele gereconstitueerde eiwitten te bepalen. De ruwe gegevens van het efflux-tijdverloop worden eerst omgezet van millivolts naar een chlorideconcentratie en vervolgens genormaliseerd, waarna het tijdverloop wordt gefit.Er werd vastgesteld dat de tijdconstante van de efflux 41 seconden bedraagt en dat de fractie liposomen die nul actieve kopieën van CLCEC1 bevatten 0,31 is, wat aangeeft dat ongeveer een derde van de liposomen geen actieve eiwitten bevat. Op basis van deze waarden en door het chloridegehalte van vesicles te meten die ten minste één kopie van CLCEC1 bevatten, is het mogelijk om een eenitaire transportsnelheid van CLCEC1 te bepalen die gelijk is aan ongeveer 2.500 chloride-ionen per seconde. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe de omzetsnelheid van een transporter kan worden bepaald. Deze experimenten kunnen in 10 tot 15 minuten worden uitgevoerd wanneer ze zorgvuldig worden uitgevoerd.Het is van cruciaal belang om de kwaliteit van de liposomen zorgvuldig te beoordelen, aangezien lekken de schattingen van de turnoverrate nadelig beïnvloeden.

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.

Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Dit protocol details een methode voor de kwantitatieve meting van peptide translocatie in grote unilamellaire lipide blaasjes. Deze methode biedt ook informatie over de snelheid van de membraan translocatie en kan worden gebruikt om peptiden die efficiënt en spontaan kruisen lipidendubbellagen te identificeren.

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

We presenteren een protocol voor het in vitro onderzoek van effluxpompen van Pseudomonas aeruginosa. Dit protocol maakt het genereren van een sterke, reversibele en afstembare proton gradiënt in het liposoom membraan en dus moet aanpasbaar aan elke membraaneiwit bekrachtigd door protomotive kracht.

In vitro onderzoek naar de MexAB Efflux Pomp Van Pseudomonas aeruginosa

Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

Het gepresenteerde protocol beschrijft de analyse van membraaneiwitgemedieerde transport op het niveau van enkelvoudige transporteurs met behulp van porie-overspande, oplosmiddelvrije lipide dubbellagen. Dit wordt bereikt door de creatie van in grote aantallen geproduceerde nanopore-arraychips, gecombineerd met zeer parallelle dataverwerving en analyse, waardoor de toekomstige vestiging van membraaneiwiteffectorscreenings mogelijk wordt.

Membraan transportprocessen geanalyseerd door een Highly Parallel Nanopore Chip System aan Single Protein Resolution

We beschrijven een op fluorescentie gebaseerde assay om fosfolipide-scrambling in grote unilamellaire liposomen gereconstitueerd met opsine te meten.

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3  als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

Nanobodies zijn belangrijke hulpmiddelen in de structurele biologie en vormen een groot potentieel voor de ontwikkeling van therapieën. De selectie van nanobodies met remmende eigenschappen kan echter een uitdaging zijn. Hier demonstreren we het gebruik van solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie voor de classificatie van remmende en niet-remmende nanobodies gericht op elektrogene membraantransporters.

Selectie van transporter-gerichte remmende nanobodies door solid-supported-membrane (SSM)-gebaseerde elektrofysiologie

We presenteren een kosteneffectieve methode voor het beoordelen van liposomale membraanpermeabiliteit met een superieure gevoeligheid en resolutie ten opzichte van conventionele technieken. Met behulp van een nieuwe ingekapselde ligandsubstitutiereactie detecteert deze techniek fosfolipase A 2-geïnduceerde veranderingen in modelmembranen. Deze toegankelijke benadering kan eenvoudig worden geïntegreerd met standaardanalyses en verbetert de resolutie voor het bestuderen van membraanbiofysica en...

Een liposoommembraanpermeabiliteitstest voor het onderzoeken van de effecten van fosfatidylinositolfosfaatgroepen op de membraneutrope werking van gif PLA2

Leer hoe je transportactiviteit van gereconstitueerde chloridekanalen kwantitatief bepaalt met behulp van proteoliposomen en een chloridegevoelige elektrode. Deze methode meet de unitaire transportsnelheid en stoichiometrie van het actieve eiwitcomplex.

Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal

Meer video's verkennen