Het modelleren van de levenscyclus van Ebola Virus onder Biosafety Level 2 Voorwaarden met het virus-achtige deeltjes die Tetracistronic minigenomen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de levenscyclus van het zeer pathogene ebolavirus te modelleren onder biosafety level twee-condities. Dit wordt bereikt door virusachtige deeltjes te produceren, die dezelfde eiwitsamenstelling hebben als ebolavirusdeeltjes, maar een mini-genoom dragen in plaats van het virale genoom. Een mini-genoom is een miniatuurversie van het virale genoom waarin virale genen zijn verwijderd en vervangen door een reportergen zoals luciferase.

Belangrijk is dat het minigenoom dat voor dit experiment is gebruikt nog steeds een aantal virale genen bevat, die coderen voor de virale eiwitten VP40, GP-1, GP-2 en VP24. Virusachtige deeltjes worden geproduceerd door een minigenoom tot expressie te brengen in 293T-cellen, genaamd producentencellen, samen met de virale eiwitten NP, VP35, VP30 en L, die gezamenlijk ook RNP-eiwitten worden genoemd.

Het minigenoom wordt vervolgens door de virale eiwitten gerepliceerd en getranscribeerd tot mRNA's. De mRNA's coderen voor de Luciferase-reporter en de aanvullende virale eiwitten VP40, GP-one two en VP24. Samen leiden deze drie eiwitten tot de productie van virusachtige deeltjes, die transcriptie- en replicatiecompetente virusachtige deeltjes of TRVLPs worden genoemd, aangezien de nucleocapsiden daarin in staat zijn tot genoomreplicatie en transcriptie. Omdat TLPs het Ebola-virusglycoproteïne GP-one two dragen, zijn ze in staat om doelcellen te infecteren.

Deze doelcellen zijn vooraf getransfecteerd met expressieplasmiden voor np, VP35, VP30 en L. Samen herkennen deze RNP-eiwitten het minigenoom dat via de TRVLPs in de doelcellen is gebracht. Het minigenoom wordt vervolgens gerepliceerd en getranscribeerd, wat leidt tot reporteractiviteit, evenals tot de productie van nieuwe TRVLPs, die opnieuw kunnen worden gebruikt om nieuwe doelcellen te infecteren.

Belangrijk is dat het mini-genoom niet de genetische informatie bevat die vereist is voor de replicatie ervan. Daarom kunnen TRVLPs cellen die de vier RNP-eiwitten niet tot expressie brengen, niet productief infecteren. Dit maakt het systeem veilig voor gebruik onder biosafety level twee-condities.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het ons in staat stelt om de volledige levenscyclus van het virus te modelleren, inclusief genoomreplicatie, expressie van virale genproducten, productie van virusdeeltjes en de infectie van doelcellen over meerdere cycli van injectiefactoren onder biosafety level twee-omstandigheden. Dit betekent dat dit werk kan worden uitgevoerd zonder een laboratorium met maximale inperking, wat anders nodig is voor werk met levende Ebolavirussen. Deze methode kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals RNA-gemedieerde knockdown van cellulaire factoren of overexpressie van deze factoren, om de rol van deze factoren in de virusbiologie te bestuderen. Daarnaast kunnen we mutaties in de virusgenen introduceren om de rol van deze virusgenen en de genproducten voor de virusbiologie te bestuderen.

Splits de cellen door het medium te verwijderen van 80 tot 90% confluente 293T-cellen, deze tweemaal te wassen met PBS en twee milliliter trypsine aan de cellen toe te voegen. Wacht tot de cellen zijn afgerond.

Verwijder deze vervolgens door tegen de kolf te tikken en acht mL medium met 10% FBS bij de cellen te voegen. Tel de cellen met een automatische celsteller, verdun de cellen vervolgens tot twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter en zaai twee mL in elke put van een six well plate. Plaats de cellen terug in een bevochtigde incubator van 37 °C met 5% CO2. Transfect de cellen na 24 uur met de plasmiden die nodig zijn voor de productie van TRVLPs. Pipetteer het DNA in een BSC met filtertips in een buisje. Als negatieve controle in één put moet het plasmide dat de virale polymerase L codeert worden weggelaten; in plaats daarvan kan een plasmide dat GFP codeert worden getransfecteerd om de transfectie-efficiëntie te visualiseren. Voeg vervolgens 100 µL optimum per put toe aan het DNA. Vortex het buisje en centrifugeer dit kort.

Voeg vervolgens 7,5 µL transIT LT-one transfectiereagens toe aan het verdunde DNA. Vortex de buis voorzichtig en incubeer deze 15 minuten bij kamertemperatuur. Meng het transfectiemengsel na 15 minuten voorzichtig door het met een pipet op en neer te zuigen, en voeg vervolgens druppelgewijs 100 µL toe aan elke put van een six-well plaat.

