Name: Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer hoe je hechtende cellen voorbereidt voor röntgenfluorescentiebeeldvorming via chemische fixatie. Dit protocol toont het gebruik van siliciumnitridevensters en synchrotronanalyse voor het in kaart brengen van metaalverdeling in cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Stefan Vogt voor zijn hulp bij het passen van de representatieve gegevens die in dit artikel worden getoond, en voor nuttige discussies. De auteurs danken ook Chris Jacobsen voor zijn ondersteuning aan Q. J. 
Gebruik van de Advanced Photon Source, straallijnen 2-ID-E en 8-BM-B, in het Argonne National Laboratory werd ondersteund door het U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, onder Contract No. DE-AC02-06CH11357.

1. Voorbereiding van de instrumenten, Substrates, Cultuur Media en Schotels <ol><li> Behandeling van Siliciumnitride (Si 3 N 4) ramen. <ol><li> Open de capsule enigszins door uitknijpen ene uiteinde met het venster op zodanige wijze dat het raam zelf niet knijpen, terwijl het draaien van de andere kant van de capsule met de andere hand. </li><li> Check een paar omgekeerde, puntig pincet onder stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen lijm, gaten of bochten aan het uiteinde. Anders kunnen de ramen worden gebroken door de pincet of vliegen van hen tijdens de volgende stappen. </li><li> Haal het venster uit de capsule door voorzichtig grijpen het kader van het venster met een pincet, terwijl knijpen de capsule aan de bovenrand aanbrengen van druk in een richting om de capsule breder te maken wanneer de randen van het raam moet komen. </li></ol></li><li> Venster pre-wash (optioneel). <ol><li> Indien gewenst, voorwas ramen door ze voorzichtig te dompelenin gedestilleerd water gedurende 5 seconden, gevolgd door 2 minuten wassen in 70% ethanol en 2 minuten wassen in 100% ethanol. </li></ol></li><li> Het aanbrengen en het steriliseren van ramen aan de cultuur schotel. <ol><li> Om de ramen aan te brengen, stelt u het venster met de platte kant naar boven op de bodem van de cultuur schotel, leg een stukje tape op een schoon glasplaatje. Snijd ongeveer een kwart inch strip af langs de lange zijde van de tape. Neem een ​​stukje tape uit de korte zijde (bij ⅛ &quot;met ¾&quot;) met een schone scheermesje. </li><li> Gebruik pincet om het stukje tape toepassing op de rand van het rooster of raam. Gebruik voldoende om veilig te houden zonder die de raamopening zelf. Manipuleren van de gehandeld tape met een pincet, stelt het raam naar beneden op de bodem van de cultuur schotel. Gebruik de punt van de pincet tape hechten aan de bodem van de kweekschaal stevig. </li><li> Breng een strip aan de andere rand en zich deze aan de onderzijde verbonden met het uiteinde van de pincet. </li><li> Zodra alle ramen zijnafgeplakt, steriliseren ramen in de cultuur gerechten met ultraviolet (UV) straling. Dit te bereiken door het plaatsen van de schotel onder de UV lamp in een laminaire stroming kap voor ongeveer 1 uur. </li><li> (Optioneel) Als ramen zijn om vooraf worden bekleed met poly-lysine, hoeft dus volgende venster sterilisatie. Coat het raam met 10 ul steriel 0,01% poly-L-lysine oplossing gedurende 1 uur in een 37 ° C incubator, en spoel de resterende oplossing weg het kweekmedium. </li></ol></li><li> Bereid buffers voor de laatste wasbeurt voordat XFM. <ol><li> Bereid ofwel een Tris-glucose of piperazine-N, -sucrose N-bis (ethaansulfonzuur) (PIPES) vrij van sporenmetalen met osmolariteit en pH equivalent aan Dulbecco&#39;s fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) buffer zonder calcium en magnesium. Gebruik een van deze buffers aan cellen te spoelen na cellen chemisch worden gefixeerd. <ol><li> De Tris-glucose-oplossing (10 mM Tris, 260 mM glucose, 9 mM azijnzuur,) maak voeg 1,4 g glucose, 36 mg Tris base en16 gl azijnzuur 20 ml ultrazuiver water. Dan passen uiteindelijke volume tot 30 ml met ultrapuur