Name: Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer een MALDI-TOF SNP-genotyperingsplatform voor het gelijktijdig detecteren van soort, insecticideresistentie en parasietinfectie bij malariamuggen. Deze methode verbetert vectoronderzoek en malaria-controlestrategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Drs. Anthony Cornel en Laura Norris aan UC Davis en Dr. Katharina Kreppel aan de Universiteit van Glasgow voor het verstrekken van mosquito exemplaren uit Tanzania. Wij danken mevrouw Smita Das en Dr. Douglas Norris van de Johns Hopkins School of Public Health voor het delen van mosquito monsters uit Zambia. We danken ook de heer Lee V. Millon bij het Veterinary Genetics Laboratory voor het trainen op assay ontwerp. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Health verlenen R01AI 078.183 en R21AI062929.

1. PCR amplificatie <ol><li> Meng alle PCR-primers (zie aanvullende tabel S1) in 1,5 ml microbuisjes. Elke SNP heeft twee primers (voorwaarts en achterwaarts). Zorg ervoor dat de voorraad concentratie van elke PCR-primer bij 100 uM wordt gehouden. Maak genoeg primer mix voor 500-1.000 reacties op pipetteren fouten en tijd op de bank te verminderen (zie aanvullende tabel S2). Desgewenst aliquots per 100-200 reacties per buisje en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereid PCR cocktail zoals beschreven in protocol van de fabrikant (Tabel 1). Het volume voor 96 reacties omvat een overhang van 20%. Vortex de buis met de PCR cocktail licht en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 2000 x g. </li><li> Verdeel 3 ui van de PCR cocktail in elk putje van een niet-begrenste plaat met 96 putjes. Een repeater pipet kan tijd besparen voor dit proces. </li><li> Voeg 2 pl van de geschikte genomisch DNA muggen in elk putje. OPMERKING: Proces verkrijgen genomisch DNA van m<html> osquito weefsels (hoofd / thorax, buik of het gehele lichaam) wordt beschreven in andere literaturen 29-32. Kies een geschikte DNA-extractie protocol die met Plasmodium in het bloed (abdomen) van besmettelijk muggen differentiëren (Plasmodium in het hoofd / thorax). Wij gebruiken meestal de DNA geëxtraheerd uit lichaamsdelen (hoofd / thorax of abdomen) muggen, dus DNA-concentratie varieert van 0.05-2ng / ul. Hoewel het totale DNA input lager dan aanbevelingen van de fabrikant (5-10ng / rxn), we meestal krijgen robuust SNP oproepen van 98% van de DNA-monsters zonder gehele genoom amplificatie. </li><li> Verzegeling van de plaat, meng of vortex, en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 370 x g. </li><li> Gebruik de volgende thermocycler protocol uitvoeren PCR-amplificatie: (1) 94 ° C gedurende 2 min, (2) 94 ° C gedurende 30 sec, (3) 56 ° C gedurende 30 sec, (4) 72 ° C gedurende 1 min (5) herhaal de stappen (2) - (4) gedurende 45 cycli (6) 72 ° C gedurende 1 min en 4 ° C hold. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP Behandeling <ol><li> Bereid de SAP enzymoplossing in een plaat met 96 putjes (zie tabel 2). Verwerk 96 monsters in een plaat. Het volume voor 96 reacties omvat een overhang van 20%. </li><li> Vortex de buis SAP enzymoplossing licht en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 2000 x g. Verdeel 2 pl van het SAP enzym oplossing in elk putje. Ook kan een repeater pipet tijd besparen voor dit proces. </li><li> Verzegeling van de plaat, meng of vortex, en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 370 x g. Incubeer de plaat als volgt: (1) 37 ° C gedurende 40 min, (2) 85 ° C gedurende 5 minuten om het enzym te inactiveren, (3) 4 ° C hold. Na afronding van deze stap, slaan de plaat bij -20 ° C voordat u verder gaat. Verwerk de opgeslagen plaat binnen 2 weken. </li></ol> 3. SNP Extension <ol><li> Als het monster plaat na SAP behandeling is bevroren, laat het ontdooien om RT voordat u verder gaat. </li><li> Bereid de extensie primer mix (Aanvullende Tabel S2). Elke SNP heeft een extension primer. Houd de voorraad concentratie van elke verlengingsprimer bij 500 uM. Eventueel aliquot van 100-200 reacties per buisje en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereid verlenging mix zoals beschreven in Tabel 3. 96 reactievolume omvat een overhang van 20%. </li><li> Vortex de buis uitbreiding cocktail licht en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 2000 x g. Doseer 2 pl van de uitbreiding cocktail in elk putje. Ook kan een repeater pipet tijd besparen voor dit proces. </li><li> Verzegeling van de plaat, meng of vortex, en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 370 x g. Thermocyclus de plaat zoals weergegeven in figuur 1. Op dit punt verder naar massaspectrometrie of bewaar de plaat bij -20 ° C tot 2 weken. </li></ol> 4. Conditioning de SNP verlengingproduct aan massaspectrometrie Analyse Optimaliseer <ol><li> Als het monster plaat na SNP extensie is bevroren, laat het ontdooien om RT voordat u verder gaat. </li><li> Transfer 15mg van hars van de contaIner op het kuiltje plaat met behulp van een langgerekte lepel. Gebruik de schraper om hars in de putjes van de plaat kuiltje verspreiden. Vegen de schraper van links naar rechts over het kuiltje plaat om de hars te verspreiden. Zorg ervoor dat er hars in elk putje. </li><li> Schraap overtollige hars uit het kuiltje plaat met behulp van de schraper. Laat de hars staan ​​in het kuiltje plaat gedurende tenminste 20 minuten. Terwijl het laten van de hars staan ​​in het kuiltje plaat, voeg 41 ul van HPLC-kwaliteit water aan elk putje van het monster plaat. </li><li> Plaats voorzichtig het monster plaat ondersteboven, op het kuiltje plaat. Zorg ervoor dat het monster plaat teruggezet tegen de kleine afgeronde post van het kuiltje plaat, die de putten uitgelijnd in het monster plaat met de putten in het kuiltje plaat. </li><li> Houden van het monster plaat en het kuiltje plaat bij elkaar, voorzichtig omdraaien hen over, zodat de hars valt uit het kuiltje plaat in de putjes van het monster plaat. Tik op het kuiltje plaat zodat de hars valt uit in het monster plaat. Zorg ervoor dat al het hars in de dimple plaat valt uit in het monster putjes. Centrifugeer de plaat bij 3200 xg gedurende 30 sec. </li><li> Draai de monsterplaat op een rotator gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Rotator moet het monster plaat draaien 360 ° over de lange as. </li><li> Centrifugeer het monster plaat bij 3200 xg gedurende 5 min. Na deze stap, slaan het monster plaat bij -20 ° C tot 2 weken voordat u verder gaat met de volgende stap. </li></ol> 5. MALDI-TOF-massaspectrometrie <ol><li> Breng de geconditioneerde SNP verlengingsproduct op een bioarray zoals SpectroCHIP volgens instructies van de fabrikant. Wij gebruiken MassArray Nanodispenser voor deze stap. </li><li> Nadat de overdracht is voltooid, definiëren hoe assays en platen worden ingesteld in de assay database. De naam van de test en platen zodanig dat elke plaat heeft unieke identifier die links naar specifieke test design (Aanvullende Tabel S3). </li><li> Na analyse en plaat gedefinieerd verkrijgen spectra met een massaspectrometer. </li></ol><ol><li> Voeren data-analyse met behulp van een real-time PCR-analyse data interpretatie software zoals typer Analyzer of TyperViewer (Sequenom). Verkrijgen van gegevens in XML-formaat dat de steekproef layout, massa spectrogram voor elk putje bevat, de marker gegevens zoals naam, verwachte massa voor elke variant van de desbetreffende SNP, en eventuele fouten of waarschuwingen in verband met elke reactie. Zie figuur 2 voor de resulterende massa spectrogram. </li><li> Voer SNP genotype clustering analyse door de detectiedrempel (magnitude of signaal-ruisverhouding) en tolerantie / variantie toegestaan ​​voor elk genotype. Figuur 3 toont een voorbeeld van een 04707-KDR # 2 SNP genotype clusters. </li><li> De resulterende SNP genotype gesprekken in een spreadsheet programma te exporteren. </li></ol>