Zodra u de transfectiecomplexen aan de cellen heeft toegevoegd, schudt u de plaat voorzichtig heen en weer en van links naar rechts. Draai de plaat niet rond, omdat dit zal leiden tot een ongelijkmatige transfectie. Plaats de cellen daarna terug in de incubator. Verwijder 24 uur na de transfectie het supernatant van de cellen. Voeg vervolgens vier milliliter medium met 5%FBS toe aan de cellen en plaats ze terug in de incubator.

Split de 293T-producercellen 24 uur na transfectie zoals eerder beschreven. Transfect deze cellen 24 uur na het splitten met de plasmiden die coderen voor de RNP-eiwitten van het Ebolavirus, alsook Tim-1, dat dient als adhesiefactor voor Ebolavirussen. Oogst 72 uur na transfectie van de producercellen en 24 uur na transfectie van de doelcellen het supernatant van de producercellen en pipetteer dit in een buis van 15 milliliter.

Nadat u het supernatant heeft geoogst, verwijdert u alle resterende vloeistof, voegt u 250 µL glow lysis buffer toe aan de cellen en incubeert u deze gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur. Bepaal daarna de luciferase-activiteit zoals beschreven in stap drie van deze video. Centrifugeer ondertussen het supernatant van de producentencellen gedurende vijf minuten bij 800 g en kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens het medium van de doelcellen en voeg drie milliliter van het geklaarde supernatant van de P-nul-cellen toe aan de doelcellen. Doe dit per put. Wanneer u klaar bent, plaatst u de doelcellen terug in de incubator. 24 uur na infectie.

Verwijder het supernatant van de doelcellen. Voeg vervolgens vier milliliter medium met 5% FBS toe aan de cellen en plaats deze terug in de incubator. Om de reporteractiviteit in producer- of doelcellen te bepalen, worden deze cellen geoogst 72 uur na transfectie in het geval van producer-cellen en 72 uur na infectie in het geval van doelcellen.

Om dit te doen, verwijdert u het supernatant van de cellen, voegt u 250 µL glow lysis buffer toe aan de cellen en incubeert u deze gedurende ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur. Indien gewenst kan het supernatant worden gebruikt om een nieuwe set doelcellen te infecteren. Oogst in dat geval het supernatant en infecteer de doelcellen zoals beschreven in stap twee van deze video.

Ontdooi ondertussen 40 µL per putje luciferase-assaybuffer en voeg één honderdste volume luciferase-substraat toe aan de buffer. Vortex het geresuste luciferase-reagens en zorg dat het kamertemperatuur heeft bereikt voordat u verder gaat. Pipetteer vervolgens 40 µL reagens in een witte, opake 96-wells plaat. Om problemen met crosstalk te voorkomen, is het raadzaam om één putje vrij te laten tussen de monsterputjes. Nadat de incubatie van 10 minuten is voltooid, worden de cellen door middel van pipetteren in de lysisbuffer gewassen en wordt het cellysaat overgebracht naar een buisje. Centrifugeer de lysaten drie minuten lang bij 10.000 g en kamertemperatuur. Pipetteer daarna 40 µL van de lysaten in de 96-wells plaat met het luciferase-reagens. Incubeer de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur. Meet na deze 10 minuten de luciferase-activiteit met een luminometer. De integratietijd voor de luminescentiemeting moet één seconde zijn. Met een Modulus microplate luminometer zouden typische luminescentiesignalen voor de positieve controle rond de 1 × 10⁶ tot 1 × 10⁷ moeten liggen, terwijl het signaal voor de negatieve controle ten minste twee tot drie log-eenheden lager moet zijn. In volgende passages moet de reporteractiviteit in de positieve controles stabiel blijven, terwijl de reporteractiviteit in de negatieve controles moet dalen tot achtergrondniveaus.

Na het bekijken van deze video moet u in staat zijn om virusachtige partikels te produceren die competent zijn voor replicatie en transcriptie van het Ebolavirus, deze te gebruiken om doelcellen te infecteren en de reporteractiviteit in zowel producenten- als doelcellen te meten.

Belangrijk is dat deze methode gecombineerd kan worden met andere technieken, zoals RNA-gemedieerde knockdown van cellulaire factoren, om de rol van deze factoren in de virusbiologie te bestuderen. Daarnaast kunnen mutaties worden geïntroduceerd in de virale componenten die in deze methode worden gebruikt, om de rol van deze componenten in de levenscyclus van het Ebolavirus te bestuderen. Verdere experimentele details en specifieke reagentia zijn te vinden in het manuscript dat bij deze video hoort.