water. Geen pH aanpassing nodig. Bewaren bij kamertemperatuur tot een week. </li><li> Te maken de leidingen-sucrose (20 mM PIPES, 200 mM sucrose) toe te voegen 0,18 g van leidingen en 2,0 g sucrose tot 20 ml van ultrapuur water en breng de pH op 7,4 met kleine hoeveelheden geconcentreerd azijnzuur. Dan passen uiteindelijke volume tot 30 ml met ultrapuur water. Bewaren bij kamertemperatuur tot een week. OPMERKING: De reden om het gebruik van PBS in het naspoelen is dat de concentratie van fosfaat, chloride en kalium in PBS zo hoog dat het kan interfereren met XFM als deze niet volledig verwijderd voordat de lucht drogen. </li></ol></li></ol></li><li> Bereid buffers voor mobiele plating. <ol><li> Bereid of neem alle media zoals RPMI medium 1640, 1x trypsine-EDTA-oplossing, D-PBS, en andere reagentia nodig voor de bepaalde hechtende cellijn wordt normaal gedaan passage van de hechtende cellen of belang en warm ze tot 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Het plateren van Cellen <ol><li> De gesteriliseerde kweekschaal met de ramen in de laminaire stroming kap voorzichtig medium (10 ml voor een 100 mm kweekschaal) toe, langs de kant van de kweekschaal met het scheef staat. Vermijd onnodige oppervlaktespanning of het laten vallen van de media direct op het oppervlak van siliciumnitride ramen. Omdat de media wordt toegevoegd, langzaam verlichten van de kantelhoek om de vacht van het net en het venster met de media. </li><li> Bereid de aanhanger cellijn van belang adequaat, trypsinizing of schrapen van de cellen af ​​van de platen zoals gebruikelijk voor passage van de cellijn. Voer een cel tellen, of andere voorbereiding nodig voor het aanbrengen van de cellen aan de verse plaat. </li><li> Cellen toe te voegen aan de cultuur schotel met ramen bij een celdichtheid die nodig is om 50% -70% samenvloeiing meestal bereiken binnen 24-72 uur, en incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. </li&gt; <li> Let groei van de cel af, met een omgekeerde lichtmicroscoop, totdat de gewenste celdichtheid (gewoonlijk 50% -70% confluentie) bereikt. </li></ol> 3. Fixatie van Cellen <ol><li> Bereid vers 4% paraformaldehyde in D-PBS door verdunning van een voorraad gekocht (bijvoorbeeld 25% paraformaldehyde) en de pH op 7,4 met azijnzuur (niet te verhogen overmaat natrium te voegen). </li><li> Wanneer cellen werden gekweekt zoals gewenst, en alle vitale vlekken (zoals Hoechst) zijn toegepast en afgebeeld, verwijder de media door zachte aspiratie, kantelen van de schotel 45 ° hoek enerzijds en aanzuigen hand pipet met de andere . OPMERKING: In plaats van pipetteren besteed media, een alternatief is om het venster te halen, dompel het raam in microcentrifugebuisjes met D-PBS twee keer en leg het in een nieuwe cultuur schip met een fixatief oplossingen gedurende 20 min gevolgd door 2 maal PBS wassen de resterende fixeermiddelen verwijderen. Als dit wordt gekozen, gaat directly stap 3.5. </li><li> Spoel de schotel voorzichtig met D-PBS en onmiddellijk vervangen de verwijderde vloeistof door voorzichtig toevoegen van de verse 4% PFA / PBS terwijl het gerecht in een hoek van 45 °, pipetteren in de richting van de kant van de schotel, en langzaam het ontspannen van de kantelhoek om de fixeeroplossing ter dekking van de ramen. Houd de cellen bedekt met fixatief 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de vloeistof door zachte aspiratie, opnieuw zoals hierboven, het kantelen van de schotel lichtjes en opzuigen met de hand. </li><li> Vervang de verwijderde vloeistof door voorzichtig toevoegen van een aantal van de leidingen / sucrose-oplossing, met behulp van het kantelen en pipetteren methode in stap 3.3 beschreven. </li><li> Herhaal stap 3.4 en 3.5. </li><li> Bereid de materialen drogen. <ol><li> Verzamel-pluizende handdoeken zoals Kimwipes, en trek een out of the box, dus het is handig zeer snel en gemakkelijk. </li><li> Bereid een schone, niet-niveau plaats te