<ol><li>Ayala, F. J., Coluzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+speciation%3A+humans%2C+Drosophila%2C+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).</li>
<li>Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+African+malaria+mosquitoes+belonging+to+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex.</a> Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).</li>
<li>Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+ribosomal+DNA+polymorphisms+discriminating+among+chromosomal+forms+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).</li>
<li>Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+species+and+molecular+forms+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+PCR-RFLP%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP.</a> Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+reveal+discrepancies+among+results+of+commonly+used+methods+for+Anopheles+gambiae+molecular+form+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification.</a> Malar J. 10, 215(2011).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+polymorphisms+of+SINE200+retrotransposons+within+speciation+islands+of+Anopheles+gambiae+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms.</a> Malar J. 7, 163(2008).</li>
<li>Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+A+new+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism+method+to+identify+Anopheles+arabiensis+from+An.+gambiae+and+its+two+molecular+forms+from+degraded+DNA+templates+or+museum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples.</a> Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. , (2013).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction.</a> Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+of+physically+unlinked+islands+of+genomic+divergence+in+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).</li>
<li>Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+biased+co-transmission+of+speciation+islands+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).</li>
<li>Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+kdr+mutation+and+resistance+to+pyrethroid+and+DDT+insecticides+in+natural+populations+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).</li>
<li>Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kdr+mutation+occurs+in+the+Mopti+form+of+Anopheles+gambiae+s.s.+through+introgression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression.</a> Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).</li>
<li>Tripet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+survey+of+knockdown+resistance+to+pyrethroid+%28kdr%29+in+Mali%2C+West+Africa%2C+and+evidence+of+its+emergence+in+the+Bamako+form+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s.</a> Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).</li>
<li>Martinez-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pyrethroid+knockdown+resistance+%28kdr%29+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).</li>
<li>Diabate, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDR+mutation%2C+a+genetic+marker+to+assess+events+of+introgression+between+the+molecular+M+and+S+forms+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+the+tropical+savannah+area+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa.</a> J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).</li>
<li>Chandre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+distribution+of+a+pyrethroid+resistance+gene+%28kdr%29+in+Anopheles+gambiae+complex+from+west+Africa+and+further+evidence+for+reproductive+isolation+of+the+Mopti+form%5BTitle%5D)+AND+%22Parassitologia%22%5BJournal%5D)">Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form.</a> Parassitologia. 41, 319-322 (1999).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+anthropophily+in+the+potential+secondary+malaria+vectors+Anopheles+coustani+s.l.+and+Anopheles+squamosus+in+Macha%2C+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+detection+of+human+malaria+parasites+by+the+use+of+nested+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction.</a> Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).</li>
<li>Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).</li>
<li>Oyedeji, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR-based+detection+of+Plasmodium+falciparum+infections+based+on+single+and+multicopy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes.</a> Malar J. 6, 112(2007).</li>
<li>Gama, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+versus+conventional+PCR+for+malaria+parasite+detection+in+low-grade+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia.</a> Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome.</a> B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+endophily+by+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis+in+southern+Zambia+and+identification+of+digested+blood+meals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals.</a> Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).</li>
<li>Teeter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+genomic+architecture+of+isolation+between+hybridizing+species+of+house+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice.</a> Evolution. 64, 472-485 (2010).</li>
<li>Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+survival+in+small-cell+lung+cancer+patients+treated+with+irinotecan+plus+cisplatin+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+pharmacogenomics+journal%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy.</a> The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).</li>
