Diffusion Imaging in het Rat ruggenmerg
7 april 2015
Het doel van dit protocol is om hoogwaardige diffusie gewogen magnetische resonantie beeldvorming (DWI) van het ruggenmerg van de rat te verkrijgen voor niet-invasieve karakterisering van weefselmicrostructuur. Dit protocol beschrijft optimalisaties van de MRI-sequentie, radiofrequentie spoel en analysemethoden om DWI-beelden vrij van artefacten mogelijk te maken.
Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige diffusie gewogen magnetische resonantie beeldvorming van het rattenruggenmerg te verkrijgen voor niet-invasieve karakterisering van weefselmicrostructuur. Dit wordt bereikt door eerst een rat voor te bereiden in de MR-scanner met de juiste mobilisatie en ademhalingsbewaking. De tweede stap is het uitvoeren van een aangepaste diffusie gewogen MRI-scan met ademhalingstriggering.
Vervolgens worden de beelden gecorrigeerd voor susceptibiliteitsartefacten. De laatste stap is om het MRI-signaal aan te passen aan een wiskundig model. Uiteindelijk wordt vergelijking van modelparameters binnen regio's van belang gebruikt om eigenschappen van weefselmicrostructuur te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ex vivo-scannen, is dat deze kan worden toegepast in de kliniek voor diagnostische doeleinden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij ruggenmergletsel, zoals het identificeren van secundaire letselmechanismen en prognose voor herstel. Het demonstreren van de procedure zullen Natasha Wilkins en Matt Renquist zijn, technici uit mijn laboratorium voordat de stappen in dit protocol worden uitgevoerd.
Eerst verkrijgt u goedkeuring van de betreffende institutionele zorg- en gebruikscommissies voor alle procedures. Begin met het anestheseren van de rat in een inductiekamer met behulp van 5% isofluorine in medische lucht. Wanneer de pootintrekking en schrijfreflex afwezig zijn, verlaag de anesthesie tot 2%. Breng vervolgens het dier over naar de scannerbank in een koperste standpositie.
Handhaaf 2% ISO fluorine via een neuskoker gedurende de procedure en houd de medische lucht op een stroomsnelheid van ongeveer één liter per minuut. Smeer ook een kleine hoeveelheid smeermiddel in de ogen van de rat om schade aan het hoornvlies tijdens anesthesie te voorkomen. Plaats een ademhalingsbewakingsband stevig om de romp van de rat en sluit deze aan op een ademhalingstriggeringssysteem.
Controleer de ademhalingsbewakingscomputer om er zeker van te zijn dat de ademhalingscyclus duidelijk en consistent is. Pas een riem aan indien nodig, aangezien deze stap onmisbaar is voor de beeldkwaliteit. Gebruik een warme luchtverwarming en controleer en handhaaf de lichaamstemperatuur van het dier via een rectale sonde om ervoor te zorgen dat deze op 37 graden Celsius wordt gehouden.
Handhaaf de ademhalingsfrequentie tussen de 30 en 45 ademhalingen per minuut door de anesthesie tussen 1,2 en 2% aan te passen. Plaats nu de rat in de hoofdhouder met een beetbalk en schroef in oorbeugels en schuif het hoofd in een quadratische volume spoel totdat de cervicale wervelkolom zich in het centrum van de spoel bevindt. Breng tenslotte de rat en ondersteunende houders in de scannerboord indien van toepassing, pas de afstemming en matchende condensatoren van de spoel aan op de juiste frequentie en de impedantie volgens de instructies van de leverancier. Verkrijg een standaard drie-vlak verkennerscan om de juiste positionering te garanderen.
Deze eerste scan activeert de geautomatiseerde procedures van het MRI-systeem voor detectie van de resonantiefrequentie afstemming, kalibratie van het radiofrequentie vermogen en aanpassing van de ontvangerversterking. Controleer of het centrum van de cervicale wervelkolom is uitgelijnd met zowel het centrum van de magneet als het centrum van de MRI-spoel. Voeg vervolgens een echoplaner, diffusie gewogen spin-echo sequentie toe aan het beeldvormingsprotocol.
Gebruik standaard instellingen van de sequentie, maar schrijf 12 sneden voor met een dikte van 0,75 millimeter, en oriënteer deze loodrecht op de hoofdas van het cervicale koord. Gebruik de basis van het cerebellum als interne referentie om een consistente snedepositionering tussen dieren en sessies te garanderen. Schakel de verzadigingsbanden in.