zetten het raam te drogen. Stel een rubberen mat raster van de soort gebruikt in elektronenmicroscopie, die ribbels heeft zohet raam kan worden gestut aan één uiteinde terwijl het droogt. Het venster houden komen te zitten aan het droogoppervlak als het droogt en afvoer resterende buffer aan de rand van het monster. </li></ol></li><li> Tweeze de tape bevestigd aan het venster om het venster maximaal uit de vloeistof zorgvuldig. Ophalen ramen die off van de band komen door toepassing van een kleine hoeveelheid van de leidingen / sucrose om hen te drijven en dan ze op te pakken met het omgekeerde pincet. </li><li> Zorgvuldig (zonder het raam zelf) en grondig pleisteren overtollige PIPES / sucrose uit de rand van het venster met een Kimwipe. Ook bekladden de rug ingesprongen gebied met behulp van een afgeronde plooi van een Kimwipe. Opmerking: Het doel is om zo weinig kristallisatie van zouten of buffers op het oppervlak van het scherm mogelijk. </li><li> Plaats het raam op de grid mat. Zorg ervoor dat het venster niet wordt plat op de grid mat, maar gestut op een rand (met behulp van de ruggen van de grid mat) en zo weinig van het net te rakenmat mogelijk. Laat het raam droog. </li></ol> 4. Steekproef Montage en Imaging <ol><li> Zodra het monster droog is, controleert de aanwezigheid van cellen op de ramen met behulp van een lichtmicroscoop. Voer deze controle, voor de voorbereiding van de monsters voor vervoer naar een synchrotron. </li><li> Verpak de ramen voor het transport naar de synchrotron beamline hosten van uw experiment. Voorzichtig aanbrengen ramen met tape aan twee zijden een glasplaatje, dan brengt het glaasje met tape aan de onderkant van een plastic petrischaal. Tape de petrischaal dicht. OPMERKING: Voorafgaand aan dit punt, deze stappen kunnen worden uitgevoerd in elke typische lab uitgevoerd. De volgende stappen kunnen het best worden gedaan op een synchrotron beamline. </li><li> Verwijder de tape van het raam voorzichtig met een pincet. Gebruik nagellak, in een dunne gelijkmatige laag aan de rand van het venster, de ramen bevestigen aan een aluminium houder door de bundellijn medewerkers synchrotron. </li><li> Plaats de aluminium houder ineen kinematische monteren, en plaats het in de juiste positie in de X-ray microscoop. Monteer het monster op een console aan te sluiten op gemotoriseerde podia, binnen de steekproef kamer bij de beamline. </li><li> Nadat het monster röntgenmicroscoop instrument gebied (een hok gemaakt van met lood gevulde muren), het instellen van de scan te verlaten. Met bundellijn-specifieke software, kiest het juiste gebied van het monster te scannen, terwijl het bekijken van de positie van de röntgenbundel op het monster met een camera uitgerust met een video dradenkruis en pre uitgelijnd met een stroomafwaartse scintillator camera. </li><li> Kies de juiste resolutie voor het monster, op basis van een schatting van de omvang van de kleinste kenmerk van belang. Voor beeldvorming van enkele zoogdiercellen (~ 20-40 micrometer in grootte), gebruik dan een resolutie van 0,25-0,5 urn. Voor beeldvorming gebied van weefsels en onderscheiden cellagen van elkaar, gebruik een oplossing van 2-20 urn. </li><li> Kies de juiste verblijftijd voor de steekproef, gebaseerd op een schatting van de hoeveelheid van de ontmoetingal van belang aanwezig is. Voor een snel overzicht scan, of wanneer grote hoeveelheden metalen aanwezig zijn, gebruik dan vlieg scans met verblijftijden van 30-300 msec per pixel. Als weinig materiaal aanwezig is, of om metalen van lage relatieve overvloed te meten, gebruiken stap scans met verblijftijden van 1-2 sec per pixel. </li><li> Programmeren van de scans in de beamline-specifieke software. Verwerven van een rasterafbeelding-scan. Werken samen met de beamline medewerkers om de gegevens met software die de karakteristieke energie pieken zal voor elke element analyseren. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