<li>Chakraborti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+polyethyleneimine-functionalized+ZnO+nanoparticles+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+differentiation%2C+and+linkage+disequilibrium%3A+prospects+for+association+mapping+in+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis.</a> G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).</li>
<li>Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from:
 <a target="_blank" href="
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx">
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx</a> 1725-1732 (2010).</li>
<li>Tripet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+analysis+of+transferred+sperm+reveals+significant+levels+of+gene+flow+between+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).</li>
<li>Slotman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subdivision+within+the+M+molecular+form+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).</li>
<li>Basu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+Spectrometry+is+More+Sensitive+Than+PreTect+HPV-Proofer+and+Consensus+PCR+for+Type-Specific+Detection+of+High-Risk+Oncogenic+HPV+Genotypes+in+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer.</a> J Clin Microbiol. , (2011).</li>
<li>Fu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+assay%3A+a+more+accurate+method+for+JAK2V617F+mutation+detection+in+Chinese+patients+with+myeloproliferative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders.</a> Leukemia. 22, 660-663 (2008).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+the+Sequenom+MassARRAY+iPLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.</a> Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).</li>
<li>Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+MassARRAY+technology+for+high+throughput+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).</li>
<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De MDA bestaat uit vijf belangrijke stappen: PCR-amplificatie, garnaal alkalisch fosfatase (SAP) reactie, SNP uitbreiding, uitbreiding productconditionering en matrix-assisted laser desorptie / ionisatie - time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie 33-37. De eerste PCR-amplificatie stap versterkt DNA flankerende elke SNP zodat er voldoende template DNA beschikbaar zullen zijn bij de SNP extensie stap. De SAP reactie neutraliseert ongebruikte dNTPs die kunnen interfereren met de volgende SNP extensie stap. ...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii en Anopheles gambiae zijn de belangrijkste vectoren die verantwoordelijk is voor de overdracht van malaria in Afrika 1. Deze drie soorten zijn morfologisch onderscheiden 2 en kan slechts worden verkregen door moleculaire assays 3-9. Daarnaast zijn er vele stroomafwaarts assays routinematig uitgevoerd epidemiologische en populatiegenetica studies steun. Deze omvatten (1) een genotyperingstest voor speciatie eilanden 10-12, (2) een genotyperingstest erkenning van niet-synoniem SNPs in de 1014 ste aminozuur codon positie para-gen (de weerstand knock-down of KDR, SNP) 13 -18, (3) parasiet detectie PCR 19-23, en (4) het screenen op gastheer-specifieke DNA in muggen midguts 24,25. We ontwikkelden een multi-detectietest (MDA) dat al deze assays in één multiplex reactie met het doel van een gecombineerdalyzing vanuit epidemiologisch oogpunt belangrijke kenmerken van malaria vectoren in Afrika. De MDA assay bevat meerdere merkers voor het detecteren (1) species (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii of andere (geen van de drie)), (2) insecticide resistentie vertegenwoordigd KDR SNPs (zowel L1014F en L1014S) (3) de aanwezigheid van twee belangrijke malaria parasieten Plasmodium falciparum en P. vivax, en (4) het bloed bron van de ene aviaire en zes zoogdiergastheren. Traditioneel werden deze testen uitgevoerd in afzonderlijke polymerase kettingreacties. Wanneer deze testen worden uitgevoerd met een conventionele PCR platform, vereist het uitvoeren 8-10 PCR reactie assays en bijbehorende gelelektroforese stappen. Elke individuele PCR-reactie van voorbereiding tot het documenteren van de resultaten neemt 4-5 uur, terwijl de MDA hier gepresenteerde methode duurt ongeveer 5 uur in totaliteit. Dit komt overeen met een 90% besparing op arbeidskosten alleen. De MDA gepresenteerde hier kost $ 5per monster om alle 33 SNPs genotype. Dit is aanzienlijk goedkoper dan de single agarose gel gebaseerde testen die ongeveer $ 1,50 per monster kost. Assays detecteren alle kenmerken die onder de MDA zou minimaal 8-10 afzonderlijke agarose gel gebaseerde assays vereisen ten koste van $ 12-15 per monster. Bovendien, de MDA vermindert de kans op het genereren van een vals positief of negatief door gebruik ten minste drie markeringen per parasiet of hostbron detectie. Het platform we gebruik is niet beperkt tot malariavectoren maar kunnen worden gebruikt in uiteenlopende toepassingen zoals geneeskunde, diergeneeskunde en de biologie 26-28. Diepgaande associatiestudies of populatiegenetica studies met een grote (in volgorde van 100s) aantal monsters vereisen kosteneffectieve screening assays voor meerdere markers simultaan. De meeste studies die twee of meer afzonderlijke PCR assays kunnen de MDA inrichting voor snellere resultaten tegen lagere kosten. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>MassARRAY Analyzer Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF massaspectrometrie voor genomische toepassingen om nucleïnezuren te analyseren.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>Transfereert voltooide iPLEX-reactieproducten naar de SpectroCHIP</td></tr><tr><td>iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td><td>Sequenom</td><td>10158</td><td>Reagentia gebruikt voor iPLEX-assay inclusief SAP-kit.</td></tr></tbody></table>