Plaats vervolgens vier verzadigingsbanden met een dikte van 10 millimeter buiten het ruggenmerg om het signaal van deze weefsels te minimaliseren en hun potentieel om artefacten te induceren te verminderen. Zorg er ook voor dat u de ademhalingstriggering inschakelt. Stel nu de sequentie in met behulp van de diffusie wachtinstellingen zoals hier op het scherm te zien.
Start vervolgens de scan. De totale acquisitietijd bedraagt ongeveer 25 minuten gedurende de scans. Controleer de ademhalingstriggeringssoftware en pas de vertragingsperiode tussen de trigger en het signaal aan het MRI-systeem aan zodat acquisities alleen plaatsvinden in het rustige gedeelte van de ademhalingscyclus.
Let op dat een triggervertraging tussen 100 en 400 milliseconden noodzakelijk zal zijn, afhankelijk van het ademhalingspatroon van het dier. Dit helpt artefacten te verminderen die optreden bij ademhalingsbewegingen. Herhaal indien beschikbaar de sequentie met de aangepaste omgekeerde blips ingesteld op aan als de beeldvorming is voltooid.
Verwijder het dier uit de houder en breng het terug naar zijn kooi. Controleer het dier totdat het bij kennis is. Om sternal liggende te blijven.
Begin met beeldverwerking door eerst correctie voor susceptibiliteitsartefacten uit te voeren. Extraheer vervolgens de B gelijk aan nul volumes uit elke scan in één bestand met behulp van hulpprogramma's die worden geleverd met FSL of andere MRI-softwarepakketten. Voorbeeldcode is hier te zien.
Er is één bestand vereist voor elke fase in coderichting. Gebruik vervolgens de top-up opdracht in FSL om een gecorrigeerd bestand met verminderde beeldvervormingsartefacten te maken. Pas deze correctie toe op de ruwe DWI-beelden die worden gebruikt voor het maken van parameterkaarten.
Laad dit gecorrigeerde DWI-bestand in de FSL-weergave en selecteer bestand. Maak masker vanuit het menu. Gebruik de potloodtools om een regio van belang te tekenen binnen één weefseltype.
Sla dit bestand op en herhaal het voor eventuele andere gewenste regio's van belang of ROI's. Gebruik het ROI-bestand om het DWI-bestand te maskeren en bereken vervolgens het gemiddelde signaal binnen de ROI voor elke beeldvolume. Kopieer de eerste acht resultaten in een numeriek berekeningsprogramma zoals MATLAB als vector voor transversaal signaal, en
Overzicht
Dit protocol beschrijft het proces voor het verkrijgen van hoogwaardige diffusiewegde magnetische resonantie-imaging (DWI) van het ruggenmerg van de rat. De focus ligt op de niet-invasieve karakterisering van de weefselmicrostructuur via geoptimaliseerde MRI-technieken.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Medische Beeldvorming
- Ruggenmergonderzoek
Achtergrond
- Diffusiegewogen MRI is essentieel voor het beoordelen van de weefselmicrostructuur.
- Bestaande methoden maken vaak gebruik van ex vivo scanning, wat de klinische toepasbaarheid beperkt.
- Dit protocol heeft tot doel in vivo beeldvormingstechnieken te verbeteren.
- Inzicht in ruggenmergletsels kan leiden tot betere diagnostische en therapeutische strategieën.
Doel van de studie
- Om de weefselmicrostructuur in het ruggenmerg van de rat op een niet-invasieve manier te karakteriseren.
- Om MRI-sequenties en analysemethoden te optimaliseren voor artefactvrije beeldvorming.
- Om de klinische translatie van beeldvormingstechnieken voor ruggenmergletsels te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van de rat met anesthesie en respiratoire monitoring.
- Op maat gemaakte diffusie-gewogen MRI-scan met respiratoire gating.
- Correctie van susceptibiliteitsartefacten in de verkregen beelden.
- Wiskundige modellering van MRI-signalen om weefseleigenschappen te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle acquisitie van hoogwaardige DWI-beelden van het ruggenmerg.
- Effectieve artefactcorrectie leidend tot verbeterde beeldhelderheid.
- Aangetoonde mogelijkheid om parameters van de weefselmicrostructuur te vergelijken.