X-stralen fluorescentie beeldvorming is bruikbaar in vele gebieden, met inbegrip van aardwetenschappen, materiaalkunde, en chemische biologie 26-34. Vooruitgang in synchrotron X-stralen, en de nadruk hebben zeer hoge intensiteit balken geproduceerd. Gerichte röntgenstralen voldoende om de endogene metalen in cellen bestaan ​​nu wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige silicium drift detector technologie. En bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met n...

X-ray fluorescentie beeldvorming maakt zowel de identiteit en hoeveelheid van elementen in een monster ruimtelijk worden opgelost. Invallende röntgenstraling, van een energie groter gekozen dan het elektron bindingsenergie van het zwaarste onderdeel van belang, overwonnen de bindingsenergie van binnenste electronen naar de kern 1. Hierdoor ontstaat een &#39;gat&#39; in het elektron shell. Als hogere energie elektronen vallen in deze gaten worden fluorescente röntgenstraling waarvan de golflengte afhangt van de energie scheiding van deze orbitalen. Aangezien de energie afstand van de orbitalen is kenmerkend voor een bepaald element, de röntgenfluorescentie emissie ook karakteristieke golflengten, afhankelijk van het element. Hierdoor emissie bij een karakteristieke golflengte die de identificatie van de aanwezige elementen toelaat. Kalibratie van de fluorescentie-intensiteit maakt de kwantificering van de aanwezige elementen. X-ray fluorescentie microscopy (XFM) is in toenemende mate benut, mede door de ontwikkeling van zeer briljante X-ray synchrotron bronnen, zoals die bij Spring-8 in Japan, de Europese Radiation Synchrotron Facility (ESRF) in Frankrijk, en de Advanced Photon Source ( APS) in de US 2. Deze bronnen bieden zeer hoge intensiteit röntgenstralen. Tegelijkertijd, verbetering röntgenoptiek, zoals zoneplaat technologie, kon de concentratie van deze bundels op submicron spots, zij het ​​wat inefficiënt 3. Met zeer hoge intensiteit balken, een betrekkelijk kleine hoeveelheid licht kan worden gericht voldoende om de endogene metalen in cellen wekken, produceert signaal dat kan worden gemeten met de huidige detectortechnologie. Aldus bestuderen van de chemische biologie van metalen in de cel een applicatie met name gebruik van veel van de recente ontwikkelingen in deze techniek maakt 4-10. Er zijn veel kritische factoren worden beschouwd, terwijl appliggend XFM de elementaire verdeling en kwantificering van gekweekte zoogdiercellen of andere biologische monsters te onderzoeken. Ten eerste moet het monster intact te blijven, zowel structureel als wat betreft de elementaire samenstelling, zodat de meting zinvol zijn. Ten tweede moet het monster worden bewaard andere manier zodat het winterhard tot stralingsschade die kan worden veroorzaakt door een gerichte röntgenbundel. Een manier die een monster kan aan deze beide criteria tegelijk is om snel tot een glasachtig, amorfe ijs 11,12 worden bevroren. Snel invriezen wordt vaak bereikt door middel van verschillende cryopreservatie technieken zoals invallend bevriezing of hoge druk invriezen 13-16. Het is algemeen aanvaard dat cryopreservatie bewaart totale cellulaire architectuur en de chemische samenstellingen in biologische monsters dicht natieve toestand mogelijk. Chemische fixatie, anderzijds, vanwege de langzame en selectieve penetratie van fixeermiddelen in cellen en weefsels well als latere wijzigingen in membraanpermeabiliteit, kunnen verschillende cellulaire ionen vooral de diffundeerbare ionen zoals Cl, Ca en K worden uitgeloogd, verloren of verplaatst, dus waardoor het onderzoek van deze elementen suboptimale 17-19 mogelijk te maken. Ondanks het duidelijke voordeel van cryo-fixatie dan chemische fixatie in het algemeen, voor adherente cellen van zoogdieren in het bijzonder, cryopreservatie heeft verschillende beperkingen 20-23. De meest voor de hand liggende is dat niet elk onderzoek lab heeft een gemakkelijke toegang tot cryopreservatie instrumenten. De meeste huidige hoge druk diepvriezers of zelfs dompelen vriezers zijn kostbaar en bezit alleen een subset van cryo faciliteiten, ver van waar cellen worden geïncubeerd zijn. Het voordeel van cryopreservatie zou kunnen worden verhandeld voor het nadeel van reizen spanning geplaatst op de cellen. Dus, terwijl cryopreservatie is zeker de meest rigoureuze manier om monsters voor X-stralen fluorescentie analyse te bewaren, het is zeker niet de meest toegankelijk is voor alle onderzoekers onder alle omstandigheden;noch is het essentieel - als de metalen worden strak gebonden aan fixeerbaar macromoleculen en de resolutie waarmee het monster wordt afgebeeld groter is dan de schade aan de ultra-microstructuur die kunnen optreden tijdens het drogen. Indachtig de kanttekeningen 24, kan chemische fixatie en drogen een geschikte keuze te zijn. Andere factoren in een succesvolle röntgenfluorescentie imagingexperiment omvatten juiste analyse. X-stralen fluorescentie beeldvorming is fundamenteel X-ray fluorescentie-emissie spectroscopie gecombineerd met raster-scan om ruimtelijke resolutie bieden. De X-ray fluorescentie-emissie spectra verzameld bevatten een combinatie van overlappende emissie pieken, achtergrond, en de elastische en inelastische verstrooiing toppen van de invallende bundel. Software die de de-convolutie van deze bijdragen, en de montage van de uitstoot pieken mogelijk maakt, is een kritische ontwikkeling van dit gebied 25. Ook de ontwikkeling en commerciële distribution van dunne-film standaarden van bekende samenstelling, gebruikt voor fluorescentie-intensiteit ten opzichte materiaalhoeveelheid calibreren is ook belangrijk geweest. Dit protocol geeft een beschrijving van de bereiding van hechtende cellen door chemische fixatie en drogen aan de lucht. Een essentiële stap in dit proces is de groei van de cellen op het siliciumnitride ramen, die vaak niet goed hechten, waardoor zacht spoelen op een bepaalde wijze sleutel tot succes.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride windows</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Bestel op maat. Membraanmaat: 1.5 mm x 1.5 mm. Dikte: 200&nbsp;nm. Lijstmaat: 5&nbsp;mm x 5 mm. Lijstdikte: 200 &micro;m.</td><td>Alternatieve bron: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Omgekeerde pincet</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &ndash; Ultra Fine Pincet</td></tr><tr><td>Rubber rastermat</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Ronde rastermat</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>geconcentreerd azijnzuur met sporenmetalen</td></tr><tr><td>PIPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>vaste PIPES buffer</td></tr><tr><td>Formaldehyde stockoplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gratis: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampullen van 20% waterig paraformaldehyde</td></tr></tbody></table>