een multi-detectie test voor malaria zenden muggen

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

De Anopheles gambiae soorten complex omvat de grootste malaria overbrengen van muggen in Afrika. Omdat deze soorten zijn van dergelijke medische belang, zijn verschillende karaktertrekken typisch gekenmerkt met behulp van moleculaire tests om te helpen bij epidemiologische studies. Deze eigenschappen zijn onder andere species identificatie, resistentie tegen insecticiden, parasitaire infectie-status, en gastheer voorkeur. Aangezien populaties van Anopheles gambiae complex morfologisch niet te onderscheiden, wordt een polymerase kettingreactie (PCR) traditioneel gebruikt om soorten te identificeren. Als de soort bekend is, worden meerdere downstream assays routinematig uitgevoerd om verdere kenmerken helderen. Zo mutaties bekend als KDR in een para-gen verlenen resistentie tegen DDT en pyrethroïde insecticiden. Daarnaast enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) of Plasmodium parasiet DNA detectie PCR assays worden gebruikt om parasieten in muggen weefsels te detecteren. Tot slot, een gecombinen PCR en restrictie-enzym digesties worden gebruikt om gastheer voorkeur (bijvoorbeeld humane versus dierlijke bloed) door screening van de mug bloedmeel voor host-specifieke DNA helderen. We hebben een multi-detectietest (MDA) dat alle voornoemde assays tegelijk combineren in één multiplex reactie genotypering 33SNPs 96 of 384 monsters ontwikkeld. Omdat de MDA bevat meerdere markers voor soorten, Plasmodium detectie, en gastheer bloed identificatie, wordt de kans op het genereren van valse positieven of negatieven sterk verminderd uit eerdere testen die slechts één marker per kenmerk bevatten. Deze robuuste en eenvoudige test kan deze belangrijke mug karaktertrekken kosten-effectief en in een fractie van de tijd van de bestaande tests detecteren.

