Facial Nerve axotomie in Muizen: een model om motoneuron Response to Injury Study

Het algemene doel van deze procedure is om de facialiszenuw vrij te leggen om perifere zenuwbeschadiging te bestuderen. De facialiszenuw ontspringt in de pons van de hersenstam en verlaat de schedel via het foramen stylomastoideum, waarna de zenuw zich opsplitst in zijn belangrijkste componenten.

Zodra de zenuw is blootgelegd, wordt deze geautotomiseerd bij de uitgang van het foramen stylomastoideum. Twee belangrijke oriëntatiepunten helpen bij het lokaliseren van de facialiszenuw. De eerste is de gehoorgang, die is opgebouwd uit parelmoerwitte kraakbeenplaten die met een dun membraan zijn verbonden.

De andere is de anterieure buik van de m. digastricus, die bovenop de zenuw en de uitgang uit het foramen stylomastoideum ligt. Nadat de nervus facialis is beschadigd, kan de wetenschapper meerdere factoren bestuderen, zoals motorneuroonsterfte of genexpressie. Het model voor beschadiging van de nervus facialis is een van de best gekarakteriseerde modellen voor perifere zenuwschade.

De voordelen van deze techniek zijn de eenvoud, de hoge reproduceerbaarheid en het uitblijven van effecten op vitale functies als gevolg van de daaropvolgende gezichtsparalyse. Bovendien kan, vanwege de zeer symmetrische aard van het zenuwstelsel, de niet-geblesseerde zijde dienen als gepaarde interne controle voor uw experimenten. Om gedurende deze procedure het gebruik van aseptische technieken te waarborgen, dient u ervoor te zorgen dat alle instrumenten geautoclaveerd zijn en dat een glaskraalsterilisator gereedstaat om de instrumenten tussen de handelingen door te steriliseren.

Bereid de operatietafel voor door een absorberend matje op een warmtematje te plaatsen, de microscoop op te stellen en de neuskegel vast te plakken zodat deze is uitgelijnd met de rand van het gezichtsveld. Controleer na het anesthetiseren van de muis of de muis geen fysieke reactie vertoont op manipulaties, waaronder een knijptest bij de teen. Verplaats vervolgens de gasstroom van de anesthesiekamer naar de neuskegel en breng off thalamic zalf aan.

Plaats de muis op de linkerzijde op chirurgische pads met daaronder een warmtemat. Controleer voortdurend de ademhaling van het dier en pas de isofluraanstroom indien nodig aan om de anesthesie in stand te houden. Plak vervolgens het rechteroor aan de neuskegel om de chirurgische plek bloot te leggen.

De vena auricularis posterior moet zichtbaar zijn terwijl deze over het oor loopt. Maak vervolgens de vacht nat met 70% ethanol en scheer de plek. Nadat de vacht is verwijderd, wordt de huid gereinigd met drie afwisselende schrobbeurten met jodium en 70% ethanol, totdat de plek grondig is gereinigd.

Ga over tot de chirurgische ingreep. Zorg ervoor dat de bek recht op zijn zij wordt gepositioneerd, waarbij de oorader horizontaal loopt. Dit maakt het lokaliseren van de gezichtszenuw veel eenvoudiger.

Om de locatie van de eerste incisie te bepalen, volgt u de vena auricularis posterior vanaf het oor zorgvuldig naar het gebied achter de ooruitstulping. Maak vervolgens met veerschaar een incisie van 4 mm, twee tot drie millimeter posterior van de uitstulping voor educatieve doeleinden. Deze incisie wordt vervolgens vergroot om de onderliggende anatomie bloot te leggen.

Voer nu een botte dissectie van het subcutane vet en het fascia uit. Bloedvaten en spieren kunnen gemakkelijk beschadigd raken door scharen. Indien er sprake is van bloedingen.

Oefen gedurende ten minste 30 seconden druk uit met een steriel wattenstaafje. Indien er sprake is van aanzienlijk vochtverlies, injecteer dan tot een halve milliliter saline intraperitoneaal met een naald van 25 of 27 gauge. Lokaliseer nu de facialiszenuw aan de hand van de belangrijkste oriëntatiepunten.

De nervus accessorius is oppervlakkiger gelegen dan de nervus facialis en is zichtbaar terwijl deze vanuit het condylaire deel van de schedel loopt. Om de musculus trapezius te innerveren, moet de kraakbenige gehoorgang worden geïdentificeerd. Deze is parelwit van kleur en bevindt zich rostraal van de nervus facialis.

De facialiszenuw loopt rond het caudale deel van de gehoorgang. Identificeer vervolgens de spierbuik van de musculus digastricus anterior die bovenop en caudaal ten opzichte van de facialiszenuw ligt. Disseceer onder deze structuur om de facialiszenuw bloot te leggen.