het voorbereiden hechtende cellen voor x-stralen fluorescentie beeldvorming door chemical fixatie

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Röntgenfluorescentiebeeldvorming stelt ons in staat om de ruimtelijke verdeling en concentratie van meerdere elementen gelijktijdig non-destructief te meten over grote of kleine monsteroppervlakken. Het is toegepast op vele gebieden van de wetenschap, waaronder materiaalkunde, geowetenschappen, het bestuderen van cultureel erfgoed en in chemische biologie. In het geval van chemische biologie, bijvoorbeeld, maakt het visualiseren van de metaalverdelingen binnen cellen het mogelijk om zowel van nature voorkomende metaalionen in de cellen als exogene geïntroduceerde metalen zoals medicijnen en nanodeeltjes te bestuderen. Vanwege de volledig gehydrateerde aard van bijna alle biologische monsters, vertegenwoordigt cryo-fixatie gevolgd door beeldvorming onder kryogene temperaturen de ideale beeldvormingsmodaliteit die momenteel beschikbaar is. Wanneer een dergelijke combinatie echter niet gemakkelijk toegankelijk of praktisch is, blijft aldehyde-gebaseerde chemische fixatie nuttig en soms onvermijdelijk. Dit artikel beschrijft zo gedetailleerd mogelijk de voorbereiding van adherente zoogdiercellen door chemische fixatie voor röntgenfluorescentiebeeldvorming.

Het vermogen van X-stralen fluorescentie beeldvorming om informatie over biologische monsters is afhankelijk van deze monsters wordt bereid zodanig dat ze robuust stralingsschade op de tijdschaal van het experiment, en toch hun chemische en structurele karakteristieken goed behouden. Bij bekijken van de resultaten van een monster dat is bereid zoals hierboven is beschreven en afgebeeld, is het mogelijk dat er variatie in de onderhavige elementen - aangeeft dat fixatie behouden deze aspecten van de cel (figuur 1)...

Hier presenteren we een protocol over hoe de hoeveelheid en verdeling van metalen in een monster kan worden bepaald met behulp van synchrotron X-ray fluorescentie. We richten ons op adherante cellen en beschrijven de chemische fixatiemethode om dit monster voor te bereiden. Vervolgens beschrijven we hoe het monster kan worden gemonteerd en beeldvorming kan worden uitgevoerd met behulp van synchrotron X-stralen.