Identificatie van soorten: De volgende 5 SNPs elkaar onderscheiden drie soorten (A. arabiensis, A. coluzzii en A. gambiae) (tabel 4). Als een monster is niet een van de drie soorten, de drie SNPs (01073-213, 04.679-157 en 10313 -052) niet te versterken. KDR genotype voor het afleiden van resistentie tegen insecticiden: De 1014 ste codon van de para volta...

Muggen die malaria overdragen, hebben een aantal epidemiologisch belangrijke kenmerken die alleen kunnen worden gedetecteerd met behulp van moleculaire technieken. Door gebruik te maken van een MALDI-TOF-gebaseerde SNP-genotyperingsplatform, hebben we een test ontwikkeld voor het gelijktijdig detecteren van meerdere belangrijke eigenschappen (soorten, insecticideresistentie, parasietinfectie en gastheukeuze) van malariavectoren.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel vuurvaste voor malaria, dient te worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van Plasmodium besmettingen binnen de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van plasmodium infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor de voorbereiding van de gametocyt cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.

Protocol voor Plasmodium falciparum Infecties in Muggen en Infection Fenotype Bepaling

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen...

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

This video demonstrates a blood-feeding assay to evaluate the mortality and fecundity of test compounds with novel modes of action on female mosquitoes. This technique helps in screening new classes of insecticides to kill the resistant population of mosquitoes and control disease spread.

Mosquito Feeding Assay: A Method to Evaluate Test Compound Effects on Mortality and Fecundity of Adult Female Mosquitoes

Terwijl hoge resolutie smeltende analyse biedt de mogelijkheid om te differentiëren tussen single nucleotide polymorfismen in een heterogene populatie, kunnen mutante allel amplificatie vertekening zijn vermogen allelen aanwezig betrekkelijk lage percentages in een monster te detecteren verhogen. Dit protocol beschrijft verbeteringen die de gevoeligheid van hoge resolutie smeltende analyse te verbeteren.

Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Het gepresenteerde protocol kan de vectorcompetentie van Aedes aegypti-muggenpopulaties voor een bepaald virus, zoals Zika, in een containmentomgeving bepalen.

Vectorcompetentieanalyses op Aedes aegypti-muggen met behulp van het Zika-virus

Dit protocol biedt de stappen van DNA-extractie tot experimentele opstelling voor digitale druppel PCR (ddPCR), inclusief analyse voor de identificatie en kwantificering van niet-homologe end-joining (NHEJ) gebeurtenissen op doellocaties na gRNA-geïnduceerde Cas9-splitsing en DNA-reparatie. Andere toepassingen van deze methode zijn toepassingen zoals polymorfismedetectie en genbewerkingsvariantverificatie.

Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Dit protocol beschrijft een sandwich-enzymgekoppelde immunosorbenttest om speekselkliersporozoïeten bij muggen te detecteren. Met behulp van gemakkelijk verkrijgbare monoklonale antilichamen maakt de methode kosteneffectieve detectie met hoge doorvoer mogelijk van muggen die Plasmodium falciparum of Plasmodium vivax dragen. De methode is geschikt voor onderzoek naar de overdracht van malaria, inclusief vectoronderzoeken.

Detectie van Plasmodium Sporozoïeten bij Anopheles-muggen met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Multiplexfluorescentie-immunoassays worden een referentie voor serologische tests. Hun toepassing wordt echter beperkt door de complexiteit en tijdrovende processen voor het koppelen van kralen en analyten. Dit rapport presenteert een semi-automatisch, reproduceerbaar multiplex-protocol voor het koppelen van microbolletjes dat vergelijkbaar is met de standaardmethode, terwijl de tijd tot resultaten aanzienlijk wordt verkort.

Een multiplex serologische test voor de detectie van antilichaamresponsen op arbovirussen

Leer een MALDI-TOF SNP-genotyperingsplatform voor het gelijktijdig detecteren van soort, insecticideresistentie en parasietinfectie bij malariamuggen. Deze methode verbetert vectoronderzoek en malaria-controlestrategieën.

Een Multi-detectie test voor Malaria Zenden Muggen

Meer video's verkennen