Het is een stevige witte structuur, gehecht aan een onderliggende laag fascia. Identificeer de hoofdtakken van de nervus facialis. Volg deze dorsaal terug naar hun oorsprong vanuit het foramen stylomastoideum.

Gebruik een fijne pincet om de plek open te houden, terwijl u met de punt van de veerschaar langs het verloop van de nervus facialis dissekeert. De benige mastoïd van Raymond kan met de pincet worden gevoeld. Identificeer nu de stam van de nervus facialis om de zenuw te verbrijzelen.

Comprimeer het gedurende 30 seconden met de fijne pincet onder constante druk. Dit zal alle axonen doorsnijden. Herhaal vervolgens de compressie onder een loodrechte hoek gedurende nog eens 30 seconden.

Houd de druk consistent tussen de experimenten. Nu de relevante anatomische oriëntatiepunten zijn geïdentificeerd, demonstreer ik de meer verfijnde chirurgische techniek. Maak een kleinere incisie, volg de vena auricularis posterior vanaf het oor voorzichtig naar het gebied achter de ooruitstulping en maak een incisie van 4 mm, twee tot drie mm posterior van de uitstulping.

Ontleed nu direct door het subcutane vet en het fascia aan de hand van de drie referentiepunten: de nervus accessorius, de gehoorgang en de anterieure buik van de musculus digastricus. Leg de nervus facialis vrij. Volg de nervus facialis terug in de richting van het foramen stylomastoideum om de stam van de nervus facialis te bereiken; stabiliseer de zenuw voorzichtig met een fijne pincet en transecteer deze met een schaar.

Voorkom dat er te veel tractie op de zenuw wordt uitgeoefend, anders kan deze uit de hersenstam worden getrokken. Beweeg vervolgens de zenuwuiteinden uit elkaar of verwijder een segment van de zenuw om te voorkomen dat er een herverbinding plaatsvindt. Inspecteer ten slotte de zenuw zorgvuldig en bevestig dat deze volledig is doorgesneden.

Na de exsomie worden al het vet en de spieren teruggeplaatst in hun oorspronkelijke posities. Sluit vervolgens de wond met wondhechtingen van 7,5 millimeter of cyanoacrylaatlijm. Dien indien nodig op dit moment analgetica toe, schakel de anesthesie uit en plaats de muis terug in een lege kooi zonder strooisel.

Terwijl het dier herstelt, moet het worden onderzocht op tekenen van gezichtslameid; de snorharen zijn dan verlamd. Als ze naar achteren richting de wang zijn gebogen, zal de neus afwijkend lijken en zal het oog niet knipperen als reactie op een luchtstoot. Als het dier een vrouwtje is, moet zij vervolgens samen met een ander vrouwtje worden gehuisvest.

Houd het mannelijke dier echter apart tot de oogknipperfunctie is teruggekeerd en breng dagelijks oftalmische zalf aan om corneale complicaties te voorkomen. Houd de muis ondertussen in de gaten op tekenen van infectie of andere complicaties totdat de chirurgische wond is genezen. Er is een aanzienlijke variatie in het verlies van motorische neuronen na enucleatie, afhankelijk van de leeftijd en de genetische achtergrond van de muizen in wild-type dieren die op acht weken leeftijd een transectie van de nervus facialis ondergaan.

Ongeveer 86% van de motorneuronen overleeft na 28 dagen na de axotomie. Er werd significant meer celverlies waargenomen in het SOD1-muismodel voor amyotrofische laterale sclerose, alsof in de immuundeficiënte recombination activating gene two-knockout muis laser capture.

Microdissectie werd gebruikt om materiaal uit de facialiskern te isoleren. De gehele facialiskern kon worden vastgelegd. Alternatief konden de subnuclei afzonderlijk worden verzameld.

De techniek is zeer nauwkeurig. Motorneuronen kunnen individueel worden gevangen en de resterende neuro-pellet kan achteraf ook worden verzameld voor analyse. Kwantitatieve PCR werd gebruikt om de genexpressie in de subnucleaire monsters van de ventromediale subnucleus, weergegeven door de stippellijn, en de ventrolaterale subnucleus, weergegeven door de doorgetrokken lijn, te onderzoeken. De expressie van vier genen die geassocieerd zijn met de zenuwregeneratierespons werd gemeten.

Er werden enkele verschillen gevonden tussen de subnuclei hiervan. De expressie van Gap 43 vertoonde het grootste verschil tussen de subnuclei. Zodra deze techniek onder de knie is, kan de chirurgische ingreep in slechts enkele minuten worden voltooid.

Het is belangrijk om eraan te denken het dier correct te positioneren, de incisie op de juiste plaats te maken en de anatomische oriëntatiepunten te gebruiken om de nervus facialis te lokaliseren. Het is gemakkelijk om gedesoriënteerd te raken in de regio van de kop en nek; als u het overzicht verliest, lokaliseer dan simpelweg de kraakbenige gehoorgang en volg deze posterieur om de nervus facialis te vinden.