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Het algemene doel van deze procedure is het in beeld brengen van de distributie van metalen in een celpopulatie. Dit wordt bereikt door eerst steriele siliciumnitride vensters voor te bereiden en vervolgens cellen op deze vensters te kweken. Daarna worden de cellen gefixeerd, gespoeld in een compatibele buffer en gedroogd.De laatste stap is het afbeelden van de cellen bij de beamline. Uiteindelijk wordt röntgenfluorescentiemicroscopie gebruikt om de distributie van metalen in de cel aan te tonen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien de vensters zeer fragiel zijn.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het kweken van cellen op de vensters met minimale celaggregatie, evenals de spoelstappen, complex zijn omdat cellen niet goed hechten aan de röntgenfluorescente substraten. De eerste taak is het isoleren van het venster. Controleer eerst met een stereoscoop of een pincet met omgekeerde fijne punten recht is uitgelijnd en schoon is.Open vervolgens de capsule met het venster een klein beetje. Knijp in het uiteinde met het venster terwijl u het andere uiteinde draait. Knijp niet in het venster zelf.Pak vervolgens het frame voorzichtig vast met de pincet terwijl u de capsule zachtjes samenknijpt nabij het geopende uiteinde. Oefen druk uit om de capsule te verbreden op de plek waar de randen van het venster naar buiten moeten komen en verwijder het venster. Bereid nu wat plakband voor.Plak een stukje plakband op een schone objectglas en snijd een strook plakband van een kwart inch af langs de lange zijde van het objectglas. Plaats vervolgens een stuk plakband op de korte zijde en verwijder het gedeelte plakband met de pincet. Breng het plakband aan op de rand van het venster met voldoende kracht om het te laten hechten, waarbij u er voorzichtig op let dat de opening van het venster niet met plakband wordt afgedekt.Plaats het venster met de pincet op de bodem van een kweekschaal en druk de tape stevig op de schaal aan. Herhaal dit proces vervolgens om de andere zijde van het venster vast te plakken. De schaal moet nu gedurende een uur met UV worden gesteriliseerd.Dit protocol vereist dat cellen worden gekweekt tot een confluentie van 50 tot 70% op schaaltjes die zijn voorzien van het bijgevoegde venster. Eventuele vitale kleurstoffen moeten worden aangebracht en de cellen moeten worden gefotografeerd voordat men overgaat tot fixatie. Verwijder het medium door voorzichtig te aspireren terwijl het schaaltje in een hoek van 45 graden wordt gekanteld.Spoel de schaal vervolgens voorzichtig af met DPBS. Vervang de verwijderde vloeistof onmiddellijk door voorzichtig verse 4%P-F-A-P-B-S toe te voegen onder een hoek van 45 graden en tegen de zijkant van de schaal. Verminder de hoek langzaam zodat de fixeeroplossing de vensters bedekt.Laat het fixatiemiddel na de fixatie gedurende 20 minuten op de cellen inwerken. Verwijder de vloeistof door voorzichtig af te zuigen. Vervang de vloeistof vervolgens met pipetten, waarbij dezelfde voorzichtige techniek als voorheen wordt toegepast.Sucroseloplossing. De techniek voor het verwijderen en vervangen van de vloeistof is cruciaal, omdat de cellen niet goed hechten aan de substraten. Dit is het punt waarop veel beginners hun experimenten hebben zien mislukken.Vervang vervolgens voorzichtig de sucrose-oplossing in de pijp om eventuele resterende fixatief weg te wassen. Verwijder nu het venster door de tape met een pincet los te trekken. Als de vensters van de tape losraken, laat het venster dan naar het oppervlak drijven door extra oplossing toe te voegen en verwijder het met de omgekeerde pincet.Dep nu, zonder het raam aan te raken, voorzichtig alle oplossing van de rand weg. Dep daarnaast het verdiepte gedeelte met een afgeronde vouw van een tissue. Het doel is om zo min mogelijk kristallisatie van zout of buffer op het raam te hebben.Plaats tot slot het venster voorzichtig op de rooster-mat die tegen de rand in de mat is ondersteund. Het venster moet de mat zo min mogelijk raken. Zodra het monster is opgedroogd, wordt de aanwezigheid van cellen op de vensters geverifieerd met een lichtmicroscoop.Nadat is bevestigd dat de cellen zich op de vensters bevinden, worden de vensters ingepakt voor transport naar de synchrotron-bundellijn. Plak de vensters voorzichtig aan twee zijden vast op een objectglas. Plak vervolgens het objectglas vast op een plastic Petrischaal en plak de Petrischaal dicht.Tot dit punt kunnen de stappen in elk typisch laboratorium worden uitgevoerd; de volgende stappen worden bij voorkeur uitgevoerd bij een synchrotron-beamline. Het uitpakken van het venster begint met het voorzichtig verwijderen van de tape met een pincet. Vervolgens wordt het venster overgebracht naar een aluminium houder die is verstrekt door de beamline-samenwerkingspartners bij het synchrotron.Zet het venster vast met een dunne, gelijkmatige laag nagellak langs de rand. Plaats vervolgens de aluminium houder in een kinematische houder. Bevestig de houder aan een beugel die is verbonden met de gemotoriseerde tafel in de monsterkamer en in de straallijn van de röntgenmicroscoop.Na het verlaten van de loodlijn naar het instrumentgebied van de röntgenmicroscoop, wordt de scan ingesteld met behulp van beamline-specifieke software. Kies het juiste gebied van het monster om te scannen terwijl de positie van de röntgenstraal op het monster wordt bekeken. Met behulp van een camera die is uitgerust met een videokruisdraad en vooraf is uitgelijnd met een downstream scintillatorcamera; aanvullende details worden verstrekt in het tekstprotocol.Door deze technieken toe te passen op de röntgenbeelden van een monster, is het mogelijk om te zien dat er variatie is in de aanwezige elementen, wat aangeeft dat fixatie deze aspecten van de cellen behoudt, zoals bij deze menselijke HSY five Y-cel. Wanneer er echter buffer aanwezig bleef tijdens het drogen, veroorzaakt uitgebreide kristalvorming structurele schade aan de cellen en belemmert dit de verzameling van de röntgenfluorescentiespectra. Dit is te zien bij een slecht verwerkte RET B 1 0 3-cel.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het prepareren van adherente cellen door middel van chemische fixatie voor röntgenfluorescentie-imaging. Vergeet niet dat het werken met formaldehyde en biologische materialen uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het gebruik van geschikte PBM en het volgen van institutionele richtlijnen, bij het uitvoeren van deze procedure.