- Potentieel voor klinische toepassing bij het diagnosticeren van ruggenmergletsel.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor in vivo DWI-beeldvorming.
- Het vergroot het inzicht in ruggenmergletsels en het herstel daarvan.
- De techniek kan worden aangepast voor klinisch gebruik, waardoor de diagnostische mogelijkheden worden verbeterd.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directieleden
Niet-invasieve diffusiegewogen beeldvorming van het cervicale ruggenmerg bij ratten maakt een kwantitatieve beoordeling van de weefselmicrostructuur mogelijk, wat bijdraagt aan target-validatie en mechanisch de-risking in preklinische modellen van ruggenmergletsel. Deze benadering biedt voorspellend vertrouwen in de therapeutische effectiviteit door beeldvormingsbiomarkers te koppelen aan pathofysiologische veranderingen, wat helpt bij go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase. Het protocol verbetert de translationele continuïteit door klinisch relevante beeldvormings-eindpunten te genereren die kunnen worden aangepast voor diagnostisch en prognostisch gebruik in programma's voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door microstructurele veranderingen in de compartimenten van de witte en grijze stof te kwantificeren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologisch risicobeheer door longitudinale monitoring van de weefselintegriteit in ziektemodellen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door verbindingen te identificeren die diffusie-alteraties verminderen die geassocieerd zijn met mechanismen van secundaire schade.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door baseline-diffusieparameters in gezond weefsel vast te stellen.
- Kwantitatieve output: Genereertkaarten van diffusiviteit, kurtosis en anisotropie die dienen als reproduceerbare, multidimensionale readouts voor compound-screening.
- Schaalbaarheid van het platform: Maakt gestandaardiseerde imaging-workflows tussen laboratoria mogelijk door middel van respiratory gating en protocollen voor artefactcorrectie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Biedt een ziekterelevant systeem voor het monitoren van de progressie van letsel en het herstel in preklinische modellen van dwarslaesies.
- Afstemming van translationele biomarkers: Leid beeldbewerkingsbiomarkers af die correleren met histopathologische resultaten, wat de inspanningen voor de kwalificatie van biomarkers ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert preklinische go/no-go-beslissingen door het kwantificeren van het behoud of herstel van de microstructurele integriteit na een interventie.
Pijplijn- & workflowintegratie
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie tot preklinische ontwikkeling, en biedt op beeldvorming gebaseerde metrieken die de brug slaan tussen fenotypische screening en mechanistische analyse.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door een niet-invasieve, longitudinale beoordeling van de weefselmicrostructuur als reactie op farmacologische modulatie mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde DWI-acquisitie en post-processing-pipelines die reproduceerbaarheid garanderen over tijdspunten en behandelgroepen heen.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. axiale en radiale diffusiviteit, fractionele anisotropie) die vergelijking van microstructurele toestanden over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translational Research: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie door beeldvormings-eindpunten te genereren met directe klinische correlaten bij de beoordeling van ruggenmergletsels.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare beeldvormingscapaciteit voor CNS-portfolio-programma's die niet-invasieve structurele en microstructurele fenotypering vereisen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in target-engagement van het CZS en downstream pathofysiologische effecten te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via respiratory gating, susceptibiliteitscorrectie en ROI-gebaseerde kwantificering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van ineffectieve verbindingen mogelijk te maken, waardoor het risico op falen in een laat stadium door gebrek aan target-gemedieerd microstructureel effect wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door kandidaten te identificeren die behoud van de microstructuur van het ruggenmerg vertonen, wat consistent is met ziekte-modificerend potentieel.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de opstelling van MRI voor kleine dieren, anesthesiebeheer en systemen voor respiratoire gating.
- Is afhankelijk van toegang tot een MRI-systeem voor kleine dieren met een kleine boring, dat in staat is tot hoogresolutie diffusieweging en acquisities met meerdere b-waarden.
- Vereist standaardisatie tussen teams van beeldacquisitieprotocollen, procedures voor artefactcorrectie en ROI-definitie voor multicenterstudies.
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende knaagdiermodellen en letselgraden, met name wat betreft respiratoire stabiliteit en bewegingscontrole.
- Praktische beperkingen omvatten tijdbeperkingen voor de scan (~25 minuten per sessie) en de noodzaak van nauwkeurige thermische en fysiologische monitoring om de datakwaliteit te waarborgen.