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Source: Schumacher, D., et al. Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation and imaging of Myxococcus xanthus, a slow-growing soil bacterium. The culture is grown in a medium, applied to a coverslip with fluorescent microspheres, and overlaid with a pre-warmed agarose pad to support hydration and nutrient supply. This setup enables long-term, time-lapse...

Preparation of Myxococcus xanthus Samples for Live-Cell Imaging

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Een geavanceerde Microscoop waarmee snel en met hoge resolutie zal imaging van zowel de geïsoleerde plasmamembraan en de omliggende intracellulaire volume, worden gepresenteerd. De integratie van de draaiende schijf en de totale interne reflectie fluorescentie microscopie in één installatie kunt levende imaging experimenten bij hoge acquisitie tarieven tot 3.5 s per afbeeldingsstapel.

Visualiseren van hechting vorming in cellen door middel van geavanceerde draaiende schijf-totale interne reflectie fluorescentie microscopie

Geautomatiseerde assays met behulp van multi-well microplaten zijn voordelige benaderingen voor het identificeren van pathway-regulatoren door de beoordeling van een groot aantal omstandigheden in één experiment mogelijk te maken. Hier hebben we het gevestigde macropinosoombeeldvormings- en kwantificeringsprotocol aangepast aan een 96-well microplaatformaat en bieden we een uitgebreid overzicht voor automatisering met behulp van een multi-mode plaatlezer.

Geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor de kwantificering van fluorescerend gelabelde macropinosomen

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Hier presenteren we een veelzijdig equibiaxiaal rekapparaat dat pneumatisch wordt bediend en compatibel is met microscopie met hoge resolutie.

Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Leer hoe je hechtende cellen voorbereidt voor röntgenfluorescentiebeeldvorming via chemische fixatie. Dit protocol toont het gebruik van siliciumnitridevensters en synchrotronanalyse voor het in kaart brengen van metaalverdeling in cellen.

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

Meer video's verkennen